鱼类肌肉生长抑制素研究进展

肌肉的分化、生长和发育是动物生长发育的重要环节和过程,肌肉也是动物为人类提供的食品的主要成分。肌肉的生长和发育在不同层次受许多因素的影响,如环境(气候、营养等因素) 、激素和分子水平的调控。       

黄河裸裂尻鱼肌肉生长抑制素基因克隆及表达分析

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)属于转化生长因子β(TGF-β)超家族中的一个成员,是骨骼肌生长发育的负调控因子。该文以黄河裸裂尻鱼肌肉总RNA为模板,采用RT-PCT、5’-RACE和3’-RACE法获得MSTN基因全长cDNA序列为2180bp,包含长为1128bp的开放阅读框,编码375个氨基酸。以肌肉总DNA为模板,通过PCR法进一步获得了MSTN基因的2个内含子序列,分析表明,黄河裸裂尻鱼MSTN基因与其他脊椎动物具有相似的基因结构(包括3个外显子和2个内含子)。黄河裸裂尻鱼MSTN具有脊椎动物MSTN的共同序列特征,含有1个蛋白酶水解位点RXXR和8个位于TGF-β功能区域保守的半胱氨酸残基。氨基酸序列同源性分析表明,黄河裸裂尻鱼MSTN序列与其他鲤科鱼类MSTN具有较高的同源性;而与哺乳动物和禽类的MSTN同源性较低。系统发育分析表明,黄河裸裂尻鱼MSTN与其他鲤科鱼类聚于同一进化支。RT-PCR分析表明,该基因在黄河裸裂尻鱼9个被检组织中均有表达,但在心、肾、肠、精巢中表达量较高。Real-TimePCR分析显示,MSTN基因在胚胎中的相对表达量,随胚胎发育阶段的不同而有所差异,暗示MSTN的功能可能并不局限在对肌肉生长发育的负调控作用,可能还有其他功能。     

大黄鱼肌肉生长抑制素基因微卫星序列多态性分析

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)参与肌肉生长和脂肪发生的调节．本研究在克隆大黄鱼MSTN cDNA的基础上,对3′端非编码区微卫星序列的多态性及其与体长、体重和肌肉脂肪含量的关系进行了分析．结果表明,获得的cDNA长1 886 bp,在3′端非编码区存在微卫星序列（CA）_n．在受检的52个个体中,微卫星序列长度在64～126 bp之间.大部分个体的微卫星序列内存在碱基替换,最常见的碱基替换形式是C→T,属于非完美型微卫星序列．根据该位点微卫星序列长度,在实验群体中共检测到23个等位基因,其中频率为0.019 2的等位基因11个,0.038 5的5个, 0.076 9的3个,0.057 7的2个,0.115 4和0.134 6的各1个．该基因位点的群体杂合度为0.932 7,多态信息含量为0.928 8．微卫星序列长度与大黄鱼体长、体重和肌肉脂肪含量之间的相关系数分别为0.409、0.435和-0.026,P值分别为0.021、0.016和0.878．碱基替换对大黄鱼生长及肌肉脂肪含量均无显著影响．     

鳜肌肉生长抑制素Myostatin cDNA克隆与组织表达分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了鳜(Siniperca chuatsi)肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)cDNA序列,并分析了该基因的结构特征和亲缘关系。鳜MSTN cDNA序列全长2627bp,包括5′端非翻译区117bp、3′端非翻译区1376bp和开放阅读框(ORF)1134bp,共编码377个氨基酸,含22个氨基酸的信号肽。鳜MSTN具有脊椎动物MSTN的共同序列特征,含有1个蛋白酶水解位点RARR和9个保守的半胱氨酸残基。脊椎动物MSTN氨基酸序列的亲缘关系分析表明,鳜与其他鱼类聚为一支。RT-PCR分析表明,鳜MSTN在成体不同组织中的表达情况不同,其中,卵巢、肾、眼、肌肉、心、脑、皮肤和胃中有表达,肝胰脏未见表达。     

鲤鱼肌肉生长抑制素基因(MSTN)的克隆及其组织表达特征

肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)是动物肌肉发育和生长过程中的负调控因子,对MSTN的研究将有助于促进动物生产。鲤鱼是我国的主要淡水养殖对象之一。因此,我们采用RT-PCR方法克隆了鲤鱼MSTN cDNA(No.EF551058)的部分序列,长度为921bp,编码306个氨基酸残基。鲤鱼MSTN具有MSTN的共同特征,有蛋白酶水解位点RIRR和9个保守的半胱氨酸残基。多重序列比较发现其与斑马鱼GDF8有极近的亲缘关系,96.7%的氨基酸序列同源。不同组织的RT-PCR分析发现鲤鱼MSTN主要在肌肉和脑部表达,而其他所检测组织未见表达。鲤鱼MSTN不仅在肌肉生长发育中发挥作用,可能在神经系统发育中也有其作用。     

不同品种猪肌肉生长抑制素基因单核苷酸多态性分析

用PCR-RFLPs和PCR-SSCP分析方法,对"双肌臀”大白猪、大白猪、长白猪、杜洛克、汉普夏、皮特兰、二花脸、东北民猪、湖北白猪和部分杂交猪等不同品种猪肌肉生长抑制素基因3＇编码区、5＇调控区及内含子1区3个单核苷酸多态性位点(SNPs)进行了分析.结果表明,3＇编码区的SNP发生的频率较低,在274头猪中未检出突变纯合体.对5＇调控区的SNP,引进猪种(大白猪、长白猪、杜洛克、汉普夏和皮特兰)及其杂交猪以等位基因T为主,二花脸和湖北白猪则以等位基因A为主,均偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.01).东北民猪的3种基因型近乎相等,处于Hardy-Weinberg衡状态.对内含子1区的SNP,大白猪及其与长白猪的杂交猪等位基因G占优势,二花脸和湖北白猪则以等位基因A为主,均偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.01);东北民猪和大二猪的等位基因G和A近乎相等,处于Hardy-Weinberg平衡状态."双肌臀”大白猪在5＇调控区和内含子1区这两个位点的A等位基因稍高于普通大白猪.5＇调控区和内含子1区SNPs所产生的等位基因表现出连锁遗传现象.     

肌肉生长抑制素对脂肪细胞生长发育和脂代谢的调控

肌肉生长抑制素(MSTN)对骨骼肌生长的抑制作用已得到证实,但其调控脂肪组织的作用还不是十分清楚。本文综述了MSTN调控脂肪细胞生长发育和脂代谢的相关机制和可能研究趋势。     

猪肌肉生长抑制素基因侧翼区新微卫星标记的鉴定及分析

提取包含猪肌肉生长抑制素基因的BAC克隆,以EcoRⅠ进行酶切并回收其中大于4kh的酶切产物,连接到pGEM-3zf( )载体后得到了亚克隆。测序分析表明,插入片段不属于猪肌肉生长抑制素基因的一部分,但其中包含13拷贝的(TG)n重复。以该重复序列的侧翼设计引物对猪的基因组进行分析,得到了PCR扩增产物。对一个“双肌臀”大白猪家系进行PCR扩增及非变性聚丙烯酰胺凝胶分析的结果表明,该位点以并显性方式遗传,是一个新的微卫星标记。对莱芜猪、长白猪、大白猪、杜洛克、皮特兰、民猪和二花脸7个品种的381个无关个体的检测均显示该基因座只有两个等位基因,重复数分别为13和19,是一种多态性较低的微卫星标记。与包含该基因的序列(AY208121)比对分析表明,该微卫星属于肌肉生长抑制素基因(MSTN)侧翼区的一个分子标记,在猪肉用性状QTL的精细定位和MSTN功能分析中将发挥重要作用。     

酵母表达肌肉生长抑制素前肽发酵工艺的优化

突变型肌肉生长抑制素前肽（MMP）在治疗肌肉萎缩症和培育多肌肉牲畜上有着广泛的应用前景。以重组表达MMP的毕赤酵母工程菌为模式,对该工程菌在30L发酵灌中培养与诱导备件进行优化,建立该表达系统大规模发酵的最佳生产条件,以期荻得最短的发酵时间和最低的生产损耗。毕赤酵母发酵过程通常分为3个阶段：分批培养（基础培养）阶段、分批补料培养阶段、诱导阶段。对发酵过程的第2与第3阶段进行了优化。通过分步提高甘油流加速度：以20mL／L·h^-1的速度流加5h、以30mL／L·h^-1的速度流加5h、以50mL／L·h^-1速度流加14h,并通入纯氧气,维持60％的溶氧度,使甘油流加阶段的时间从常规的48h缩短至24h,即只需24h即可达到常规方法48h才能达到的菌体密度。在诱导表达阶段,通过甘油与甲醇的交替流加,同时对发酵液中甲醇含量的实时监测,保持甲醇的浓度不超过0．5％的高限,使诱导的时间从常规的72h缩短至36h,而且表达量提高了约1倍。优化后,整个发酵周期从120～148h缩短至72～80h,显著提高了MMP蛋白的生产效率。     

大黄鱼肌肉生长抑制素-1前肽原核表达、多克隆抗体制备和功能验证

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)在动物肌肉的生长和发育过程中起着重要作用。该研究通过RT-PCR从大黄鱼(Larimichthys crocea)肌肉组织中克隆肌肉生长抑制素-1前肽基因(MSTN-1pros),构建了表达大黄鱼生长抑制素前肽的重组质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,获得了大黄鱼MSTN-1pros融合蛋白。用分离的重组蛋白免疫大白兔,制备了抗大黄鱼MSTN-1pros的多克隆抗体。经蛋白免疫印迹法检测,确定获得的抗体具有较高的特异性。通过对大黄鱼幼鱼的注射实验,发现注射过MSTN-1pros抗体的大黄鱼增重率比对照组降低了20.71%(P0.05),证明MSTN前肽抗体对大黄鱼的生长具有抑制作用。实验结果表明,MSTN前肽蛋白可以用于养殖鱼类的生长调控。     

松江鲈鱼Cytb基因序列分析及种质鉴定

采用PCR方法扩增四尾松江鲈鱼线粒体细胞色素b(mitochondrial cytochrome b,Cytb)基因序列,全序列长度为1 141 bp,并建立了松江鲈鱼的实时定量PCR检测方法对该物种进行种质鉴定。分析Cytb基因序列基本特征显示,Cytb基因在第3位密码子表现出明显的反G偏倚,显示出脊椎动物Cytb基因的共同特性。第2位密码子嘧啶的含量远高于嘌呤的含量,有5个位点发生转换,0个位点发生颠换。选取杜父鱼科(Cottidae)的10种鱼类,与松江鲈鱼进行序列分析,构建发育系统树并分析遗传距离,与鲈鱼的亲缘关系最远。以松江鲈鱼Cytb基因序列为靶基因,利用PRIMER EXPRESS2.0软件设计引物和Taqman探针,建立检测松江鲈鱼的定量PCR方法,特异性强,灵敏度高,检测限为3.20×102拷贝/反应。     

孔石莼(Ulva pertusa)质体蓝素基因的克隆及基因特征分析(英文)

采用cDNA末端快速扩增的办法,从孔石莼(Ulva pertusa)中克隆获得质体蓝素基因。该基因完整的cDNA为787bp,包括40 bp 5’端非编码区和327 bp的3’端非编码区,以及一个420 bp的开放阅读框架,编码139个氨基酸的蛋白质。该基因编码质体蓝素的前体肽,其N端41个氨基酸残基为信号肽,后面为98个氨基酸残基的成熟肽。从Genbank中选择了13个质体蓝素的前体肽基因进行序列比对分析和构建进化树。孔石莼质体蓝素基因与其它质体蓝素基因的同源性为48.2%至78.8%。该进化树将来源于6种藻类植物的7个质体蓝素基因聚类在一起,显示出它们较近的进化关系。同样,也表现出11种生物的分子进化关系。序列比对结果显示,在质体蓝素的基因序列中存在两个高度保守的基序,它编码质体蓝素蛋白的铜结合活性位点。     

松江鲈(Trachiderm usfasciatus)髓样分化因子MyD88基因克隆与组织表达分析

髓样分化因子(My D88)是TOLL样受体介导的信号通路中的一个关键接头分子,通过激活核转录因子(nuclear factor-kappa B,NF-κB)而参与机体的先天免疫。克隆了松江鲈的My D88基因(命名为Tf My D88),并对该基因进行了生物信息学和表达模式分析。结果显示,Tf My D88 c DNA序列全长1 555 bp,5'UTR长89 bp,3'UTR长599 bp;开放阅读框长度为867 bp,编码288个氨基酸。SMART软件预测Tf My D88分子的N端为一个保守的死亡结构域(death domain,DD),C端存在典型的TIR(Toll/interleukin-1 receptor)结构域。Tf My D88与其它脊椎动物My D88的氨基酸相似性达57.58%-82.64%,系统进化树分析表明Tf My D88与同属鲈形总目的花鲈和鳜鱼聚在一起,所有鱼类My D88聚为一支。Real-time PCR检测显示Tf My D88广泛表达于松江鲈各组织,但在鳃中的相对表达量最高;其次为脾脏和皮肤。LPS(lipopolysaccharide)刺激后,Tf My D88在松江鲈的血液、肝脏、皮肤、脾脏均出现明显上调。刺激2 h后,在血液Tf My D88表达量升高了近60倍,在皮肤中的表达量也升高了27倍。上述结果表明Tf My D88可能参与松江鲈先天免疫。     

紫花苜蓿果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因全长克隆及分析

根据已知的与盐胁迫相关的EST序列,采用SMART RACE方法克隆了紫花苜蓿果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(ALD)全长cDNA,命名为MsALD(GenBank accession No.FJ896113).序列分析结果表明,该cDNA全长1 487 bp,包含一个1 194 bp的最大开放阅读框,编码398个氨基酸.经同源比对和进化树分析,MsALD基因编码的氨基酸与红三叶草、马铃薯、烟草等的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(ALD)氨基酸序列一致性高达90%以上,确定其属于第Ⅰ类果糖-1,6-二磷酸醛缩酶.半定量RT-PCR分析表明,MsALD基因可能与紫花苜蓿抗盐机理相关.     

Molecular Cloning and Characterization of the Myostatin Gene in Croceine Croaker, Pseudosciaena crocea

Myostatin (MSTN) is a negative regulator of skeletal muscle mass and has a potential application in aquaculture. We reported the characterization of the myostatin gene and its expression in the croceine croaker, Pseudosciaena crocea. The myostatin gene had three exons encoding 376 amino acids. The cDNA was 1,906 bp long with a 5′-UTR and 3′-UTR of 108 bp and 667 bp, respectively. A microsatellite sequence, CA₃₀ and CA₂₆ separated by TA, existed in the 3′-UTR. Intron I and II were 343 bp and 758 bp in length, respectively. The deduced amino acid sequence was highly conserved, and had more than 90% identical to shi drum, gilthead seabream, striped sea-bass, white perch, and white bass proteins. The myostatin of croceine croaker had a putative amino terminal signal sequence (residues 1–22), a transforming growth factor-beta (TGF-β) propeptide domain (residues 41–256), a RXXR proteolytic processing site (RARR, residues 264–267, matching the RXXR consensus site), and a TGF-β domain (residues 282–376). There were 13 conserved cysteine residues in croceine croaker myostatin, nine of which are common to all TGF-β superfamily members. The most conserved region of vertebrate myostatins is the TGF-β domain, which was the mature bioactive domain of the myostatin protein. The myostatin gene was expressed not only in the skeletal muscle, but also in the other tissues.     

毛木耳漆酶基因的克隆、序列分析及其鉴定

本文利用PCR和RACE技术首次从毛木耳AP4菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及其基因组全长序列,基因组大小为2514 bp.通过比较该漆酶基因的cDNA和基因组DNA的全长序列,发现该基因包含14个外显子和13个内含子.cDNA序列的全长为1972 bp,其包含一个完整的ORE长度为1860 bp,编码619氨基酸,推测的分子量大小为68 kD,等电点pI为5.15.在氨基酸序列的氨基末端存在一个信号肽序列,同时该基因还包括含铜氧化酶的三个功能结构域KOG1263、SufI和pfam00394.氨基酸序列与GenBank中登录的真菌漆酶蛋白序列比对表明:该氨基酸序列与其它真菌漆酶蛋白序列有较高的同源性,氨基酸序列相同性最高达41%,相似性为58%,并且含有真菌漆酶的四个保守的Cu-bind结构域.将获得的漆酶基因lacl与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pYH3660,将其转化到毕赤酵母中,经甲醇诱导该基因在第10天产酶高达123 IU/L,并通过Native SDS-PAGE电泳获得预期大小的漆酶蛋白条带.结构分析和功能验证均表明:本研究获得的基因lacl为漆酶基因.     

薇甘菊水杨酸羧甲基转移酶基因的分离鉴定及表达分析

为研究水杨酸羧甲基转移酶基因在植物防御系统中的作用,采用RACE法从薇甘菊(Mikania micrantha)cDNA文库中克隆到薇甘菊水杨酸羧甲基转移酶基因SAMT全长cDNA,并进行外源表达以及水杨酸诱导模式分析.结果表明,该基因cDNA全长1 299 bp,其中编码区长1 089 bp,编码362个氨基酸,Blast显示该基因编码的氨基酸序列与仙女扇(Clarkia breweri)的相似性为74%,证实其主要功能是将水杨酸(salicylic acid,SA)甲基化成水杨酸甲酯(methyl salicylate,MESA),由此将该基因命名为MmSAMT,GenBank登录号为FJ869889.将MmSAMT编码序列克隆至pET-32a(+)载体,转化Rosetta-gami(DE3)中表达,SDS-PAGE显示单体分子量在40 kD左右,与预测结果一致.Western bolt显示在20℃、0.05 mmol/LIPTG和180 r min-1下诱导6 h,可获得较多的可溶性蛋白质.对喷施100μmol/L SA薇甘菊叶片中MmSAMT的转录谱进行研究,该基因的诱导受到SA的激活,48 h的表达水平达最高,暗示MmSAMT可能通过催化合成MeSA引发系统获得性抗性,提高抗性防御的警戒等级. 89.将MmSAMT编码序列克隆至pET-32a(+)载体,转化Rosetta-gami(DE3)中表达,SDS-PAGE显示单体分子量在40 kD左右,与预测结果一致.Western bbt显示在20℃、0.05 mmol/LIPTG和180 r min-1下诱导6 h,可获得较多的可溶性蛋白质.对喷施100μmol/L SA薇甘菊叶片中MmSAMT的转录谱进行研究,该基因的诱导受到SA的激活,48 h的表达水 达最高,暗示MmSAMT可能通过催化合成MeSA引发系统获得性抗性,提高抗性防御的警戒等级. 89.将MmSAMT编码     

家蚕瘫痪肽结合蛋白基因克隆与分析

ENF肽家族具有保守的N末端结构（Glu—Asn—Phe-）。该家族成员肽大多具有重叠功能活性,在鳞翅目昆虫的免疫反应,生长调控和自体调节等方面都发挥着重要的作用。在昆虫的免疫反应中,血细胞尤其是淋巴液的黏附性是针对外来侵入物的免疫应答过程中的重要因素。家蚕瘫痪肽（paralytic peptide）是ENF肽家族的一种,其具有多种的生物学活性,包括致瘫痪性及在家蚕血细胞免疫反应中的促吞噬细胞扩散活性。ENF肽家族的另一成员,粘虫（Pseudaletia separata）的生长阻抑肽（Growth-blocking peptide）,同家蚕瘫痪肽一样能够在粘虫的血细胞免疫反应中起到调节吞噬细胞的功能。目前,关于昆虫细胞免疫应答的终端调控分子机制的研究还比较少,有文献报道粘虫的生长阻抑肽结合蛋白（GBP—BP）能够起到沉默生长阻抑肽活性的功能,从而可能参与调节细胞免疫应答的终端调控。在本研究中,利用荧光差异显示技术（FDD）分析了家蚕感染BmNPV病毒后基因表达差异情况,在血淋巴中获得了一条差异条带G12782＊通过5＇-RACE技术,首次在家蚕中克隆得到了该基因的全长cDNA序列。通过同源性分析得知,该基因所编码的蛋白质与粘虫的生长阻抑肽结合蛋白具有很大的同源性,并被命名为家蚕瘫痪肽结合蛋白（Bmori paralytic peptide binding protein,PP-BP）。通过RT-PCR研究发现,该蛋白基因在血淋巴中大量表达。同时,利用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR）技术分析了该基因在正常饲养家蚕与添食BmNPV病毒的家蚕中的表达差异,结果显示该基因在家蚕添食BmNPV病毒后的表达量大大增强,这就暗示该基因可能与BmNPV病毒刺激后所引起的家蚕血液细胞免疫反应相关。利用生物信息学方法对该基因的结构进行了分析,发现该基因具有两个外显子和一个内含子。这个基因已经登入GenBank数据库,收入号为DQ306881。     

Molecular Cloning,Identification, and Expression Patterns of Myostatin Gene in Water Buffalo (Bubalus Bubalis)

Myostatin (MSTN), also named growth differentiation factor 8 (GDF8), is a transforming growth factor-β (TGF-β) family member with a key role in the negative regulation of skeletal muscle growth. However, its role in ovarian folliculogenesis remains unclear. To provide us with a basis for understanding this role, we cloned MSTN and examined its expression patterns in water buffalo (Bubalus bubalis). The complete ORF of the water buffalo MSTN gene is 1,128 nucleotides, which encode a 375 amino acid protein and sharing 99% identity at the deducted amino acid level with that of Bos taurus. Protein sequence analysis showed that MSTN is a weakly acerbic extracellular protein, consisting of signal peptides at 18-19 sites, a TGF-β propeptide, and a TGF-β domain. RT-PCR analyses demonstrated that water buffalo MSTN was expressed in multiple tissues but not limited to muscle. Immunohistochemistry staining confirmed the presence of MSTN in oocytes and granulosal cells. To our knowledge, this is the first study to confirm the expression of MSTN in the water buffalo ovary, suggesting an additional role of MSTN in water buffalo folliculogenesis, along with its role in skeletal muscle growth regulation. Further study of the regulatory mechanism of MSTN in water buffalo reproduction is warranted.

Abbreviations: MSTN, myostatin; ORF, open reading frame.     

竹子木质素合成酶基因克隆与分析

苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia-Lyase,PAL;EC 4.3.1.5)是木质素生物合成过程的关键酶和限速酶,竹材中的木质素含量的降低有利于提高竹浆的品质.采用RACE技术分别从黄古竹(Phyllostachys angusta)等4种竹子中克隆了PAL基因的全长序列,并进行了生物信息学分析.结果显示,PAL基因的开放读码框长度为2 136 bp,共编码712个氨基酸,具有2个外显子和1个内含子;对PAL蛋白单体的三维结构分析显示,PAL蛋白均含有大量的α螺旋和β折叠结构;基于邻接法的进化树对31种植物的PAL基因的氨基酸序列分析表明,竹类植物PAL的氨基酸序列之间同源性较高,与单子叶植物禾本科(除竹亚科植物外)的玉米和甘蔗等的亲缘关系较近,而与双子叶植物的辣椒、烟草、红参、莴笋等亲缘关系较远.