类似S-层蛋白的苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白基因的克隆

芽胞杆菌CTC菌被鉴定为苏云金芽胞杆菌,鞭毛血清型H2,幕虫亚种;产生卵圆形伴胞晶体,伴胞晶体蛋白为100kD;测定了该蛋白 N－末端序列,该序列与炭疽芽胞杆菌的细胞表面S－层蛋白具92－93％相似性,根据Southern杂交制作了该晶体蛋白基因ctc所在位置的限制性酶切图谱,分别克隆了该基因5’和3’端所在2．9kb XbaI片段和3．1kb Cla I DNA片段,彼此间具0．6kb重叠,通过拼接获得含完整ctc基因的克隆,含该基因的大肠杆菌与表达S－层蛋白的大肠杆菌具相似生长特征,初步表明CTC菌株的伴胞晶体由细胞表面S－层蛋白组成,苏云金芽胞杆菌区别于蜡状芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌的唯一标准是能形成伴胞晶体,由于S－层是细胞表面的结构成分,本文对CTC菌株鉴定为苏云金芽胞杆菌以及伴胞晶体作为苏云金芽胞杆菌鉴别的唯一标准提出了质疑。     

苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白可以形成伴胞晶体

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)CTC菌株产生卵圆形伴胞晶体,晶体蛋白分子量为100kD;透射电子显微镜观察结果表明该菌株有S—层结构,而且在母细胞内可以形成伴胞晶体和S—层的初体结构;其蛋白基因导入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,扫描电子显微镜观察结果表明转化子能形成晶体,而其形状与CTC菌株的相同;转化子晶体蛋白的分子量大小也与CTC菌株的相同,为100kD。以上实验结果结合以前晶体蛋白N—末端测序和基因核苦酸序列,表明苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S—层蛋白可以形成伴胞晶体。     

苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白可以形成伴胞晶体

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)CTC菌株产生卵圆形伴胞晶体,晶体蛋白分子量为100kD;透射电子显微镜观察结果表明该菌株有S层结构,而且在母细胞内可以形成伴胞晶体和S层的初体结构;其蛋白基因导入苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,扫描电子显微镜观察结果表明转化子能形成晶体,而其形状与CTC菌株的相同;转化子晶体蛋白的分子量大小也与CTC菌株的相同,为100kD。以上实验结果结合以前晶体蛋白N末端测序和基因核苷酸序列,表明苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S层蛋白可以形成伴胞晶体。     

苏云金芽胞杆菌杀线虫伴胞晶体蛋白基因cry6Aa的克隆与表达

通过对晶体蛋白N-末端氨基酸测序,设计简并探针,从对根结线虫高毒力苏云金芽胞杆菌YBT-1518菌株中克隆到1个含有杀线虫晶体蛋白基因的片段。序列测定表明该序列含有两个ORF(orf1和orf2),其中orf1与基因cry6Aa1同源性为98%,已在GenBank上登录(Acc.NO.AF499736),并被命名为cry6Aa2。将克隆的该片段克隆到穿梭载体pHT304上,并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株可形成米粒状伴胞晶体。生物测定表明,表达的毒素蛋白对北方根结线虫的LC50为9.47μg/mL,毒力与出发菌株(10.74μg/mL)相当。     

苏云金芽胞杆菌spoIIID基因缺失突变株的特点

摘要：【目的】构建苏云金芽胞杆菌spoIIID基因缺失突变株,并研究其与出发菌株的表型及性质差异。【方法】采用基因同源重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌HD-73菌株中的spoIIID基因,构建了spoIIID缺失突变株,测定生长曲线,并通过扫描电子显微镜观察,芽胞计数分析及SDS-PAGE 蛋白电泳比较突变株与出发菌株的差异。构建遗传互补菌株,观察菌株性状的回复情况。【结果】通过温敏载体同源重组敲除技术获得了苏云金芽胞杆菌HD-73菌株spoIIID基因缺失突变株,生长曲线测定表明,突变株较出发菌株在平稳期后期生长较缓和;扫描电子显微镜观察和芽胞计数分析显示,突变株基本丧失了形成芽胞的能力,但依然形成晶体。SDS-PAGE结果显示,在 SSM培养基中,突变株对伴胞晶体蛋白的形成量影响并不显著;在营养较富集的Luria-Bertani培养基中,突变株中伴胞晶体蛋白的形成量较野生型和互补株明显降低。利用载体pHT315携带spoIIID操纵子互补突变株,互补株恢复了产生晶体和芽胞的能力。【结论】本研究证明spoIIID基因是苏云金芽胞杆菌芽胞形成所必需,同时与晶体蛋白的表达相关。     

苏云金芽胞杆菌cryⅡ基因的克隆和表达

分离的苏云金芽胞杆菌(Bacillus-thuringiensis)YBT-791对鳞翅目小菜蛾(Plutellaxylostella)有毒力,将其质粒DNA提纯,经HindⅢ酶切后与杀虫晶体蛋白cryⅡ基因探针杂交,显示出分子量分别为5kb和9．4kb两条DNA阳性片段。把5kb的DNA阳性片段克隆到pUCl8的HindⅢ位点上并转化大肠杆菌TGl,经酶切和杂交检测,证明斑点杂交阳性克隆子中含有5kb的cryI片段。把这个含cryⅡ基因的5kbHindⅢ片段进行亚克隆,将4kb的BamHI－Pstl酶切片段插入穿梭载体pXl61中,并用电脉冲法克隆于苏云金杆菌不产伴胞晶体的突变株中,得到产生单一cry Ⅱ基因编码的杀虫晶体蛋白的克隆菌株M一5。经电镜观察,该克隆菌株能形成出发菌YBT－791多种形态伴胞晶体中的一种方形伴胞晶体;经免疫双扩试验,它只能与Cry Ⅱ晶体蛋白抗血清形成沉淀线;经SDS—PAGE电泳,克隆菌的伴胞晶体只含有一种65kDa的晶体蛋白。生物测定结果表明它既对鳞翅目小菜蛾(Piutella xylostella)有毒性,又对双翅目致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)有毒性。     

四川盆地生态区苏云金芽胞杆菌cry基因的鉴定及新型模式cry基因的克隆

[目的]为了明确四川盆地生态区土壤中苏云金芽胞杆菌cry,基因资源情况,进一步克隆出新型的杀虫晶体蛋白基因.[方法]本研究主要通过菌株晶体形状的光学显微镜及扫描电镜观察、PCR-RFLP技术鉴定cry基因型法、杀虫晶体蛋白的SDS-PAGE分析和菌株生物活性测定等方法对此地区菌株进行研究.[结果]从四川盆地不同生态区采集2650份土壤样品中分离了791株苏云金芽胞杆菌.PCR-RFLP鉴定结果表明:此地区的苏云金芽胞杆菌主要含有cry1,cry2,cry3,cry4/10,cry9,cry30和cry40等7种cry,基因类型;含cry1基因的菌株最丰富,共有21种不同cry1型基因组合;从中发现了新型模式基因,并采用Tail-PCR技术获得了其中3个基因的全长序列,被国际苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry54Aa1、cry30Fa1和cry30Ga1.通过生物活性测定,发现对鳞翅目和双翅目害虫具毒力的菌株.未鉴定出基因型的80个菌株的伴胞晶体SDS-PAGE分析表明:这些菌株均有40～130 kDa蛋白表达,极有可能含新型的杀虫蛋白基因.[结论]研究结果充分体现了四川盆地生态区苏云金芽胞杆菌资源的多样性及特殊性,所蕴含的杀虫蛋白基因在农业生产上具有重要意义和应用前景.     

苏云金芽胞杆菌cry26Aa和cry28Aa基因共表达可在芽胞外壁内侧形成伴胞晶体

苏云金芽胞杆菌幕虫亚种的伴胞晶体在预芽胞外壁内侧形成,呈现晶体芽胞粘连的现象。根据已发表的cry26Aa1和cry28Aa1基因序列设计引物,从苏云金芽胞杆菌幕虫亚种T02中扩增得到cry26Aa和cry28Aa基因,通过穿梭载体将这两个基因分别和同时转化到苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,透射电镜下可在芽胞外壁内侧和外侧同时观察到伴胞晶体,而单独表达时可在芽胞外壁外侧观察到伴胞晶体。结果表明,伴胞晶体在芽胞外壁内侧表达不单独依赖于启动子的时空调控,可能还受到晶体蛋白相互作用的影响。     

苏云金芽胞杆菌sigK 基因插入失活突变体的特点及其对cry3A基因启动子活性的影响

摘要: 【目的】构建苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt) sigK 基因插入失活突变体,分析突变体特点并明确其对cry3A 基因启动子的影响。【方法】采用同源重组技术在苏云金芽胞杆菌HD-73 菌株sigK 基因中插入卡那霉素抗性基因,构建了sigK 基因插入失活突变体。通过生长曲线测定、扫描电子显微镜观察晶体、芽胞形成情况和芽胞计数及SDS-PAGE 等方法分析了突变体的特点; 构建了遗传恢复菌株对上述性状进行了功能验证; 利用启动子融合lacZ 技术检测了cry3A 基因启动子的转录活性。【结果】获得了苏云金芽胞杆菌HD-73 菌株sigK 基因突变体,生长曲线测定表明,突变体较出发菌株在稳定期后期生长较慢; 扫描电子显微镜观察和芽胞计数分析显示,突变体丧失了形成芽胞和晶体的能力; SDS-PAGE 分析表明突变体中伴胞晶体蛋白的表达量明显低于出发菌株和恢复菌株。利用载体pHT315 携带sigK 基因及其启动子在突变株中表达,所获得的遗传恢复菌株恢复了突变株产生芽胞和晶体的能力; sigK 基因的突变可以提高cry3A 基因启动子在产胞后期的转录活性,对cry3A 启动子指导的Cry 蛋白表达量没有显著影响。【结论】本研究证明sigK 基因为苏云金芽胞杆菌芽胞形成所必需,并影响伴胞晶体蛋白的产量; sigK 基因功能的丧失有利于cry3A 基因启动子在产胞后期的转录。     

苏云金芽胞杆菌cry26Aa和cry28Aa基因共表达可在芽胞外壁内侧形成伴胞晶体

苏云金芽胞杆菌幕虫亚种的伴胞晶体在预芽胞外壁内侧形成,呈现晶体芽胞粘连的现象。根据已发表的cry26Aa1和cry28Aa1基因序列设计引物,从苏云金芽胞杆菌幕虫亚种T02中扩增得到cry26Aa和cry28Aa基因,通过穿梭载体将这两个基因分别和同时转化到苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171后,透射电镜下可在芽胞外壁内侧和外侧同时观察到伴胞晶体,而单独表达时可在芽胞外壁外侧观察到伴胞晶体。结果表明,伴胞晶体在芽胞外壁内侧表达不单独依赖于启动子的时空调控,可能还受到晶体蛋白相互作用的影响。     

苏云金芽胞杆菌Sigma H对芽胞形成的影响

【目的】检测苏云金芽胞杆菌HD73中的转录调控因子Sigma H(σ~H)对spo0A基因转录的调控作用;异源表达纯化Sigma H蛋白,验证其对spo0A基因启动子的直接结合;检测sigH基因的缺失对苏云金芽胞杆菌HD73芽胞形成和晶体蛋白产生的影响。【方法】通过测定spo0A基因启动子指导的β-半乳糖苷酶活性评价spo0A基因在苏云金芽胞杆菌HD73野生型和sigH缺失突变体中的转录水平;通过PCR扩增苏云金芽胞杆菌HD73的sigH基因并插入到表达载体pET21b上,将质粒转入到表达菌株BL21(DE3)中,得到重组菌株BL21 (pETsigH);利用镍柱亲和纯化和阴离子交换纯化得到纯化的Sigma H蛋白;通过凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证Sigma H蛋白与spo0A基因启动子的直接结合;通过显微镜观察、活芽胞计数的方法对突变株HDΔsigH进行表型特征分析。【结果】sigH缺失后,spo0A基因转录活性降低;在大肠杆菌中正确表达并纯化出大小约为28kDa的Sigma H-His蛋白;EMSA结果表明纯化后的Sigma H-His蛋白可与spo0A基因启动子结合;镜检和活芽胞计数结果表明突变株HDΔsigH无法产生芽胞和蛋白晶体。【结论】Sigma H蛋白通过与spo0A基因启动子结合直接调控spo0A基因的表达且sigH基因的缺失阻断了苏云金芽胞杆菌中芽胞和晶体蛋白的产生。     

利用ERIC-PCR对苏云金芽胞杆菌与蜡状芽胞杆菌进行鉴定的研究

为了探索ERIC-PCR技术在苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌的鉴定及分型中的应用价值,本研究采用PCR方法初步检测苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的组成,并对苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌的总DNA进行ERIC-PCR扩增,分析ERIC-PCR指纹图谱的特点并采用NTSYS2.10软件对其进行聚类。结果显示,各菌株的ERIC指纹图谱表现出不同程度的多态性,但图谱与菌株所含cry基因的类型存在一定的相关性。聚类分析结果显示,含有相同或相近cry基因类型的Bt菌株在进化树上趋向聚为一类,而不含cry基因的蜡状芽胞杆菌趋向于与不含cry基因的Bt菌株聚为一类或单独聚类。若在多种模式菌株的参考下,该方法可用于苏云金芽胞杆菌的初步鉴定和分型。     

苏云金芽胞杆菌杀线虫伴胞晶体蛋白基因cry6Aa的克隆与表达

通过对晶体蛋白N-末端氨基酸测序,设计简并探针,从对根结线虫高毒力苏云金芽胞杆菌YBT-1518菌株中克隆到1个含有杀线虫晶体蛋白基因的片段。序列测定表明该序列含有两个ORF(orf1和orf2),其中orf1与基因cry6Aa1同源性为98%,已在GenBank上登录(Acc.NO.AF499736),并被命名为cry6Aa2。将克隆的该片段克隆到穿梭载体pHT304上,并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株可形成米粒状伴胞晶体。生物测定表明,表达的毒素蛋白对北方根结线虫的LC₅₀为9.47μg/mL,毒力与出发菌株(10.74μg/mL)相当。     

携带苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因重组杆状病毒的构建及其杀虫活性

用Bac-to-Bac系统,构建了包含极晚期基因ph启动子驱动的带有全长苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因和完整多角体基因的重组质粒pFCP,用该重组质粒感染昆虫Sf9细胞,得到了带有多角体和能够表达cry1Ac10基因的重组杆状病毒vFcph,并在昆虫细胞中表达了Cry1Ac10蛋白。同时构建了含cry1Ac10的穿梭载体．pHTC,并分别转化大肠杆菌、枯草杆菌和苏云金杆菌晶体缺陷型菌株,结果表明此三种工程菌均表达了分子量为133．3kDa的原毒素蛋白,其中在苏云金芽胞杆菌中的表达量最高。生物测定表明重组杆状病毒vFcph的表达产物具有杀虫活性,能增加杆状病毒力,加快杆状病毒杀虫速度,说明利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白表达,从而改善杆状病毒的杀虫特性是可行的。     

利用苏云金芽胞杆菌细胞表面展示系统表达禽流感病毒NP蛋白

首次利用苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)S-层蛋白CTC表面展示系统研究在Bt细胞表面展示禽流感病毒NP蛋白的可行性和最佳方案,为研制能常温长期保藏和运输的禽用口服疫苗奠定基础。用全长np基因或部分np基因(npp)代替S-层蛋白ctc基因的3′-端或中部,构建了4个重组质粒pSNP(含ctc-np)、pCSA-SNP(csa-ctc-np)、pCTC-NPP(ctc-npp)和pCSNPP(csa-ctc-npp)。将重组质粒分别电转化入Bt受体菌株BMB171中,获得了5个重组菌株BN、BCN、C-S、BCCN和CN。用5个重组菌株的营养细胞做玻片凝集试验,结果显示5个重组菌株均成功地在细胞表面展示了NP蛋白。用5个重组菌株的营养细胞免疫小鼠,ELISA测定血清抗体效价,结果显示5个重组菌株均具有免疫原性,其中重组菌株CN的免疫原性最高,其含融合基因csa-ctc-npp,证明该种融合基因的构建方式最佳。这为利用S-层蛋白CTC表面展示系统构建展示其它禽类病原体抗原的重组菌株以研制禽用热稳定性口服疫苗奠定了基础。     

苏云金芽胞杆菌G03 spoIVF操纵子敲除对芽胞和晶体形成的影响

spoIVF是一个普遍存在于芽胞杆菌中的操纵子。在枯草芽胞杆菌中,它编码的两个蛋白是芽胞形成所必需的。采用基因重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌G03菌株中的spoIVF操纵子,构建了spoIVF缺失株G03(spoIVF-)。研究表明:该突变株丧失了形成芽胞和晶体的能力。lacZ基因与cry1Aa基因的启动子融合表达分析发现:突变株中的cry1Aa基因的活性严重降低。利用载体pSTK携带spoIVF操纵子在突变株中的表达,使突变株部分恢复了产胞和形成杀虫晶体蛋白的能力。这说明spoIVF操纵子是所必需的,同时该操纵子还影响σE因子控制的cry1Aa基因表达。     

蜡状芽胞杆菌群菌株中部分病原相关因子的检测

对26株蜡状芽胞杆菌群菌株进行了肠毒素基因及其它病原相关因子的检测。PCR结果表明,17株蜡状芽胞杆菌群菌株中含有病原调控因子plcR的同源序列。采用3组溶血肠毒素hbl基因和3组非溶血肠毒素nhe基因特异性引物,分别可从73%的菌株中至少扩增出一个与预期DNA片段大小一致的片段,其中,苏云金芽胞杆菌菌株中溶血素hbl基因和非溶血素nhe基因的阳性检出率为83%。蜡状芽胞杆菌DBt248完全没有溶血活性,而且在溶血素hbl和非溶血素nhe基因的3个亚基以及病原调控因子plcR的PCR检测中均为阴性,有望作为宿主菌用于苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的表达和应用。     

PlcR在炭疽芽胞杆菌A16R中的功能研究

炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽胞杆菌(B. cereus)和苏云金芽胞杆菌(B. thuringiensis)均属于蜡样芽胞杆菌群,在遗传学上有很高的相似性。PlcR (Phospholipase C regulator)在蜡样芽胞杆菌中是十分重要的调控因子,但plcR基因在炭疽芽胞杆菌中发生一个无义突变导致在炭疽芽胞杆菌中产生一个截短PlcR蛋白。为了研究plcR基因对炭疽芽胞杆菌功能的影响,文章以蜡样芽胞杆菌CMCC6330基因组为模板,构建重组表达质粒pBE2A-plcR后导入炭疽芽胞杆菌疫苗株A16R中获得重组菌株,对其进行表型分析。结果显示,炭疽芽胞杆菌重组菌株的溶血活性基本没有恢复,但恢复了部分神经鞘磷脂酶活性,表明将蜡样芽胞杆菌的plcR基因导入炭疽芽胞杆菌后,可以直接激活神经鞘磷脂酶活性。     

炭疽芽胞杆菌A16D2株BA2380基因缺失突变株的构建

本课题组早期研究结果表明,炭疽芽胞杆菌BA2380蛋白可能与炭疽芽胞杆菌毒力有关,因而有必要对其功能进行深入研究。选取炭疽芽胞杆菌A16D2株为出发菌株,以其BA2380基因为目的缺失基因,参照A16D2株基因组序列及质粒pSET4s序列,利用软件设计上下游同源臂及抗性基因引物,用本实验室改造的“Golden Gate”克隆方法将3个片段同时连入温敏型穿梭载体pKMBK中(本实验室构建的受体质粒),从而构建基因打靶质粒。将该基因打靶质粒导入炭疽芽胞杆菌A16D2感受态细胞中,利用同源重组原理,筛选获得炭疽芽胞杆菌A16D2 BA2380基因缺失突变株,并对其进行验证。结果验证了本课题组构建的“Golden Gate”克隆体系进行多片段克隆的高效性,也为后续探索其基因功能奠定了基础。     

带cry3Aa启动子的aiiA基因在苏云金芽胞杆菌中的表达

N 乙酰高丝氨酸内酯 (N acyl homoserinelactones,AHLs) ,是一类数量感知 (Quorum sensing)系统中的信号分子 ,它参与诱导调控许多植物病原菌致病基因的表达。苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白能降解这类AHLs分子 ,进而可减弱病原菌致病基因表达产生的病害。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa的启动子是一种不依赖芽胞形成的启动子 ,它相对于其它cry类基因的启动子有启动基因转录时间早 ,转录时间长的优点。通过重叠延伸PCR ,用杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子替换编码AiiA蛋白的基因aiiA自身的启动子 ,构建了融合基因pro3A aiiA。将融合基因装入穿梭载体pHT3 0 4的BamHI SphI位点 ,得到重组质粒pBMB686并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株BMB686的AiiA蛋白表达量在各个生长时期均高于对照菌株 ,对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力也明显优于对照菌株