转座子Tn233(CH)分子量的测定

转座子Tn233(CH)带有str sul抗性基因,最早是在痢疾杆菌的抗药质粒DR233(Tc~r Cm~r Sm~r Su~r)中发现的。现在通过菌株间的配对,将插入了Tn233(CH)转座子的质粒R144drd3::Tn233(CH)转移到E·coli C600/pBR322(Ap~r、Tc~r)细胞中,组成两种质粒共存的菌株。从此菌株中提取出质粒DNA,用转化方法使它转移到E.coli C600菌株,再从所得到的转化子中用复印方法筛选出Tn233(CH)转座到pBR322质粒的转化子E.coli C600/pBR322::Tn233(CH),然后提出此质粒DNA,经限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HindⅢ与PvuⅡ等酶切后,在琼脂糖凝胶平板与聚丙烯酰胺凝胶柱上进行电泳分析,分别以BamHⅠ与EcoRⅠ双重酶解的λDNA、HindⅢ酶解的T5DNA、HaeⅢ酶解的M13 DNA与HaeⅢ酶解的pBR322 DNA作为泳动的标记,计算出质粒酶解片段的分子量,用此方法算出各片段分子量的总和为15.93×10~6道尔顿,此即为所求的pBR322::Tn233(CH)分子量,将此值减去pBR322的分子置2.87×10~6道尔顿,得到Tn233(CH)的分子量为13.06×10~6道尔顿。电泳结果还表明在Tn233(CH)DNA分子上,BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HindⅢ与PvuⅡ分别有5、9、1、6、2个切点数。     

转座子Tn233(CH)中转座基因的鉴定和定位

Tn233(CH)是从国内临床分离的耐药痢疾杆菌中找到的一个转座子,已经绘制了它的物理图,它与转座子Tn21基本相同。用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ对带有转座子Tn233(CH)的质粒pBR322::Tn233(CH)进行不完全消化,如此产生的DNA片段经T4 DNA连接酶连接后转化到E.coli C600细胞中,获得了一些保留有转座功能或失去了转座功能的转座子缺失变种。互补试验的结果表明,保留有转座功能的Tn233(CH)缺失变种在反式位置上对失去了转座功能的Tn233(CH)缺失变种有互补作用。对这些缺失变种在DNA上缺失的区域进行限制图分析,确定了转座子Tn233(CH)中转座基因的位置。     

转座子Tn233(CH)中抗性基因的定位

将Tn233(CH)从质粒DR233转座到可以扩增的质粒pBR322上,并绘制了包括7种限制性内切酶切点的pBR322:: Tn233(CH)DNA的限制图。经限制类型分析表明,链霉素抗性基因位于H3片段上,磺胺抗性基因位于H4片段上,汞盐抗性基因位于H1片段上。另外,B3片段上同时带有链霉素与磺胺的抗性基因,B1片段上带有汞盐抗性基因。     

利用转座子Tn233(CH)与Tn5作为基因载体的研究

用体外重组技术构建了转座子Tn233(CH)、Tn233△E14与Tn5的3个衍生物:(1)转座子Tn 233(CH)含有单个BgBlⅡ限制位点,将从质粒pTK 63来的含K 88抗原基因的BamHI片段连接到pBR322::Tn233(CH)的BglⅡ位点上,形成了pBR322::Tn233(K88)。(2)Tn233△E14是Tn233的缺失变种,此缺失除去了Tn233(CH)上的TnpA基因,但保留了BglⅡ位点,将同上面一样的BamHI片段克隆到pBR322::Tn233△E14的BglⅡ位点上,构建了pBR322::Tn233△E14(K88)。(3)Tn5含有1个BamHI限制位点,pTB341是1个有Tn5插入的质粒,pTB341经BamHI切割后得到3个BamHI片段,每个片段分别带有Ap~r基因;IS50L与Km~r基因;IS50R与Sm~r基因,当此3个片段经T4-DNA连接酶重新连接后,分离到了1个质粒pTS40,此质粒也由此3片段组成,但它们的排列与pTB341的不同,此重新连接的结果使Ap~r基因成为Tn5中的一部分。 遗传实验结果表明,K88抗原基因与Ap~r基因在这些转座子衍生物中能够表达,而且新构建的Tn233(K88)与Tn5(Ap)仍保留着转座的能力。当在反式位置上有TnpA基因时,Tn233△E14(K88)也能从pBR322::Tn233△E14(K88)转座到其它质粒上。     

转座子Tn233(CH)缺失突变株特性的研究

将带有质粒pBR322::Tn233(CH)(抗药类型为Ap~rTc~rSm~rSu~rHg~r)的大肠杆菌C600ML(多聚酶Ⅰ温度敏感突变株)在非允许温度条件下培养时,分离到12株营养缺陷突变型,其中10株的抗药类型为Sm~rSu~rHg~r,经质粒DNA提取与琼脂糖凝胶电泳分析表明,除1株(突变型3号)仍有质粒DNA外,其它9株细胞中的质粒DNA已不复存在。在12株中另外2株的抗药类型为sm~rSu~r(突变型19号与41号),它们也仍旧带有质粒DNA,经质粒抽提与限制性内切酶分析表明,这3种质粒(分别称为pTD3,pTD19与pTD41)DNA分别比pBR322::Tn233(CH)少了一些相邻的限制片段,经计算,pTD3缺失了1.33kb,pTD19缺失了7.22kb,pTD41缺失了9.09kb。从质粒的遗传图上可以看出,这3株缺失质粒都保留了pBR322载体上的DNA复制点与Tn233(CH)上的转座基因(TnpA),但是Tn233(CH)与pBR322相连处的两个末端反向重复顺序中的一个已经缺失,实验表明它们可能都失去了转座功能。对这些自发产生的缺失变种在转座子演化上的意义进行了讨论。     

萘质粒ND1.860HindⅢ片段的分子克隆和限制酶图谱

萘质粒ND1.860经限制性核酸内切酶HindⅢ完全消化和部分消化所产生的限制片段,分别在大肠杆菌质粒pBR322中克隆。通过对含有ND1.860HindⅢ片段的17个重组质粒进行限制酶分析,建立了ND1.860质粒的HindⅢ、EcoRⅠ和XbaⅠ种内切酶26个切点的酶切图谱。     

分子无性繁殖载体的组建——Ⅰ.乳糖操纵子的重组和表达

用包含乳糖操纵子的λplac 5 EcoR1 DNA 片段与质粒pBR 322重组,获得一个重组质粒pMG4。几种限制性内切酶的分析结果表明,pMG4上乳糖操纵子(lac)和抗氨基苄青霉素基因的转录方向一致;Iac 插入片段λ区的Hind Ⅲ切点和pBR 322抗四环素基因上的Hind Ⅲ切点相邻近。用pMG4 Hind Ⅲ片段转化大肠杆菌C_(600),筛选Ap~r Tc~s lac~ 转化体,得到另一个lac 重组质粒pMG401,在β-半乳糖苷酶结构基因近羧基端有一个EcoR1切点,插入外源基因可以置于lac 控制下而实现表达。同时,我们还测定了包含pMG4、pMG401或λplac 5不同细胞的β-半乳糖苷酶活力,对lac 的表达作了分析。     

牛疱疹病毒Ⅳ型(DN-599株)DNA的限制性酶切位点图及重复序列分析

牛疱疹病毒Ⅳ型(BHV-4)DNA片段分别被重组到质粒pUC9或pBR322的EcoRI、Hind Ⅲ和BamHⅠ位点中,用光生物素(Photobiotin)标记这些重组质粒作为探针,分别与转移到硝基纤维素膜上的病毒DNA的EcoRⅠ、Hind Ⅲ和BamHⅠ片段进行杂交,根据杂交结果及克隆的BHV-4DNA片段的双酶切分析,画出了病毒DNA的EcoRⅠ、Hind Ⅲ和BamHⅠ位点图,井证明在病毒DNA的两末端含有多聚重复序列,左侧含12个重复单位,右侧含6个重复单位,两侧重复单位的排列方向相同,重复单位的大小为2.35kb。病毒DNA分子无任何异构体.     

分子无性繁殖载体的组建——Ⅰ.乳糖操纵子的重组和表达

用包含乳糖操纵子的λplac 5 EcoR1 DNA片段与质粒pBR 322重组,获得一个重组质粒pMG4。几种限制性内切酶的分析结果表明,pMG4上乳糖操纵子(lac)和抗氨基苄青霉素基因的转录方向一致;Iac插入片段λ区的Hind Ⅲ切点和pBR 322抗四环素基因上的Hind Ⅲ切点相邻近。用pMG4 Hind Ⅲ片段转化大肠杆菌C_(600),筛选Ap~rTc~s lac~ 转化体,得到另一个lac重组质粒pMG401,在β-半乳糖苷酶结构基因近羧基端有一个EcoR1切点,插入外源基因可以置于lac控制下而实现表达。同时,我们还测定了包含pMG4、pMG401或λplac 5不同细胞的β-半乳糖苷酶活力,对lac的表达作了分析。     

油桐尺蠖核多角体病毒的基因型变异

本文用AvaⅡ、BamHⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ四种限制性内切酶对油桐尺蠖核多角体病毒(Buzvra suppressaria Nuclear PolyhedrosisVirus)DNA作酶解图谱分析,比较了湖北、湖南、四川三个分离株的基因组。三者图谱基本相似,但少数片段略有不同。亚克分子片段的存在表明野生的油桐尺蠖核多角体病毒有基因型变异,包含着数个基因型变种。     

转座子Tn233(CH)中链霉素和磺胺抗性基因的精确定位

重组质粒pTH3和pTB3分别是转座子Tn233(CH)中含Sm抗性基因和同时含Sm和Su抗性基因的DNA片段克隆到pBR322上得到的。将Tn5转座到pTH3或pTB3上,分离到一些对Sm敏感或仍有抗性的突变株。比较变种及亲本质粒DNA的限制图谱,测出了Tn5的插入位点,并测得pTH3的Sm抗性基因在大肠杆菌极大细胞中指令一个分子量约为32K的多肽合成。据此我们绘制了pTH3中Sm抗性基因的位置与长度。用相似方法也绘制出了Su抗性基因在pTB3上的位置与长度。利用Tn5的极性效应,推测Tn233(CH)中Su和Sm抗性基因不构成一个操纵子。     

油菜叶绿体基因组雄性不育特异DNA片段的定位

实验选用油菜湘矮不育系及同核保持系叶绿体DNA为材料,用4种限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ和SmaⅠ完全酶解。在EcoRⅠ酶解的保持系ctDNA图式中,观察到唯一的差异片段E3.2kb。将此片段连接于载体pUC9进行克隆,经克隆杂交及电泳分析鉴定,获得重组子。以rRNA基因为探针,与EcoRⅠ酶解的保持系ctDNA杂交,其中一条阳性带显示在差异片段E3.2。进一步以E3.2片段为探针,与经过限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、salⅠ、BgⅢ、HindⅢ和PstⅠ酶解后的rRNA基因反杂交。根据rRNA基因图谱,这一与不育性有关的E3.2kb片段被定位于距16S rRNA基因5'端+2.0至+5.4kb的前导序列中。此结果表明,这段可能与花粉育性形成有关的片段定位于叶绿体基因组反向重复区。     

pBR322DNA与8-甲氧补骨脂素光化学反应部位的碱基顺序特异性

用限制性核酸内切酶酶切试验研究了质粒pBR322 DNA经8-MOP及近紫外线作用后损伤部位的碱基顺序特异性。实验研究发现PUVA损伤的DNA在HindⅢ及RsaⅠ识别位置上酶切反应受到严重抑制,而在SphⅠ,EcoRⅠ,PvuⅡ,BamHI,PstⅠ识到位置上抑制轻微。通过对不同识别位置上碱基顺序及其光化学反应敏感性的分析,推断出DNA的TpA顺序可能是最易接受8-MOP光化学反应的部位。     

酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子片段的亚克隆

含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal31从两端逐步消解碱基对,使反应终止于每端消解500bp左右,加上EcoR Ⅰlinker。用EcoRⅠ、BamH Ⅰ酶切,分离1. 9kb的DNA片段,插入用同样双酶切的酵母启动子探针载体pVC727上,转化E.coli C600,再从转化子中提取重组质粒转化酵母受体菌NA87-11A。用菌落染色法筛选出PHO5基因高效表达转化子,这个转化子质粒含有1.9kb的BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切片段,它具有强启动子功能,并测定其3'末端序列。     

蓖麻蚕(Attacus ricini)核糖体RNA基因片段在大肠杆菌中的无性繁殖

利用质粒pBR322作运载体,获得了蓖麻蚕(Attacus ricini)核糖体rRNA基因(rDNA)的部分片段在E.coli中的无性繁殖株。酶切图谱分析及Southern法分子杂交鉴定证明,重组质粒pARI含有1.95MdrDNA EcoRI-BamHⅠ双酶切片段;pARⅡ含有2.6Md的rDNABamHⅠ片段。并测定了BamHⅠ片段与pBR322连接方向。     

酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子片段的亚克隆

含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal31从两端逐步消解碱基对,使反应终止于每端消解500bp左右,加上EcoR Ⅰlinker。用EcoRⅠ、BamH Ⅰ酶切,分离1. 9kb的DNA片段,插入用同样双酶切的酵母启动子探针载体pVC727上,转化E.coli C600,再从转化子中提取重组质粒转化酵母受体菌NA87-11A。用菌落染色法筛选出PHO5基因高效表达转化子,这个转化子质粒含有1.9kb的BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切片段,它具有强启动子功能,并测定其3'末端序列。     

大鼠肝和肝癌DNA及其限制性酶切图谱分析

大鼠肝和肝癌BERH-2 DNA的EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ,HindⅢ和Pst Ⅰ,以及EcoR Ⅰ分别与BamH Ⅰ或HindⅢ或Pst Ⅰ组合双酶合切的电泳图谱间无明显差异;双向凝胶电泳重复顺序图谱也近似。在一定实验条件下,大鼠肝癌BERH-2 DNA在凝胶电泳上,除去显示EB荧光主带外,还有呈现阶梯大小的片段。最小片段为270bp,两电泳相邻片段间的长度差约为160bp,并且能与标记的核RNA起杂交反应。对实验结果进行了讨论。     

蓖麻蚕rDNA的十字结构

单链核酸酶——S1酶在超螺旋pBR322上有专一的切点。这是因为在pBR322超螺旋分子上邻近的反向重复顺序所形成的十字结构具有单链区能为S1酶作用。真核细胞基因——蓖麻蚕rDNA的完整重复单位插入pBR322所组建的质粒pARⅢ,其超螺旋分子的顺序上也有S1敏感区。用S1酶和PstⅠ酶双酶切可以产生特定长度的片段。pARⅣ是带有pARⅢEeoRⅠ(2)-BamHⅠ(2)片段的次级克隆,超螺旋pARⅣDNA经S1酶和PstⅠ酶双酶切所显示的S1酶切点与pARⅢ一致。由于对S1酶的相对敏感度不同,在pARⅢ和pARⅣ分子中原有的pBR322上的S1酶切点被掩盖。真核细胞DNA的十字结构在染色质水平上的功能意义有待进一步探讨。     

鹅源腺病毒基因组DNA物理图谱的构建

将鹅源腺病毒Y81G4株全基因组DNA的HindⅢ酶切片段分别插入质粒pUC18, 成功构建了全基因组DNA文库.在此基础上,将重组质粒携带的插入片段切出、回收并分别用地高辛标记后作为探针,与经限制酶BamHI、EcoRI、PstI、Eco RV消化的病毒基因组DNA进行Southern Blotting,杂交结果经比较综合后获得了该病毒基因组DNA的HindⅢ、Ba mH I、EcoR I、PstI、EcoR V限制性内切酶的物理图谱.利用已发表的含有鸡EDS76病毒AA-2 株基因组DNA右末端的重组质粒pBE42作为探针,与本病毒两末端重组质粒进行Southern Blo tting,根据同源性杂交结果确定了本病毒基因组DNA物理图谱与EDSVAA-2株相应的方向. 本病毒基础因组DNA物理图谱的精确构建,为进行基因组结构分析,筛选复制非必需区,构建禽腺病毒载体打下了基础.     

菠菜叶绿体DNA 4.1 kb的SalⅠ片段的克隆

利用pBR 322衍生质粒DNA为载体,将菠菜叶绿体DNA的SalⅠ限制性片段插入质粒的Sal Ⅰ位点,获得52个含重组质粒的菌落(Ap~rTc~5)。并对每个克隆的质粒进行限制性内切酶分析,通过Southern吸印与探针杂交,证明了重组质粒pSS104含有的插入DNA是菠菜叶绿体DNA 4.1kb的SalⅠ片段。迄今在该片段尚未定位任何已知的叶绿体基因,用大肠杆菌的活体系统也未能发现这段DNA的转录产物,本文对此进行了讨论。