三七总皂苷对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织的凋亡抑制作用

目的:探讨三七总皂苷(PNS)对大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑皮层细胞的凋亡抑制作用.方法:采用大脑中动脉栓塞再通法建立脑缺血再灌注模型,将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组和三七总皂苷治疗组;根据再灌注时间不同分为再灌注10h、12 h、24h组,缺血时间为90 min.大鼠脑缺血再灌注10h、12h和24h不同时间点进行神经功能评分,采用原位末端标记法检测神经细胞凋亡情况,同时用免疫组化法检测抑制凋亡蛋白XIAP和促凋亡蛋白Smac阳性细胞数.结果:缺血再灌注组神经细胞凋亡数明显增加,XIAP蛋白的表达呈先高后低的变化(P＜0.05),Smac蛋白的表达明显上升(P＜0.05);PNS治疗组能明显减少脑皮层组织神经细胞凋亡数(P＜0.05),增加XIAP蛋白表达(P＜0.05),减少Smac蛋白表达(P＜0.05).结论:PNS可能通过促进抑制凋亡蛋白XIAP的表达和抑制促凋亡蛋白Smac的表达,减少脑组织缺血再灌注损伤后的神经细胞凋亡,进而对再灌注后脑组织具有抑制脑细胞凋亡的作用.     

线粒体分裂蛋白抑制剂在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制

目的:观察线粒体分裂蛋白抑制剂在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用,并初步探讨其在线粒体凋亡途径中的作用机制.方法:雄性Wistar大鼠48只,体重250～300 g,随机分为三组(n=16):假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注组(I/R组)和mdivi-1预处理组(mdivi-1组),线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,缺血2小时,再灌注24小时后应用流式细胞术检测神经元凋亡;Western blot法检测Cyt C蛋白的表达;RT-PCR法检测Cyt C mRNA的表达.结果:与Sham组比较,I/R组神经细胞凋亡率与CytC蛋白以及mRNA表达水平显著升高(P＜0.01).应用mdivi-1预处理后细胞凋亡率与CytC蛋白以及mRNA表达水平明显降低(P＜0.01).结论:线粒体分裂蛋白抑制剂可以明显减轻脑缺血再灌注损伤,其作用机制可能通过阻断线粒体-细胞色素C途径来抑制细胞凋亡.     

结核分枝杆菌16-kDa α晶体蛋白的原核表达及纯化

目的:利用基因工程技术原核表达并纯化结核分枝杆菌α晶体蛋白(Acr)。方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增Acr的编码基因,以pCold为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析和纯化该表达产物。结果:构建了具有正确基因序列的Acr重组表达质粒,重组Acr在大肠杆菌BL21(DE3)中经低温诱导得到可溶性表达;分别用6×His的单克隆抗体和16-kDa单克隆抗体对表达产物进行Western印迹分析,结果显示在相对分子质量约19 000处均有特异性条带,与预计大小吻合;纯化后蛋白纯度达90%,浓度达0.8 mg/mL。结论:表达了重组可溶性Acr,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。     

PEP-1超氧化物歧化酶对大鼠脑缺血再灌注后Bcl-2的影响

目的：观察细胞穿透肽-铜,锌超氧化物歧化酶（PEP-1-SOD1）预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的改善作用及其脑保护机制。方法：线栓法建立大鼠局灶性脑缺血6h后再灌注损伤模型,进行神经行为评分,并通过HE染色在光镜下观察神经细胞损伤变化,免疫组化法检测B细胞淋巴瘤基因-2（B—celllymphoma-2,Bcl-2）蛋白的阳性表达。结果：盐水对照组（缺血再灌注组或模型组）神经障碍显著高于假手术组（P〈0．05）,与模型组相比,PEP-1-SOD1预处理组可降低神经障碍评分（P〈0．05）;光镜下,假手术组神经细胞结构正常,PEP-1-SDO1预处理组和缺血再灌注组均有不同程度的缺血再灌注损伤,PEP-1-SOD1预处理组较缺血再灌注组损伤轻;假手术组Bcl-2蛋白表达极弱,缺血再灌注组和PEP-1-SOD1预处理组在脑缺血再灌注后6h在缺血半暗带周围出现Bcl-2蛋白阳性表达,24h达到高峰,48h表达开始减少。与假手术组相比,PEP-1-SOD1预处理组和缺血再灌注组Bcl-2蛋白阳性细胞数显著增多（P〈0．05）;与缺血再灌注组相比,PEP-1-SOD1预处理组Bcl-2蛋白阳性细胞数显著增多（P〈0．05）。结论：PEP-1-SOD1对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有保护作用,PEP-1-SOD1可通过上调Bcl-2蛋白的表达发挥脑保护作用。     

结核分枝杆菌ESX-1分泌蛋白EspB结构和功能分析

结核分枝杆菌作为肺结核病的病原菌,在人类中致死率远高于其他病原菌.结核分枝杆菌具有特殊的疏水性细胞壁结构,这种致密的细胞壁结构帮助结核分枝杆菌抵御外界环境压力和来自宿主细胞的毒素.同时,它利用特殊的分泌系统将体内的毒力蛋白输出体外,ESX-1分泌系统就是其中之一.结核分枝杆菌ESX-1系统在结核分枝杆菌进入宿主细胞吞噬小体、逃逸至细胞质以及杀死吞噬细胞这些过程中发挥重要作用.研究表明,在结核分枝杆菌内膜上存在一个由多亚基组成、旨在帮助结核分枝杆菌向外输送分泌蛋白的分泌装置.在这个分泌装置的帮助下,结核分枝杆菌重要的毒力蛋白ESAT-6跨内膜向外分泌,EspB也通过这个内膜上的分泌装置被转运至胞外.EspB存在于静置培养的结核分枝杆菌的胶囊层中,也可在振荡培养的结核分枝杆菌的培养液中被检测.通过X射线晶体衍射分析,我们解析了EspB的晶体结构,相比于其他同源结构,发现了EspB的不同构象,即EspB单体能够自组装成为七聚体的规则结构,联系其与毒力因子ESAT-6具有共分泌的特点,七聚体构象的发现为解释EspB在结核分枝杆菌向外分泌蛋白的过程中发挥的作用提供线索,即EspB具有锚定在结核分枝杆菌胶囊层中,作为运输ESAT-6的孔道而存在的可能.     

P_(53)突变、表达及人乳头状瘤病毒感染与宫颈癌

利用免疫组化、聚合酶链反应(PCR)、单链构象多态性(SSCP)分析等方法, 对49例同一标本宫颈癌组织中p53蛋白、P53外显子7～8变异、HPV6、11、16、18-DN A进行检测,以探讨它们在宫颈癌形成中的作用、相互关系和临床意义.结果表明: a.P5 3基因外显子7～8突变率14.29％、p53蛋白阳性率48.98％、HPV-DNA阳性率87.76％.b.P53基因突变不一定伴有p53蛋白阳性,但P53基因突变而p53蛋白阴性的标 本必是HPV-DNA阳性;91.67％的p53蛋白阳性标本具有HPV-DNA阳性.c.HPV16-DNA阳 性率显著高于HPV6、11、18-DNA阳性率.证明：宫颈癌的发生主要与HPV16感染有关,其 次是P53基因突变所致;p53蛋白阳性由HPV感染和/或P53基因突变所致.     

结核分枝杆菌早期分泌蛋白ESAT-6家族的研究进展

ESAT-6家族蛋白是结核分枝杆菌早期分泌蛋白中具有较强免疫原性的成分之一。卡介苗中缺乏该家族的一些重要成分。近年对其分布。结构,免疫学特征以及生物学用途方面的研究较多。该蛋白在作抗结核分枝杆菌亚单位疫苗的候选抗原,DNA疫苗的候选基因以及作为结核分枝杆菌感染的免疫学诊断试剂等领域体现出良好的研究及应用前景。     

缺血再灌注对大鼠肾脏足细胞podocin的表达影响及意义

目的:观察SD大鼠缺血再灌注肾损伤足细胞表面相关蛋白(podocin)表达的变化,探讨podocin分子在足细胞损伤中的作用.方法:60只雄性SD大鼠随机分为假手术组(S组)30只和模型组(M组)30只,各组又分为lh、3h、6h、12h、24h、48h六个亚组,每个亚组各5只.采用Westemblot蛋白印迹法检测肾皮质足细胞podocin蛋白表达.并观察各组血肌酐、尿素氮的变化.结果:与S组相比,肾缺血再灌注损伤后,M组尿素氮于6h开始升高,且48h达高峰(P＜0.05);血肌酐48 h才升高(P＜0.05).Podocin 蛋白在3h表达开始下降,以后随缺血再灌注时间的延长podocin蛋白的表达逐渐下降,且48h组下降最明显(P＜0.01).结论:(1)缺血再灌注肾损伤时大鼠肾功明显发生改变,尿素氮早期开始升高,血肌酐晚期升高明显,说明造模成功.(2)大鼠肾脏足细胞podocin的蛋白表达随着缺血再灌注时间的延长而改变,早期下降不明显,3h组开始逐渐下降,48h组下降最明显.此结果表明podocin蛋白在肾脏缺血再灌注肾损伤表达减少.我们可以推想在缺血再灌注肾损伤时,podocin随缺血时间延长而表达逐渐减少的同时,也破坏了与足细胞相关蛋白之间的联系,这种关系的破坏最终导致足细胞受损.通过对足细胞表面蛋白podocin的研究,对将来肾脏足细胞损伤的防治提供新的思路.     

分枝杆菌Lsr2蛋白的结构、功能及其与结核病防控

结核病是由结核分枝杆菌(M.tuberculosis,M.tb)感染引起的传染病,目前对于结核潜伏感染状态的维持和防止再激活成为结核病防控的关注热点和研究方向。Lsr2属于M.tb中的拟核结合蛋白,具有H-NS样结构域,在M.tb对氧浓度变化的适应中具有重要作用。作为一个全局性的转录调控因子,Lsr2调控结核分枝杆菌的蛋白表达,参与潜伏感染状态的维持,并可能成为针对活动性结核病和结核潜伏感染的候选靶抗原。现围绕Lsr2的生物学特性和在结核病防控中的意义进行论述。     

脑缺血再灌注损伤大鼠血浆蛋白C活性变化的研究

目的探讨脑缺血再灌注损伤大鼠血浆蛋白C活性的变化及其检测意义。方法取SD大鼠30只,随机分为正常对照组(NC组)、假手术组(SH组)及脑缺血再灌注模型组(IR组),每组10只。线栓法制备左侧局灶性脑缺血再灌注模型,缺血2 h,再灌注24 h,神经功能缺损评分后,右侧颈总动脉取血,离心后取血浆50μl,于-20℃冰冻保存,发色底物法检测蛋白C活性;余血浆2 h内检测凝血功能各指标。结果 IR组大鼠蛋白C活性较NC组及SH组明显降低(P0.01),SH组PC活性较NC组也降低(P0.05);IR组较NC组及SH组PT、APTT明显降低(P0.01),FIB显著增高(P0.01)。结论脑缺血再灌注损伤后PC活性明显改变,检测血浆PC活性的变化对缺血再灌注脑损伤的早期诊断与治疗监测具有重要意义。     

结核分枝杆菌Rv1385的抗原表位预测分析

结核分枝杆菌生长缓慢,难以获得足量的天然蛋白抗原。而利用基因工程技术制备重组蛋白抗原,存在着表达量低、不易纯化,以及特异性较低等不利因素。随着生物信息技术的发展,研究者可根据生物信息学软件预测,选择合成优势抗原肽段,而不需克隆整个蛋白,具有简便、经济、特异性高等特点。因此,本研究应用生物信息学方法,预测结核分枝杆菌Rv1385蛋白的抗原表位并分析其优势表位,对了解Rv1385蛋白的免疫学特性及其与结核分枝杆菌致病的关系具有重要意义。首先,从NCBI数据库下载Rv1385的氨基酸序列,然后采用生物信息学软件PSIPRED Server预测蛋白质二级结构;BepiPred 1.0 Server和ABCpred预测该蛋白的B细胞抗原表位;BIMAS、SYFPEITHI及NetCTLpan 1.1 Server预测该蛋白的CTL表位;SYFPEITHI和NetMHCIIpan 3.2 Server预测该蛋白的Th细胞表位。最后综合分析预测结核分枝杆菌Rv1385的优势候选抗原表位。结果显示,Rv1385蛋白二级结构中,α螺旋占51.8%,β折叠占41.6%,无规卷曲占6.6%;共有4个B细胞抗原位点,位于109～124、152～169、178～192、198～209氨基酸区段;3个CTL表位,位于263～271、87～95、240～248氨基酸区段;5个Th表位,位于77～91、87～101、234～247、70～84、46～60氨基酸区段。生物信息学分析显示Rv1385含有潜在的B细胞和T细胞抗原表位,为该蛋白抗原表位的进一步研究及应用奠定了基础。     

P16、P27蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达及意义

目的为探讨P16、P27蛋白在食管鳞状上皮、增生上皮和癌变上皮中表达状况及其与鳞状细胞癌发生、进展和转移的相关性.方法采用SP免疫组织化学方法,检测72例(其中活检标本13例)食管癌组织中P16、P27蛋白的表达情况.结果 P16、P27在食管癌和增生性上皮均有阳性表达,但两者相比均无统计学意义(P>0.05),在正常上皮组均无阳性表达;P16、P27在高分化鳞癌组阳性表达率均显著高于低分化鳞癌组(P<0.05);P16、P27在伴有淋巴结转移的食管癌组与不伴有淋巴结转移组比较差异显著(P<0.05).P16在原发食管癌组阳性表达率和淋巴结转移癌中比较具有显著性差异(P<0.05).结论 P16、P27基因蛋白在食管癌组织中的表达与病理分化程度有关;P16的表达与转移癌的形成有关;P16、P27表达与患者性别、年龄、肿瘤发生部位、浸润深度无明显相关性.     

结核分枝杆菌FtsZ的异源表达及酶学性质研究

作为细菌分裂所必需的微管蛋白类似物,丝状温度敏感蛋白Z(filamentous temperature-sensitive protein Z,FtsZ)被认为是一个具有潜力的药物作用新靶点。为了构建高纯度的FtsZ重组蛋白分离纯化体系,探讨其酶学性质,该研究利用大肠杆菌BL21异源表达结核分枝杆菌FtsZ重组蛋白,通过Ni亲和层析柱和G-50层析柱纯化目的蛋白,采用孔雀石绿法和90°光散射法测定FtsZ重组蛋白的GTP酶活和蛋白聚集。研究结果表明:成功获得具有生物学活性的结核分枝杆菌FtsZ重组蛋白,其相对分子质量约为49kD;该酶最适反应温度为37℃,最适pH为6.8,金属离子Mg~(2+)和K~+对FtsZ重组蛋白酶活具有促进作用,有机溶剂DMSO和TritonX-100的体积分数分别高于0.1%和0.005%时对酶活有显著抑制作用(P0.05)。此外,FtsZ重组蛋白在加入底物GTP诱导后,快速聚集。本实验利用基因工程技术成功获得具有生物活性的FtsZ重组蛋白,并明确了该蛋白质的酶学性质,为其进一步的研究和应用奠定了基础。     

福建东山短枝木麻黄小枝氮磷含量及其再吸收率季节动态

对福建东山赤山林场短枝木麻黄纯林小枝中的N和P含量、N ∶ P比、养分再吸收率的季节动态进行研究.结果表明,随着小枝的成熟和衰老,各季节N和P的含量依次降低,其中衰老小枝中N和P含量分别为(3.97±0.21)～(8.64±0.58) mg · g~(-1)和(0.04±0.03)～(0.10±0.03) mg · g~(-1),基本上表现为N和P的完全再吸收.成熟小枝N ∶ P比的季节动态介于(18.67±3.24)～(37.98±1.32)之间,均高于16,表明木麻黄的生长受到不同程度的P限制.N、P再吸收率的季节变化分别为(51.02±4.66)%～(63.00±8.61)%和(81.24 ±5.08)%～(91.78±5.84)%,P再吸收率显著高于N.N和P的再吸收率之间以及成熟叶中N、P含量与二者再吸收率之间没有显著相关性,但在衰老叶中存在显著负相关,表明养分再吸收程度越高,其再吸收率就越高.因此,木麻黄通过小枝衰老过程中的养分再吸收,减少养分的损失,从而适应贫瘠的立地条件.     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1Ab16的克隆及表达

通过对已知cry1类基因以及已发表的cry1Ab的序列进行分析,分别设计了引物P1、P2、P3和P4,首次从无晶体的芽胞杆菌AC11中扩增到一个苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein, ICP）cry1Ab类基因。测序结果显示该基因与已知的cry1Ab1基因有8个核苷酸不同,编码的蛋白有7个氨基酸差异。此基因已登录GenBank,并命名为新亚型基因cry1Ab16 (Ac. NO. AF375608)。Southern杂交结果进一步证实该基因存在于菌体的质粒上。将cry1Ab16基因克隆到Escherichia coli表达载体pQE30上并转化E. coli M15。Western印迹分析表明,E. coli M15表达了130 kD的Cry1Ab16蛋白,但此蛋白不稳定,大部分降解成65 kD的蛋白。将表达Cry1Ab16 蛋白的大肠杆菌用涂布法对三龄小菜蛾（Plutella xylostella）毒力测定,其LC50为258.3mg/L;对其他夜蛾科害虫的生长发育也有明显的抑制作用。     

结核分枝杆菌16kDa与GST融合表达及纯化

目的:构建融合表达GST和结核分枝杆菌16kDa蛋白的表达系统,摸索表达条件及制备方法.方法:根据16kDa蛋白的基因序列设计引物,从结核菌基因组DNA中扩增该基因,酶切后插入表达载体,测序证实后转入大肠杆菌JM109菌株,经IPTG诱导表达,产物经谷胱甘肽-琼脂糖凝胶法纯化.结果:16kDa基因产物大小、酶切片断大小和载体的大小与设计一致、16kDa基因测序的结果与目的基因完全符合.表达纯化的蛋白的大小与蛋白质分子量标准相比较一致.结论:构建的表达载体成功,纯化的蛋白即为目的蛋白.     

噬菌体phi29末端酶gp16蛋白C端结构域在溶液中的构象分析

噬菌体phi29是一种双链DNA病毒,它的增殖和成熟过程需要将较大的子代DNA包装入一个空间极其有限的新生病毒衣壳中,这一步骤由其转运马达完成.转运马达具有三个部分:头颈连接器蛋白(the connector)、pRNA和ATP水解酶蛋白(gp16).在结构预测中发现gp16蛋白的C端结构域可能与pRNA或DNA结合,但尚未有相关文献可以证明这种相互作用,因此其结构的解析成为研究其功能的关键.本文利用大肠杆菌SUMO表达系统,对噬菌体phi29 gp16蛋白的C端结构域进行重组构建并诱导表达后,通过Ni-NTA亲和层析纯化,再用分子排阻色谱获得高纯度的目的蛋白质单体,纯度达到95%左右.最后用X射线小角散射技术(small angle X-ray scattering)对其构象进行分析,收集小角散射数据,当目的蛋白的浓度为1.3 g/L、所得到的目的蛋白的三维结构与同源蛋白FtsK的晶体结构高度拟合,且通过CRYSOL软件反推计算的曲线与实验曲线高度重合.通过原核表达、纯化及结构分析,成功获得了该结构域在溶液中的状态信息.这一研究不仅为后续关于该结构域的功能研究奠定基础,也为病毒感染的诊断和治疗提供新思路.     

重组蛋白的体外再折叠

重组蛋白的再折叠是基因工程下游处理中非常重要的环节。本文在分析了蛋白体外折叠的机制后,指出了重组蛋白再折叠的一般策略,并综述了近年来的主要新方法,包括：分析伴侣介导的再折叠去污剂协助的再折叠,反向微团中的蛋白再折叠,折叠促进剂的添加以及再折地促进二硫键形成的方法 。     

对淤血再灌注肠神经组织损伤机制的探讨

目的:建立大鼠肠淤血再灌注动物模型,探讨淤血再灌注肠神经组织损伤的机制,为临床相关疾病的诊断、治疗提供理论依据.方法:成年Wistar大鼠60只,雌雄不限,随机分为正常组、对照组和实验组,每组20只.实验组采用阻断门静脉1h后开放的方法建立大鼠小肠淤血再灌注模型,对照组只进行同样腹部手术操作但不夹闭门静脉,正常组不手术.6小时后取各组下腔静脉血,测定血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的含量,然后处死动物,取距回盲部15厘米处肠管1厘米,采用伊红-苏木素(HE)染色观察肠粘膜组织形态学变化;用免疫组织化学方法观察正常组、对照组和实验组小肠壁肠神经组织中微管相关蛋白2(MAP-2)的表达情况.结果:HE染色可见,正常组、对照组为正常肠道管壁结构,实验组肠壁各层有比较明显的淤血、出血,小肠绒毛固有层水肿,黏膜上皮有脱落、坏死;实验组MAP-2的表达明显低于正常组及对照组(P＜0.05);与正常组及对照组相比较,实验组SOD活性明显降低(P＜0.05),MDA的含量则明显升高(P＜0.05).结论:肠淤血再灌注可能导致肠道神经元数量减少,其机制可能与肠淤血再灌注造成的自由基损伤和脂质过氧化有关.     

缺血后处理对肺缺血／再灌注损伤的保护作用及其机制

目的：探讨缺血后处理（聃）是否通过抑制P38丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）活化来减轻再灌注损伤肺细胞的凋亡。方法：雄性SD大鼠40只,随机分成5组（n=8）,即对照组（C组）、肺缺血／再灌注组（I／R组）、肺缺血／再灌注＋缺血后处理组（IPO组）、缺血后处理＋溶剂对照组（D组）、缺血后处理＋SB203580组（SB组）。各组分别于再灌注2h留取左肺组织,检测肺组织湿／干重比（W／D）和总肺含水量（TLW）;光镜观察肺组织形态学结构改变并进行肺组织损伤定量评估（IQA）;原住末端标记法（TUNEL）检测肺细胞凋亡情况并计算凋亡指数（AI）;RT-PCR和免疫组化法测定Bax、Bcl-2基因和蛋白的表达。结果：与C组相比,I／R组W／D、TLW、IQA和AI均显著升高（P〈0．05,P〈0．01）,肺组织结构发生明显损伤;Bcl-2、Bcl-2／Bax基因及蛋白表达明显降低,Bax基因及蛋白表达明显升高（P〈0．05,P〈0．01）;IPO组、D组、SB组与I／R组相比,w／D、TLW、IQA和AI均显著降低（P〈0．05,P〈0．01）,肺组织结构损伤情况有所改善;Bcl-2、Bcl-2／Bax基因及蛋白表达明显升高,Bax基因及蛋白表达明显降低（P〈0．05,P〈0．01）;D组与IPO组比较各项指标均无明显差异（均P〉0．05）;SB组与IPO组相比,肺组织W／D、TLW、IQA和AI均显著降低（P〈0．05,P〈0．01）,肺组织结构未见明显损伤;Bcl-2、Bcl-2／Bax基因及蛋白表达明显升高,Bax基因及蛋白表达明显降低（P〈0．05,P〈0．01）。结论：I／R通过激活P38MAPK导致大鼠肺泡结构严重破坏,肺内细胞大量凋亡;IPO可能是通过抑制P38MAPK通路的激活而减轻L／R损伤。