细胞和分子技术在甘薯茎线虫病抗病育种中的应用

甘薯茎线虫病是我国北方甘薯薯区的重要病害之一。为进一步研究甘薯茎线虫病育种中线虫和甘薯的抗感关系,利用细胞培养技术建立发根农杆菌转化甘薯发根,用该发根培养马铃薯腐烂线虫,构建植物寄生线虫培养和抗性鉴定的技术平台;用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分子标记技术筛选甘薯茎线虫病抗感品种的分子标记,并对发根培养马铃薯腐烂线虫体系和分子标记辅助选择抗甘薯茎线虫病品种技术进行了展望。     

基于MaxEnt模型的腐烂茎线虫在内蒙古地区适生区预测

【目的】为保障马铃薯产业健康发展,加强腐烂茎线虫的检疫防控工作,对其在内蒙古地区的适生区进行预测分析。【方法】根据腐烂茎线虫在我国最新的分布和环境数据,通过MaxEnt生态位模型和ArcGIS软件,预测当前和未来气候条件下腐烂茎线虫在内蒙古地区的适生区。【结果】MaxEnt模型的AUC平均值为0.929,预测结果准确可靠。预测结果显示:当前气候条件下腐烂茎线虫在内蒙古地区的适生区面积为41.8万km²,占全区面积的35.31%。研究表明,在2021—2040年和2041—2060年,腐烂茎线虫在内蒙古地区的总适生区面积将不断扩大;其中在SSP1_2.6气候情景下,在赤峰市、通辽市和兴安盟将出现腐烂茎线虫的高适生区;在SSP3_7.0气候情景下,在鄂尔多斯市、赤峰市、通辽市将出现腐烂茎线虫高适生区。利用Jackknife刀切法计算得到影响腐烂茎线虫分布的主导环境因子为温度季节性变化方差、最湿月降雨量、最冷季平均温、昼夜温差月均温、最湿季平均温。【结论】腐烂茎线虫在内蒙古地区有进一步扩散的风险,建议在未来气候情景下出现腐烂茎线虫高度适生区的盟市,应加强调运检疫和疫情监测,防止腐烂茎线虫进一步扩散。     

红车轴草中(6aR,11aR)-三叶豆紫檀苷对马铃薯腐烂茎线虫的麻醉活性研究

从红车轴草(Trifolium pratense L.)根乙醇提取物中分离得到了黄酮苷类化合物(6aR,11aR)-三叶豆紫檀苷,并运用核磁共振波谱学技术鉴定了其化学结构。采用实验室活体生物试验方法,研究了(6aR,11aR)-三叶豆紫檀苷对马铃薯腐烂茎线虫的麻醉活性。结果表明,该化合物对马铃薯腐烂茎线虫二龄幼虫有一定的麻醉活性,麻醉作用的强度与其浓度及作用时间密切相关。     

马铃薯腐烂茎线虫谷胱甘肽过氧化物酶基因(Dd-Gpx)的克隆与原核表达

旨在研究植物寄生线虫谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)的结构和功能,通过RACE技术克隆了马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)Gpx基因,并成功克隆到p ET-41b载体上进行融合表达。结果表明,该基因c NDA全长950 bp,含有1个681 bp的开放阅读框,共编码226个氨基酸。生物信息学分析显示,该蛋白N端有明显信号肽,属于分泌蛋白。将其克隆到p ET-41b载体在BL21(DE3)中进行原核表达,结果显示,在60 k D处有一条明显的带。经质谱鉴定,此条带有7个肽段与马铃薯腐烂茎线虫GPX匹配。表明重组Dd-GPX蛋白表达成功。     

腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor Thorne,1945)生物学研究进展

腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor Thorne,1945)是世界上重要的植物病原线虫和我国全国农业植物检疫性有害生物,为害甘薯、马铃薯、大蒜等多种地下结实作物,在许多杂草和真菌上也能生长和繁殖.腐烂茎线虫喜凉怕热、喜湿怕干,主要通过寄主作物的无性繁殖材料传播和扩散.在不同作物上,它的田间持续存活...     

马铃薯腐烂茎线虫L 型半胱氨酸蛋白酶新基因(Dd-cpl-1) 的克隆与序列分析

L型半胱氨酸蛋白酶基因 (Cathepsin L-like cysteine proteinase gene) 为与植物寄生线虫寄生能力相关的多功能基因。运用RT-PCR和RACE的方法从马铃薯腐烂茎线虫Ditylenchus destructor中克隆出1个L型半胱氨酸蛋白酶新基因Dd-cpl-1 (GenBank登录号为GQ180107)。该基因Dd-cpl-1 cDNA全长序列含有1个1 131 bp的开放性阅读框 (ORF),编码376个氨基酸残基,其5′末端及3′末端分别含有29 bp和159 bp的非编码区 (UTR)。Dd-cpl-1内含子外显子结构分析结果表明,其基因组序列包含7个内含子,且各内含子两端剪接位点序列遵守GT/AG规则。Dd-cpl-1基因推定的蛋白Dd-CPL-1与松材线虫L型半胱氨酸蛋白酶高度同源,一致性达到77％。以不同物种中L 型半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列进行比对分析,推测推定的蛋白 Dd-CPL-1含有L型半胱氨酸蛋白酶基因家族高度保守的催化三联体 (Cys183,His322 和Asn343) 以及ERFNIN基系和GNFD基系。半胱氨酸蛋白酶系统发育分析表明,Dd-cpl-1 属于由L型半胱氨酸蛋白酶组成的进化分支。Dd-cpl-1的这些序列特征进一步表明其为L型半胱氨酸蛋白酶基因。这是首次在马铃薯腐烂茎线虫中克隆到的L型半胱氨酸蛋白酶,为今后在蛋白水平对其进行进一步的功能分析提供基础。     

甘薯、胡萝卜发根单寄主培养体系繁殖马铃薯腐烂线虫的研究

利用发根农杆菌A4转化甘薯品种徐薯18和胡萝卜品种天红2号的发根,建立甘薯茎线虫病病原线虫(马铃薯腐烂线虫)的单寄主培养体系。通过该体系对马铃薯腐烂线虫的行为进行观察以及繁殖情况进行调查。结果表明:(1)马铃薯腐烂线虫在甘薯和胡萝卜发根上都能正常发育和繁殖,完成其生活周期;(2)培养4周和8周后,在甘薯发根上线虫繁殖倍数分别为2.6和50.6倍;在胡萝卜发根上线虫繁殖倍数分别为1.7和9.9倍;相同培养时间内,线虫在甘薯发根上的繁殖数极显著高于在胡萝卜发根上的繁殖数。(3)利用发根系统繁殖马铃薯腐烂线虫,便于研究其行为,在显微镜下可以直接观察到线虫在发根上活动情况,这对研究发根和线虫相互关系十分有利。基于上述结果,初步证实构建甘薯发根单寄主培养体系繁殖马铃薯腐烂线虫是可行的,且优于胡萝卜发根繁殖马铃薯腐烂线虫体系。     

Study of the behavioral responses of Odoiporus longicollis to volatiles from banana pseudostems with different physiological status

采用固相微萃取技术提取新鲜假茎、腐烂未虫蛀假茎、虫蛀且腐烂假茎以及虫蛀未腐烂假茎4种生理状态的香蕉假茎挥发物,进行气质联用仪分析鉴定.结果表明:从香蕉新鲜假茎与虫蛀且腐烂假茎中分别鉴定出10种挥发性物质;腐烂未虫蛀假茎与虫蛀未腐烂假茎分别鉴定出11种挥发性物质;这些挥发物包括烃类、酯类、酮类、杂环类等,在不同生理状态的香蕉假茎中的相对含量各不相同.4种生理状态的香蕉假茎挥发性成分种类数及相对含量的变化与香蕉假茎象甲Odoiporus longicollis Olivier的为害有着密切关系,遭受香蕉徦茎象甲为害的香蕉假茎,其共同成分2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯相对含量对应地减少.利用双重陷阱嗅觉仪测定了香蕉假茎象甲对香蕉假茎挥发物的行为反应,结果表明:4种生理状态的香蕉假茎挥发物均对香蕉假茎象甲有引诱作用,与新鲜假茎相比,香蕉假茎的虫蛀且腐烂状态可增强其对香蕉假茎象甲雌、雄虫的引诱作用.     

香蕉假茎象甲对不同生理状态香蕉假茎挥发物的行为反应

采用固相微萃取技术提取新鲜假茎、腐烂未虫蛀假茎、虫蛀且腐烂假茎以及虫蛀未腐烂假茎4种生理状态的香蕉假茎挥发物,进行气质联用仪分析鉴定。结果表明:从香蕉新鲜假茎与虫蛀且腐烂假茎中分别鉴定出10种挥发性物质;腐烂未虫蛀假茎与虫蛀未腐烂假茎分别鉴定出11种挥发性物质;这些挥发物包括烃类、酯类、酮类、杂环类等,在不同生理状态的香蕉假茎中的相对含量各不相同。4种生理状态的香蕉假茎挥发性成分种类数及相对含量的变化与香蕉假茎象甲Odoiporus longicollis Olivier的为害有着密切关系,遭受香蕉徦茎象甲为害的香蕉假茎,其共同成分2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯相对含量对应地减少。利用双重陷阱嗅觉仪测定了香蕉假茎象甲对香蕉假茎挥发物的行为反应,结果表明:4种生理状态的香蕉假茎挥发物均对香蕉假茎象甲有引诱作用,与新鲜假茎相比,香蕉假茎的虫蛀且腐烂状态可增强其对香蕉假茎象甲雌、雄虫的引诱作用。     

不同基因型腐烂茎线虫群体杂交后代分子特征比较

为了明确不同基因型腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)是否具有生殖隔离及杂交后代的变异程度,选用1条3-4龄幼虫与5条雄虫,将不同基因型群体进行生物学杂交,对F1代数量、ITS-rDNA序列及其二级结构比对分析.结果表明,杂交产生F1代数量普遍较少,不同基因型杂交组合F1代线虫数量≤6条/处理,部...     

甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶基因Dd-ace-2全长cDNA的克隆和序列分析

利用RT-PCR、RACE技术克隆了甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)乙酰胆碱酯酶基因(Dd-ace-2) cDNA (GenBank 登录号EF583058), 用DNAMAN5.0、MEGA3.0进行了序列分析。克隆的Dd-ace-2 基因cDNA全长2425 bp, 包含一个2205 bp的开放阅读框, 编码734个氨基酸。Dd-ace-2基因推导的氨基酸序列与南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)和动物寄生线虫胎生网尾线虫(Dictyocaulus viviparous)ace-2的氨基酸序列同源性分别达48.0%、42.7%和42.1%。在推导的734个氨基酸残基的前体蛋白中, 前面的701个氨基酸残基是成熟的乙酰胆碱酯酶序列, 其预测的分子量为79240.38 D。在一级结构中, 形成催化活性中心的3个氨基酸残基(Ser291, Glu442和His574)、胆碱结合位点Trp(177), 以及在亚基内形成二硫键的6个半胱氨酸完全保守; 在电鳐乙酰胆碱酯酶分子的催化功能域中存在14个保守的芳香族氨基酸残基, 其中10个在甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶中完全保守。与其它线虫和物种乙酰胆碱酯酶的聚类分析显示, 甘薯茎线虫的乙酰胆碱酯酶与其它线虫乙酰胆碱酯酶ACE-2同属一个支系。     

一种加工型马铃薯品种的农杆菌转化体系研究

大西洋马铃薯是经济价值很高的炸片型加工品种,逆境胁迫下,易产生褐变、空心等问题,影响加工品质。为获取抗逆境胁迫的优质转基因新品种,采用根癌农杆菌介导法,以大西洋马铃薯的茎段为外植体,建立了快速,简便,高效的遗传转化体系。从共培养到转化植株获得只需7-8周,转化频率达80%。结果表明茎段是较好的转化受体,硫代硫酸银可以有效促进不定芽分化并提高再生频率。PCR、Southern杂交分析证明外源基因已经成功整合到马铃薯再生植株的基因组中。该转化体系为大量开发转基因马铃薯植株,进而筛选优质的马铃薯炸片加工型新品种奠定基础。     

不同浓度6-BA及KT对马铃薯无菌苗诱导的影响

以‘高原7 号’马铃薯茎尖为外植体,用0.1%升汞和75%酒精消毒,经组织培养获得脱毒马铃薯茎段,在增殖培养中,研究不同浓度6-BA 及KT 对马铃薯茎段诱导增殖效果的影响。结果表明：用0.1%升汞对茎尖消毒8 min 效果最好,灭菌率达96.67%。细胞分裂素对马铃薯茎段增殖的促进作用为6-BA>KT,以1.5 mg/L 6-BA 诱导不定芽及其生长势效果最佳。     

Optimization of genetic transformation system of potato and introduction of maize starch branching enzyme gene SBEⅡb into potatoFAN

以马铃薯脱毒试管苗茎段为转化受体材料,建立并优化了农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系.通过农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因(Starch branching enzyme b,SBEⅡb)的过表达载体转化马铃薯,接种762个茎段,共获得35株抗性植株.经PCR检测获得了4株转基因阳性植株;对转基因植株进一步进行GUS活性组织化学染色,发现转基因植株的茎段与试管薯均被染上蓝色,表明外源SBEⅡb基因已整合到马铃薯基因组,且正常表达.     

山萘杀线虫活性成分的分离及鉴定

采用超声波提取法,用甲醇作溶剂对山萘进行粗提,分别测定了山萘提取物对松材线虫和南方根结线虫的毒性,结果显示,1 000 mg/L山萘甲醇粗提取物处理松材线虫和南方根结线虫,24 h校正死亡率均达到100%.采用活性追踪和柱层析法,以5种植物病原线虫为对象,提取、分离、纯化出山萘根中的活性成分,结果显示,在正己烷萃取组分中,得到活性较高的化合物A、B;用化合物A处理南方根结线虫、松材线虫、马铃薯腐烂茎线虫、海南根结线虫、象耳豆根结线虫72 h后,其LC50分别为17.79、29.70、43.21、57.64和36.94 mg/L;用化合物B处理72 h后LC50分别为1.49、2.81、10.09、26.67和14.47 mg/L.化合物A和B经1H-NMR、13C-NMR、GC-MS分析鉴定表明,A为肉桂酸乙酯,B为对甲氧基肉桂酸乙酯.     

PEG模拟干旱胁迫下马铃薯茎段转录组分析

该研究以‘青薯9号’马铃薯无菌苗为材料,采用转录组测序技术分析模拟干旱胁迫下马铃薯茎段的差异表达,探究茎段在干旱胁迫下的分子机制。结果表明:(1)不同程度干旱胁迫下,马铃薯叶片脯氨酸、可溶性糖以及可溶性蛋白含量明显增加;马铃薯茎段差异表达基因下调的数量均多于上调,其中3种处理条件下共有的差异表达基因有657个。(2)GO富集分析表明,马铃薯茎段差异表达基因主要集中在氧化还原过程、激素响应、氧化还原酶活性以及糖基水解酶活性;Pathway富集分析表明,马铃薯茎段差异表达基因主要集中在植物激素信号转导、苯丙酸生物合成、玉米素生物合成、苯丙氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢以及次生代谢产物的生物合成。(3)实时荧光定量PCR验证结果表明,6个差异表达基因在不同程度干旱胁迫中的差异表达与转录组分析的结果基本一致,证明转录组数据的可靠性。该结果对进一步研究马铃薯干旱胁迫响应机制有一定参考价值,也丰富了马铃薯抗旱育种的基因资源。     

茎瘤芥(榨菜)瘤茎形状的遗传研究

利用瘤茎形状有较大差异的4个茎瘤芥(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee)自交系作为亲本配置了2个杂交组合,并以瘤茎形状指数作为度量指标,应用主基因+多基因混合遗传模型对其衍生后代家系群体P1、P2、F1、B1、B2和F2瘤茎形状进行了多世代联合遗传分析。杂交组合y203×b145的瘤茎形状受2对加性-显性-上位性主基因控制,其遗传率在B1、B2和F2群体中分别为59.89%、26.18%和54.14%;而瘤茎形状在杂交组合y92×b146中受2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因控制,在B1、B2和F2家系群体中,其主基因遗传率分别为22.44%、58.06%和63.14%,多基因遗传率分别为40.42%、4.36%和1.26%。这些结果表明,对瘤茎形状改良时要以主基因利用为主,且宜在中高世代选择。     

马铃薯根结线虫抗性基因的电子克隆与序列分析

近年来,马铃薯受根结线虫的危害日益严重,造成减产、植株萎蔫、影响其商品性,并使其很容易受其他土传病害侵染。而不同马铃薯材料对根结线虫抗病性存在明显差异。因此,从分子角度挖掘和利用其本身所具备的抗病基因变得尤为重要。本研究采用电子克隆技术,搜索马铃薯EST数据库,拼接获得28 714条重叠群(contigs),以番茄、辣椒中已经克隆的根结线虫抗性基因作为探针,与所拼接的contigs进行比对及序列分析,共获得2条马铃薯根结线虫抗性基因的c DNA序列(contig_5164,contig_12247)。进一步采用生物信息学方法,对所得2条抗性基因序列进行了氨基酸组成和亲缘关系的分析。结果显示,contig_5164总长1 191 bp,推测编码206个氨基酸,等电点为4.77。Contig_12247总长892 bp,推测编码114个氨基酸,等电点为4.24。氨基酸组成均以亮氨酸最多,谷氨酸其次。两基因与番茄亲缘关系最近。随后对拼接所得contigs进行功能注释和GO分类,完成了对马铃薯中5类抗病保守结构域基因的挖掘。本研究的结果可为马铃薯根结线虫抗性基因进一步的研究与应用以及开发利用马铃薯抗性资源奠定基础。     

几种替代杀线剂对甘薯茎线虫的毒力与活性

采用熏蒸法和浸渍法测定了4种土壤熏蒸杀线剂和6种非熏蒸杀线剂对甘薯茎线虫的毒力,在此基础上以各药剂的致死中浓度剂量处理线虫,设置不同时间处理,观察了药剂对线虫的活性动态变化.结果表明： 熏蒸杀线剂棉隆、1,3-二氯丙烯、威百亩、氯化苦对甘薯茎线虫的LC₅₀依次为0.49、0.89、0.91、3.60 mg·L^-1,非熏蒸杀线剂甲维盐、阿维菌素、灭线磷、噻唑膦、涕灭威、丁硫克百威对甘薯茎线虫的LC₅₀依次为31.2、48.1、224.3、288.4、632.3、823.9 mg·L^-1.致死中浓度处理线虫后,各药剂校正死亡率随处理时间延长有不同幅度升高,棉隆、1,3-二氯丙烯、阿维菌素和甲维盐对线虫有较高的持续抑制效果,处理48 h脱离药剂处理后校正死亡率没有降低,而传统杀线剂品种灭线磷和涕灭威处理均出现线虫明显复苏的现象.表明棉隆、1,3-二氯丙烯、阿维菌素和甲维盐可以替代传统杀线剂应用于甘薯茎线虫的防治.     

农杆菌介导白藜芦醇合酶基因转化蔓茎堇菜的研究

目的:通过农杆菌介导法将白藜芦醇合酶基因转化蔓茎堇菜,并对转化条件进行优化.方法:以蔓茎堇菜叶柄为受体材料,采用叶盘法进行遗传转化,实验过程中对影响转化的一些主要因素进行筛选研究.结果:最佳的侵染条件为OD6000.3的菌液侵染10min,头孢霉素的适宜浓度为250mg/L.转化后的蔓茎堇菜外植体经3.0mg/L潮霉素筛选,最终得到9株抗性再生苗,转化频率为0.98%.结论:该研究为建立一个农杆菌介导白藜芦醇合酶基因转化蔓茎堇菜的遗传体系提供了基础.