丹参SmIPI基因RNA干扰表达载体构建及遗传转化

[目的]构建丹参SmIPI1和SmIPI2基因的RNA干扰植株体系。[方法]利用Gateway技术分别构建SmIPI1和SmIPI2的干扰表达载体p K7GWIWG2D(Ⅱ),并借助根癌农杆菌EHA105菌株介导遗传转化,并通过抗性标记筛选、Egfp荧光和qRT-PCR检测阳性植株和转化效果。[结果]表达克隆构建后转化大肠杆菌菌液PCR检测显示阳性,遗传转化外植体并经抗性培养基继代筛选获得的转化植株根尖在荧光显微镜下呈强烈绿色荧光,且SmIPI1和SmIPI2基因的相对表达量下调幅度分别在64%~82%和23%~78%之间。[结论]成功构建丹参SmIPI1和SmIPI2基因的RNA干扰表达载体并转化丹参植株,为探索SmIPI基因家族成员各自功能问题提供了研究材料基础。     

加工番茄SlAGO4A基因过表达及干扰载体构建与遗传转化北大核心

[目的]构建加工番茄SlAGO4A基因过表达及干扰载体,获得相应的转基因番茄植株。[方法]利用PCR技术从番茄c DNA文库中获得2 727 bp的加工番茄SlAGO4A基因。构建SlAGO4A基因的过量表达载体35S:SlAGO4A。以获得的SlAGO4A基因为模板,获得了SlAGO4A PIWI的220 bp的片段,构建SlAGO4A基因的RNAi干扰载体RNAi-PIWI,通过农杆菌介导的遗传转化,获得SlAGO4A过表达及干扰转基因番茄阳性植株,并利用实时荧光定量PCR(QRTPCR)技术检测过表达番茄阳性植株中的SlAGO4A基因的表达水平。[结果]经PCR鉴定获得5株独立转化的里格87-5干扰转基因加工番茄株系,获得6株独立转化的里格87-5过量表达转基因加工番茄株系,其6株SlAGO4A基因过表达的阳性植株的表达量均有不同程度的上调。[结论]为阐明SlAGO4A基因在加工番茄抗病毒信号通路中的功能奠定基础。     

加工番茄SlAGO4A基因过表达及干扰载体构建与遗传转化

[目的]构建加工番茄SlAGO4A基因过表达及干扰载体,获得相应的转基因番茄植株。[方法]利用PCR技术从番茄c DNA文库中获得2 727 bp的加工番茄SlAGO4A基因。构建SlAGO4A基因的过量表达载体35S:SlAGO4A。以获得的SlAGO4A基因为模板,获得了SlAGO4A PIWI的220 bp的片段,构建SlAGO4A基因的RNAi干扰载体RNAi-PIWI,通过农杆菌介导的遗传转化,获得SlAGO4A过表达及干扰转基因番茄阳性植株,并利用实时荧光定量PCR(QRTPCR)技术检测过表达番茄阳性植株中的SlAGO4A基因的表达水平。[结果]经PCR鉴定获得5株独立转化的里格87-5干扰转基因加工番茄株系,获得6株独立转化的里格87-5过量表达转基因加工番茄株系,其6株SlAGO4A基因过表达的阳性植株的表达量均有不同程度的上调。[结论]为阐明SlAGO4A基因在加工番茄抗病毒信号通路中的功能奠定基础。     

大豆查尔酮还原酶基因CHR1的功能研究

为了验证查尔酮还原酶基因CHR1在大豆苷元合成中的作用, 文章克隆了CHR1基因并构建了RNA干扰表达载体pCPB-CHR1-RNAi, 将载体转化受体大豆品种“吉农28”中, 以期抑制CHR1基因的转录。通过农杆菌介导的遗传转化和PCR检测得到4株T₀ 代阳性植株, 13株T₁代阳性植株。Southern blotting结果表明, 功能元件以单拷贝的形式整合到大豆的基因组中。利用实时荧光定量PCR法(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)测定CHR1基因在mRNA水平上的表达量, 结果表明, 转基因大豆植株中CHR1的表达量与未转化的受体大豆相比降低了60%~99%; 高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC)检测到合成大豆苷元过程中的前体物质异甘草素的含量降低了38.7%。该RNA干扰机制在转录水平上抑制了CHR1基因的表达。     

发根农杆菌介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因RNA干扰载体的转化

目的：利用发根农杆菌ACCC10060介导丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶1基因（SmGGPS1）RNA干扰（RNAi）载体转化丹参叶片,生成SmGGPS1的RNAi转基因毛状根。方法：根据已克隆到的SmGGPS1特异区域设计并合成2段RNAi序列,分别插入RNAi双元载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）中,构建2个含卡那霉素（Kan）和绿色荧光蛋白（GFP）双筛选标记的植物表达载体pK7GWIWG2D（Ⅱ）-SmGGPS1-RNAi2和pK7GWIWG2D（Ⅱ）-SmGGPS1-RNAi3;利用带有上述2个RNAi载体的发根农杆菌ACCC10060侵染丹参叶片,诱导生成转基因毛状根;通过Kan抗性筛选和GFP绿色荧光观察统计转化率。结果：分别得到SmGGPS1-RNAi2和SmGGPS1-RNAi3转基因毛状根301根和399根,平均转化率为60.34%。结论：首次建立了发根农杆菌介导的外源基因转化丹参的体系。     

SUSD2基因干扰表达载体的构建及在A549细胞中鉴定北大核心

[目的]构建SUSD2基因短发夹RNA(shRNA)的表达载体,并在人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞中鉴定。[方法]设计合成SUSD2基因shRNA片段,连接到经Bam HⅠ和EcoRⅠ双酶切的psi-m H1 shRNA载体中,构建干扰表达载体psi-m H1-SUSD2 shRNA,酶切后测序鉴定;将干扰载体psi-m H1-SUSD2 shRNA转染A549细胞,荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot法检测干扰载体的干扰效率。[结果]酶切和测序结果显示成功构建了SUSD2基因shRNA的表达载体,q-PCR和Western Blot结果显示最佳干扰载体可使SUSD2 mRNA相对表达量下调75%以上,并可明显抑制A549细胞中SUSD2蛋白的表达。[结论]成功构建了SUSD2基因干扰表达载体,并在A549细胞中有效干扰SUSD2基因的表达。     

植物介导的RNA干扰南方根结线虫Mi-eft2基因的转基因番茄的研究

本研究构建了植物干扰南方根结线虫Mi-eft2基因的载体pBI-RNAi;建立了番茄再生体系和番茄农杆菌侵染后的再生体系;并利用该体系转化了对照空载体pBI121和干扰载体pBi-RNAi,经过卡那霉素抗性筛选和基因组DNA中报告基因及RNAi片段的PCR检测筛选,一共获得5株pBI121转化的阳性植株,获得9株p BI-RNAi转化的阳性植株。该研究为今后进行转基因植株介导的干扰线虫目的基因的表达,降低线虫侵染能力的研究奠定了基础。     

短发夹RNA载体稳定抑制端粒相关蛋白TERF2IP1表达的HCT116细胞的构建

目的:构建针对TERF2IP1基因的短发夹RNA(sh RNA)表达载体,在HCT116细胞中鉴定该载体对TERF2IP1基因的干扰效果。方法:设计针对TERF2IP1基因的sh RNA序列,将其克隆至p GPHI/Hygro载体中,瞬时转染HCT116细胞48 h后,用400 mg/m L的潮霉素筛选抗性克隆,获得阳性单克隆细胞株;分别提取细胞总RNA和蛋白,进行RT-PCR和Western印迹,检测TERF2IP1的表达水平。结果:构建了4对针对TERF2IP1基因的sh RNA表达载体,通过潮霉素筛选获得稳定干扰TERF2IP1基因的HCT116细胞系,实时定量PCR和Western印迹实验均证实潮霉素筛选后,HCT116细胞中TERF2IP1的表达水平明显降低。结论:构建了4对人TERF2IP1基因的sh RNA表达载体,获得4株分别针对TERF2IP1基因不同位点的稳定干扰HCT116细胞株。     

西瓜GGPS基因果实特异性表达载体构建与遗传转化

[目的]将牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)基因转化西瓜。[方法]利用RT-PCR技术克隆西瓜果实GGPS基因CDS区;构建由果实特异性启动子AGPL1调控GGPS基因、以nptⅡ为筛选标记基因的植物表达载体,并转入农杆菌EHA105;通过农杆菌介导法对西瓜品种"红一号"进行遗传转化。[结果]经过卡那霉素筛选和PCR初步鉴定,获得4株转基因阳性植株。[结论]构建了GGPS基因果实特异性表达载体,并将其转入西瓜品种"红一号"中,转化效率为0.13%。     

SUSD2基因干扰表达载体的构建及在A549细胞中鉴定

[目的]构建SUSD2基因短发夹RNA(shRNA)的表达载体,并在人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞中鉴定。[方法]设计合成SUSD2基因shRNA片段,连接到经Bam HⅠ和EcoRⅠ双酶切的psi-m H1 shRNA载体中,构建干扰表达载体psi-m H1-SUSD2 shRNA,酶切后测序鉴定;将干扰载体psi-m H1-SUSD2 shRNA转染A549细胞,荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot法检测干扰载体的干扰效率。[结果]酶切和测序结果显示成功构建了SUSD2基因shRNA的表达载体,q-PCR和Western Blot结果显示最佳干扰载体可使SUSD2 mRNA相对表达量下调75%以上,并可明显抑制A549细胞中SUSD2蛋白的表达。[结论]成功构建了SUSD2基因干扰表达载体,并在A549细胞中有效干扰SUSD2基因的表达。     

新型玉米种子生产技术表达载体的构建及遗传转化

本研究在GenBank中找到花粉育性恢复基因MS45、花粉致死基因ZmAA1、颜色筛选标记基因DsRed2及其特异性启动子和终止子序列,并在目的基因和植物表达载体pCAMBIA3300设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,扩增基因片段,双酶切目的片段及载体,回收后连接,构建表达载体pCAMBIA3300-MS45-DsRed2-ZmAAI,通过农杆菌介导的萌动胚遗传转化法将构建的表达载体转化到优良玉米自交系吉A001中,通过喷洒含5mg/L除草剂筛选得到397株草胺膦抗性植株,用PCR检测得到119株含有目的基因的阳性植株。结果表明,MS45-DsRed2-ZmAAI基因在玉米中得到表达。     

RNAi载体导入黄瓜的遗传转化体系北大核心CSCD

以黄瓜(Cucumis sativus)子叶和子叶节为外植体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法建立黄瓜遗传转化体系并进行优化,将南方根结线虫(Meloidogyme incognita)寄生相关基因的RNA干扰载体导入黄瓜,通过潮霉素(Hyg)浓度梯度筛选得到99株潮霉素抗性植株。经PCR和Southern-blot检测,获得10株目的基因以单拷贝形式整合的转基因黄瓜,子叶和子叶节的Southern-blot阳性率分别为13.9%和6.9%。该研究建立并优化了RNA干扰载体导入黄瓜的高效遗传转化体系,成功获得了转基因黄瓜植株。     

RNAi载体导入黄瓜的遗传转化体系

以黄瓜(Cucumis sativus)子叶和子叶节为外植体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法建立黄瓜遗传转化体系并进行优化,将南方根结线虫(Meloidogyme incognita)寄生相关基因的RNA干扰载体导入黄瓜,通过潮霉素(Hyg)浓度梯度筛选得到99株潮霉素抗性植株。经PCR和Southern-blot检测,获得10株目的基因以单拷贝形式整合的转基因黄瓜,子叶和子叶节的Southern-blot阳性率分别为13.9%和6.9%。该研究建立并优化了RNA干扰载体导入黄瓜的高效遗传转化体系,成功获得了转基因黄瓜植株。     

油菜BnCr4基因RNAi载体构建及植株转化

该实验构建了含甘蓝型油菜黄化相关基因BnCr4特异片段反向重复结构的RNA干扰(RNAi)载体pFGC5941-Cr4,通过根癌农杆菌介导转化油菜,获得47株抗Basta的抗性再生油菜植株,其中10株经PCR鉴定为阳性转基因植株.随机选取3株经鉴定的转基因阳性油菜植株进行半定量RT-PCR分析,结果显示,相对于非转基因的野生型油菜,3株转基因植株中BnCr4基因的表达量分别降低了78.5%、8.5%、11.8%,表明该干扰载体转入油菜能特异引起植株BnCr4基因表达量下降.     

一种具有G418抗性筛选标记的慢病毒RNA干扰表达载体的构建及应用

目的:构建具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体,并检测它对乙型肝炎病毒x基因(HBx mRNA表达的抑制作用。方法:从pcDNA3.0载体中扩增新霉素抗性基因并插入删除嘌呤霉素编码序列的pLKO载体中;将改构的RNA干扰载体包装成慢病毒后感染肝癌细胞HepG2,并检测感染细胞对G418的抵抗作用;为验证改构RNA干扰载体的有效性,设计了2条针对HBx的RNA干扰序列以及针对编码萤光素酶cDNA的干扰序列并插入该载体,将含新霉素筛选标记的HBx的RNA干扰载体与辅助质粒在293T细胞中包装成慢病毒并感染过表达HBx的HepG2(嘌呤霉素抗性)细胞,运用G418筛选出稳定混合克隆,提取细胞总RNA,运用RT-qPCR检测其在HepG2细胞中对HBx RNA表达的抑制作用。结果:构建的载体与辅助质粒包装出的慢病毒感染肝癌细胞后,细胞获得G418抗性;HBx RNA干扰序列克隆入该载体可有效抑制肝癌细胞中过量表达的HBx mRNA。结论:构建了具有新霉素抗性筛选标记的RNA干扰慢病毒表达载体,运用该载体可有效筛选出抑制目的基因表达的G418抗性的稳定细胞株。     

茎尖法转基因棉花植株真实性鉴定方法探究

棉花茎尖转化法具备不受基因型限制、转化周期短的优点,是理想的棉花转化体系,但据报道其所获得的转基因植株普遍存在遗传不稳定、高代植株基因丢失的现象。以陆地棉TM?1品种为受体材料,利用茎尖转化法将DsRed2载体转入棉花,经卡那霉素筛选获得16株抗性植株,进一步PCR扩增靶基因,获得6株DsRed2基因片段PCR检测为阳性的植株,初步判断该6株为茎尖转化法获得的转基因植株,但经紫外照射,6个转基因植株均未检测到红色荧光。对其进行靶基因RT?PCR,发现DsRed2基因在6个转基因植株中仅有极低量的表达或无表达。进一步对DsRed2载体的非T?DNA片段,即载体骨架部分进行PCR以及植株内生菌培养检测,结果表明,6个转基因植株均含有完整的DsRed2载体,植株可培养出含有完整载体的内生菌,且内生菌经农杆菌16S核糖体RNA（16S rRNA）片段PCR检测结果为阳性,推测由于茎尖侵染形成农杆菌与植株共生关系,造成假阳性株的现象,进而导致高代转基因植株基因丢失、遗传不稳定的现象。旨在建立一套完整的茎尖法转基因棉花植株真实性的鉴定方法,为进一步深入研究提供参考依据。     

小麦Vp-1基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

小麦成熟期穗发芽是世界性的自然灾害,严重影响小麦的产量和品质.Viviparous-1(Vp-1)是促进胚成熟和休眠的主要转录调节因子,与小麦穗发芽抗性有着密切的关系.本实验根据小麦Vp-1基因序列,以植物表达载体pAHC25为基础,成功构建了含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WVpRi.采用基因枪法轰击小麦品种新春9号幼胚材料1825个,共获得34株T0再生植株.利用Bar基因引物和干扰片段特异引物对再生植株进行PCR检测,获得Bar基因和干扰片段均为阳性的植株3株,转化率为0.16%.本研究为深入分析Vp-1基因功能,进而通过分子育种进行小麦穗发芽抗性的遗传改良提供了科学依据.     

利用pmi标记基因筛选培育转EaDREB2B基因甘蔗

利用已构建的植物表达载体prd29a-dreb-hyg,通过酶切连接到含有磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）的表达质粒pZMLR14上,构建植物表达载体pDREB-PMI。利用基因枪轰击转化甘蔗愈伤,经过甘露糖筛选,共获51株抗性苗,转化再生频率为4.25%。对转基因植株进行分子检测,结果表明有8株为阳性转基因无性系。氯酚红试验表明标记磷酸甘露糖异构酶基因在转基因株系中均有表达。对转基因T₁代甘蔗植株进行分子检测,结果表明EaDREB2B基因在转基因甘蔗无性系T₁代中稳定遗传。该结果为进一步研究EaDREB2B基因在甘蔗抗旱方面的作用奠定了基础。     

玉米淀粉分支酶SBEⅡb基因RNA干涉表达载体的构建和转化

应用聚合酶链式方应技术扩增玉米淀粉分支酶第20外显子155 bp的基因片段,并将其正向和反向克隆到pUCCRNA i载体上。利用pHMW.GUS与pCAMB IA1300作为桥梁载体,构建了含胚乳特异启动子和潮霉素筛选基因的RNA干涉表达载体pCAMB IA1300 HMW 2F。通过三亲杂交将pCAMB IA1300 HMW 2F表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404,对玉米自交系178进行遗传转化,通过抗性筛选和PCR检测,获得了4株PCR阳性苗。     

FMDV vp1基因在烟草中表达及转基因烟草的免疫效果

通过三亲杂交法,构建克隆有阿克苏(Akesu/58) O 型口蹄疫病毒vp1 基因的双元表达载体pBin FMDVVP1。采用农杆菌介导法转化NC89烟草叶盘,经卡那霉素筛选,共获得49株抗性植株。对抗性植株总DNA进行目的基因的PCR检测,有40株阳性植株。对阳性植株总RNA进行目的基因的RT PCR检测,有21株阳性植株。将7株ELISA和Western blot检测阳性植株叶片提取物分别与弗氏佐剂乳化,在0、15、30 和45d 腹膜腔接种Balb/C小白鼠,于第4次免疫后第9d进行血清抗体检测;第12d用104SM50 LD的同源强毒进行攻击;攻毒后24h采血,通过乳鼠病毒血症试验判定攻击Balb/C小白鼠的发病和保护情况。结果表明:双元表达载体pBin FMDVVP1构建正确;vp1基因转入NC89烟草并获得表达;7组中有2组Balb/C小白鼠血清抗体呈阳性,攻毒保护率分别为100%和63%。证明2株转基因烟草表达的VP1蛋白具有较好的免疫原性,所免疫的2 组Balb/C小白鼠对同源强毒攻击有一定的抵抗能力。