微小染色体维系蛋白3基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的:制备地高辛标记的微小染色体维系蛋白3(MCM3)基因的RNA探针,研究MCM3在斑马鱼早期发育中的时空表达。方法:收集并固定受精后24 h时期的野生型斑马鱼胚胎,提取总RNA,制备DIG标记的MCM3 RNA反义探针,整胚原位杂交,研究MCM3在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达。结果:斑马鱼的MCM3氨基酸序列与小鼠、人具有高度同源性,通过不同时期胚胎的原位杂交,发现MCM3在早期发育过程中普遍性表达,胚胎受精后0~2 hMCM3在增殖性区域泛表达,受精后14~22 h在中枢神经系统、发育未成熟的眼部、体节及增殖性区域表达,受精后24 h在血液、中枢神经、翼板中脑、视觉盖及增殖性区域表达,受精后48 h在头部及肛门增殖性区域表达。结论:明确了MCM3在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式,证明其与早期斑马鱼发育细胞增殖密切相关,为研究该基因功能提供了一定的理论基础。     

银鲫pou2基因在胚胎发育过程中的时空表达图式

用RACE-PCR方法从原肠期SMART文库中扩增到银鲫pou2基因的全长cDNA,其全长为2421bp,开放阅读框为1416bp,编码471个氨基酸,与斑马鱼pou2基因的氨基酸序列一致性高达91.0%。我们用RT-PCR和整体原位杂交的方法研究了银鲫pou2基因在胚胎发育过程中的时空表达图式。RT-PCR结果显示,银鲫pou2基因有母源转录本,其合子基因在高囊胚期强烈表达,在50%下包期和90%下包期也有高量的转录本,但在100%下包期表达量急剧降低,至体节期时已经完全检测不到其转录本。胚胎整体原位杂交结果显示其母源转录本在所有的胚盘细胞中。在高囊胚期和50%下包期,高度表达的合子转录本仍在所有的胚盘细胞中,但至90%下包期时,pou2的表达向胚胎背部的正中线汇聚,集中在神经板的两侧区域和脑部的两条横向条带。在100%下包期时,pou2的表达集中在神经板的中间区域以及预期形成的中后脑区域。至体节期时,转录本消失,这与RT-PCR结果高度一致。银鲫pou2基因的表达图式提示该基因在胚胎发育的早期具有重要作用,它可能参与调控神经板的形成和中后脑细胞的发育命运。     

斑马鱼胚胎发育过程中TGF-1基因的表达特征分析

为研究转化生长因子 (Transforming growth factor , TGF)1对斑马鱼胚胎发育的调控作用, 通过NCBI获得TGF-1基因序列, TGF-1 cDNA全长1571 bp, 编码377个氨基酸。系统进化树分析发现, TGF-蛋白按照不同的类型严格聚类, 斑马鱼TGF-1与其他鱼类的TGF-1聚集到一个分支, 在进化中非常保守。对斑马鱼胚胎进行RT-PCR和Real-Time PCR检测显示, TGF-1基因为母源表达基因, 在分节期之前的表达水平比较低, 而从咽囊期开始持续高水平的表达。胚胎整体原位杂交发现, TGF-1基因在斑马鱼24 hpf 胚胎中开始有特异信号出现, TGF-1基因的表达主要分布在腮弓、侧线原基、耳囊、嗅觉基板、心脏和前肾等处, 表明TGF-1基因可能参与斑马鱼胚胎免疫调节、循环系统发育和侧线形成。用低氧处理斑马鱼胚胎, 发现低氧处理24h后斑马鱼胚胎发育延迟。利用Real-Time PCR和胚胎整体原位杂交检测发现, 低氧处理后发育延迟的斑马鱼胚胎中TGF-1 mRNA表达量较常氧组显著降低。以上结果表明, TGF-1基因参与斑马鱼胚胎发育调控, 并且可能与低氧处理后斑马鱼胚胎发育延迟有关。研究结果将为深入研究斑马鱼TGF-1基因的功能奠定基础。       

Smad2/3a对斑马鱼神经嵴细胞标记基因crestin表达的影响

目的 探讨Smad2/3a对脊椎动物神经嵴细胞发育的影响。方法 通过在斑马鱼胚胎单细胞时期显微注射smad2/3吗啉环修饰的反义寡核苷酸的方法,特异性敲降smad2/3基因的表达,至胚胎发育至6体节,利用整胚原位杂交检测神经嵴细胞特异性标记基因snail1b,sox10,foxd3和crestin的表达情况;通过casmad2 mRNA和smad3a mRNA显微注射的方法过表达smad2和smad3a,同样利用整胚原位杂交检测神经嵴细胞特异性标记基因crestin的表达情况;通过过表达casmad2及smad3a对下调smad2和smad3a的胚胎进行挽救。结果 smad2/3a被敲低后,crestin的表达量显著降低,而snail1b,sox10和foxd3的表达量无明显变化。smad3b被敲低后,crestin,snail1b,sox10和foxd3的表达量均无明显变化;过表达casmad2和smad3a均可导致crestin的表达量增高;过表达casmad2和smad3a可挽救由于smad2/3a敲降所造成crestin的低表达量。结论 Smad2和Smad3a对神经嵴细胞标记基因crestin的表达具有重要作用。     

反义抑制和过表达miR-219引起斑马鱼胚胎发育异常

业已表明,miRNA在转录后水平对基因表达起调控作用,参与诸多重要的生理、病理过程。本研究利用整体原位杂交和Northern杂交技术发现miR-219主要从16体节期开始在中后脑和脊髓表达。在此基础上,采用基因沉默和过表达技术观察到斑马鱼受精卵在显微注射miR-219和反义miR-219后均导致其胚胎发育缺陷。进一步研究表明,miR-219过表达可以诱导胚胎细胞凋亡。我们的初步结果为深入研究miR-219在胚胎发育过程中的调控机制提供了基础。     

ripply1在斑马鱼早期胚胎背腹发育中的作用

目的探究ripply1基因在斑马鱼早期背腹轴发生过程中的作用。方法利用斑马鱼整封原位杂交技术揭示ripply1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达模式,通过显微注射技术在胚胎1细胞期注射ripply1的mRNA来高表达Ripply1蛋白并在后期观察胚胎背腹标记基因的变化及胚胎形态变化。利用Tol2转基因技术构建ripply1启动子驱动的GFP转基因鱼。结果原位杂交结果显示ripply1基因在斑马鱼原肠早期胚盾期特异表达在胚盾处,即预定的背部。高表达ripply1后,在胚盾期背部标记基因表达范围扩大,腹部标记基因表达减弱,受精后24小时胚胎表现出严重的背部化表型:头部增大,腹部卵黄延伸减弱,尾部躯干及尾部区域减少,有的甚至形成了第二个体轴。得到的转基因鱼揭示ripply1母源表达,并且转录起始位点上游1200个碱基驱动的GFP能模拟内源基因的表达图式。结论 ripply1可能参与斑马鱼胚胎早期背腹轴的发生。     

FLT4 基因在斑马鱼早期发育过程中的表达

目的:研究FLT4(VEGFR3)基因在斑马鱼早期发育过程中的表达。方法:提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备地高辛标记的FLT4RNA反义探针,WISH(整胚胎原位杂交)研究FLT4在斑马鱼早期发育过程中的表达。结果:成功合成FLT4基因探针,获得FLT4基因在斑马鱼早期发育过程中的表达情况:FlT4在2-cell、32-cell、oblong、shield期前普遍性表达(0.75h、1.7h、3.7h、6h);24h在头部表达较多,特别是在ICM(intermediate cell mass,中间细胞群)区处有特异性表达;48h、72h在头部表达均较高表达。结论:FLT4在早期参与了血管的形成和造血的发生,在脑部和肾小管的发育中可能起到了重要作用。     

Rspo1调控斑马鱼胚胎汇聚延伸运动的研究

Rspo1 (R-spondin 1)是分泌型Rspos (R-spondins)蛋白家族的成员,在雌性发育、血管生成和癌症等多个方面具有调控作用。为了研究Rspo1在早期胚胎发育中的功能,以斑马鱼(Danio rerio)作为模式生物,利用反转录PCR及原位杂交技术检测rspo1基因的时空表达模式;通过显微注射rspo1 mRNA或rspo1反义寡核苷酸(Morpholino, MO)对rspo1进行过表达或敲降;通过形态观察及原位杂交技术检测胚胎汇聚延伸(Convergence and extension, CE)运动是否正常;利用荧光素酶活性检测实验测定Wnt/PCP信号通路活性水平;通过蛋白印迹法检测表征Wnt/PCP信号通路活性的磷酸化JNK (Jun N-terminal kinase)蛋白的水平。结果显示:rspo1为母源基因,在12hpf前胚胎中呈全身性表达, rspo1的过表达或敲降均影响胚胎的CE运动;过表达rspo1降低Wnt/PCP信号通路报告质粒的活性,而敲降rspo1则增加其活性,与之相一致, rspo1敲降的胚胎中磷酸化JNK的水平显著升高;此外, rsp...     

斑马鱼 HO1 基因的表达特征及功能研究简

实验对血红素加氧酶1(HO1)在斑马鱼发育中的功能进行了研究。多重序列比对结果显示,斑马鱼HO1与哺乳类、鸟类及其他鱼类的HO1氨基酸序列的总体相似性为44.1%—86.8%,血红素结合标签相似性为87.5%—95.8%。对斑马鱼早期胚胎和成鱼各组织进行RT-PCR检测,结果显示HO1转录本母源存在,HO1mRNA的表达水平在尾芽期前较低,到咽囊期迅速上升并稳定在较高水平。HO1基因在斑马鱼成鱼多个组织中均有表达,在肝脏、脾、鳃、肾中的表达量较高。WISH结果显示,HO1基因在斑马鱼胚胎的卵黄合胞层、眼和血液中的表达量较高。利用超表达和基因敲降技术发现,注射HO1 mRNA使HO1基因过表达对斑马鱼早期胚胎发育无明显影响。注射HO1 MO使HO1基因表达抑制可导致斑马鱼胚胎出现发育迟缓、围心腔水肿、尾部消失等不同程度的畸形。HO1 MO导致的斑马鱼胚胎发育异常可被HO1 mRNA回复。利用Real-Time PCR研究发现,HO1基因表达抑制可导致IGF1表达量显著下降,IGFBP1表达量显著升高。这些结果表明斑马鱼HO1基因可通过调节IGF信号途径调控胚胎的正常发育。     

斑马鱼HO1基因的表达特征及功能研究

实验对血红素加氧酶1（HO1）在斑马鱼发育中的功能进行了研究。多重序列比对结果显示,斑马鱼HO1与哺乳类、鸟类及其他鱼类的HO1氨基酸序列的总体相似性为44.1%86.8%,血红素结合标签相似性为87.5%95.8%。对斑马鱼早期胚胎和成鱼各组织进行RT-PCR检测,结果显示HO1转录本母源存在,HO1 mRNA的表达水平在尾芽期前较低,到咽囊期迅速上升并稳定在较高水平。HO1基因在斑马鱼成鱼多个组织中均有表达,在肝脏、脾、鳃、肾中的表达量较高。WISH结果显示,HO1基因在斑马鱼胚胎的卵黄合胞层、眼和血液中的表达量较高。利用超表达和基因敲降技术发现,注射HO1 mRNA使HO1基因过表达对斑马鱼早期胚胎发育无明显影响。注射HO1 MO使HO1基因表达抑制可导致斑马鱼胚胎出现发育迟缓、围心腔水肿、尾部消失等不同程度的畸形。HO1 MO导致的斑马鱼胚胎发育异常可被HO1 mRNA回复。利用Real-Time PCR研究发现,HO1基因表达抑制可导致IGF1表达量显著下降,IGFBP1表达量显著升高。这些结果表明斑马鱼HO1基因可通过调节IGF信号途径调控胚胎的正常发育。       

斑马鱼中囊胚过渡与背腹轴特化的调控

斑马鱼中囊胚过渡是由母型基因调控转向合子型基因调控的重要发育阶段,也是背腹轴特化的重要时间节点。受精卵中的母型因子决定了胚胎背腹轴区域的早期划分,并作为上游因子活化合子型背腹轴决定基因。中囊胚过渡后伴随着母型因子的降解和合子型基因的表达,参与背腹轴特化的信号分子也发生了有序更迭。此外,Wnt/β-catenin及Wnt/IP3-Ca~(2+)信号通路都参与了背腹轴特化,其中Wnt/β-catenin信号通路中的组分在中囊胚过渡前后均有存在,但在中囊胚过渡前或中囊胚过渡后将其过表达造成的背腹方化效应却绝然相反,更提升了中囊胚过渡在背腹轴特化进程中的特殊性。本文将围绕近年有关斑马鱼中囊胚过渡前后的母型及合子型调控因子、信号转导机制及生物学功能等研究进展作一综述。     

斑马鱼pax2a(-3.1 kb):eGFP转基因品系的构建

为了更好地了解脊椎动物肾脏的早期发育,本研究利用斑马鱼这一研究脊椎动物器官发育的理想模式生物,通过构建肾脏特异性pax2a荧光标记转基因品系以实现实时在体地观察斑马鱼前肾的发育过程。我们分析了斑马鱼pax2a基因的启动子,扩增出其翻译起始位点上游3.1 kb的基因组DNA,利用Tol2转座子系统,经胚胎显微注射及三代筛选,成功构建了一个稳定的pax2a(-3.1 kb):eGFP转基因鱼品系。此转基因品系的绿色荧光蛋白在3体节时期就可以标记出中间中胚层,并在后续体节时期的中间中胚层前端(第3体节至第5体节对应的部分),及24 hpf的肾管前端和中段表达,基本模拟了pax2a在斑马鱼早期前肾发育中的时空表达模式。本研究所获得的pax2a(-3.1 kb):eGFP弥补了已有pax2a转基因品系中报告基因无法准确标记出中间中胚层和前肾管前端的缺陷,是研究斑马鱼前肾早期发育的良好材料。     

斑马鱼ca15b的克隆及在原始生殖细胞中的特异表达

高保真PCR克隆获得了ca15b基因的全长,利用胚胎整体原位杂交等技术研究了ca15b基因在斑马鱼早期发育过程中的动态表达。结果发现,ca15b在斑马鱼早期发育过程中存在显著的原始生殖细胞（Primordial germ cell,PGC）特异表达模式。ca15b是一个母源性表达的基因:在分裂期的胚胎中,其mRNA集中分布于位于分裂沟的生殖质（Germ plasm）;从囊胚期开始,可以观察到其在PGC中的特异表达;在原肠胚中,其mRNA在体细胞中急剧降解,仅特异表达于PGC,这一表达特征一直持续到受精后1d的胚胎。将体外合成的包含5'UTR和3'UTR的ca15b全长mRNA注射到斑马鱼胚胎后,仅能增强原肠期之前胚胎中ca15b的整体杂交信号;在原肠胚期之后,注射的mRNA在体细胞中快速降解。这提示在ca15b mRNA上可能存在某种转录后调控其在早期胚胎体细胞中降解而在PGC中稳定存在的机制。       

斑马鱼胚胎发育过程中FGF3基因的表达

为了解斑马鱼胚胎发育过程中FGF3基因的时空性表达情况,并探讨其对胚胎发育的调控作用,该研究分别提取2,4,8,12,24,36,48,72hpf斑马鱼胚胎的总RNA,经逆转录成cDNA,实时荧光定量PcR检测FGF3基因mRNA表达量;扩增FGF3基因特异片段,构建pGEM-T／FGF3基因片段重组质粒,经克隆及测序验证后,合成地高辛标记的反义RNA探针,以整体原位杂交法检测斑马鱼胚胎FGF3基因的空间性表达。结果显示：FGF3P基因在2hp胚胎就有表达,并持续至胚胎孵化,12hpf胚胎FGF3表达量达到高峰（P〈0．01）;胚胎发育过程中心表达部位以头、尾、咽弓为主。由此得出结论,FGF3主要在胚胎发育早期表达,其表达可能与胚胎脑、眼、耳、咽弓及尾部器官的发育调控有关。     

斑马鱼ca15b的克隆及在原始生殖细胞中的特异表达简

高保真PCR克隆获得了ca15b基因的全长,利用胚胎整体原位杂交等技术研究了ca15b基因在斑马鱼早期发育过程中的动态表达。结果发现,ca15b在斑马鱼早期发育过程中存在显著的原始生殖细胞(Primordial germ cell,PGC)特异表达模式。ca15b是一个母源性表达的基因:在分裂期的胚胎中,其mRNA集中分布于位于分裂沟的生殖质(Germ plasm);从囊胚期开始,可以观察到其在PGC中的特异表达;在原肠胚中,其mRNA在体细胞中急剧降解,仅特异表达于PGC,这一表达特征一直持续到受精后1d的胚胎。将体外合成的包含5′UTR和3′UTR的ca15b全长mRNA注射到斑马鱼胚胎后,仅能增强原肠期之前胚胎中ca15b的整体杂交信号;在原肠胚期之后,注射的mRNA在体细胞中快速降解。这提示在ca15b mRNA上可能存在某种转录后调控其在早期胚胎体细胞中降解而在PGC中稳定存在的机制。     

肌间刺缺失对斑马鱼骨骼发育的影响

利用斑马鱼(Danio rerio)野生型与肌间刺完全缺失突变型个体, 从骨骼染色和骨骼发育相关基因表达两方面, 初步评价了肌间刺缺失对斑马鱼骨骼发育的影响。通过骨骼染色对比观察了两种肌间刺表型个体受精后8dpf(days post fertilization, dpf)到56dpf的骨骼发育情况, 结果显示, 两种肌间刺表型除肌间刺外, 其他骨骼发育基本同步。此外, 通过qRT-PCR实验检测分析了6个骨骼发育相关基因(bmp2a、bmp4、smad1、smad4a、runx2a和sp7)在不同肌间刺表型5个胚胎发育时期(3hpf囊胚期、6hpf原肠胚期、12hpf体节期、24hpf咽囊期和72hpf孵化期)和5个胚后生长阶段(15、30、45、60和75dpf)的表达情况。结果显示:在胚胎发育时期, 野生型和突变型个体中bmp2a、bmp4、smad1、smad4a基因和突变型个体中sp7基因的表达均呈现先升后降的变化趋势, 且在体节期达到最高表达水平;野生型和突变型个体中runx2a基因和野生型个体中sp7基因则表现为逐渐上升的趋势。6个基因在囊胚期和原肠胚期表达量无显著差异, bmp2a的表达水平在体节期、咽囊期和孵化期无显著差异, 野生型个体bmp4、smad1、smad4a、runx2a基因在体节期、咽囊期和孵化期的表达水平明显高于突变型, 而sp7基因则表现为突变型明显高于野生型。胚后发育阶段 6个基因在5个生长阶段均呈现逐渐下降的趋势, 且在两种肌间刺表型间其表达仅在个别时期差异显著。综上所述, 肌间刺的缺失对斑马鱼骨骼发育表现型无显著影响, 只在胚胎发育时期影响骨骼相关基因表达水平的变化;结合骨骼染色结果, 推测肌间刺缺失对斑马鱼骨骼发育无显著影响。     

斑马鱼eomesb基因突变体的构建及其功能分析

Eomesodermin (Eomes)是T-box转录因子基因家族的成员,在脊椎动物胚胎发育、模式形成和形态发生过程中发挥重要作用.斑马鱼(Danio rerio) eomesa基因的一个点突变导致其母源合子突变体胚胎发育延迟而大量死亡,而eomesa合子突变体可正常发育至性成熟,但缺失背鳍.本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼eomesa旁系同源基因eomesb的突变体,eomesb纯合突变体不仅可正常发育至性成熟,而且鳍的发育也完全正常.q-PCR和整体原位杂交实验结果显示,eomesa和eomesb在脑部组织具有重叠的表达域,eomesb在中脑的表达略高于eomesa,故推测两基因在脑部可能行使相似的功能,存在一定的功能冗余.对2,4,6 dpf(Days post fertilization)和6 dpf的WT和突变体q-PCR基因表达分析显示,eomesb突变对eomesa的表达没有明显影响.eomesa-/-;eomesb-/-双突变体未出现背鳍缺失以外的附加表型,推测斑马鱼eomesa和eomesb在背鳍发育过程中可能不存在功能冗余,eomesb不参与背鳍的发育过程.此外,整体原位杂交实验结果显示,eomesb突变也不影响其同源基因tbr1a和tbr1b的早期表达.eomesb纯合突变体未观察到明显表型,可能与其影响的功能不引起明显表型有关,也可能与其它基因的遗传补偿效应有关.本研究结果为深入研究斑马鱼eomesb基因的功能提供了实验材料,同时对研究eomesa与eomesb基因功能分化具有参考价值.     

斑马鱼NUP98基因的克隆及其时空表达图谱

目的：斑马鱼NUP98基因的克隆及其在个体早期发育过程中的表达情况研究。方法：提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备地高辛标记的NUP98RNA反义探针,WISH（整体胚胎原位杂交）研究NUP98在斑马鱼早期发育过程中的表达;提取斑马鱼胚胎各时相和成鱼各组织的RNA,实时定量PCR检测斑马鱼胚胎各时相和成鱼各组织中的表达。结果：成功克隆斑马鱼NUP98基因,通过实时定量RT-PCR和原位杂交,获得NUP98基因在斑马鱼早期发育过程中的表达情况：NUP98在2-cell、32．cell、oblong、shield期、12h前普遍性表达（0．75h、1．7h、3．7h、6h、12h）;24h以后在眼部、头部表达较多,特别是在脊索表达较高;斑马鱼NUP98在0、0．5h、6h、12h、24h、48h表达逐渐降低,到72h和96h表达有所增加,但是仍低于24h其表达水平;NUP98在成鱼眼、脑、鳔、肾、肝、睾丸、胆囊、卵巢、鳍、心、肠、肌肉、腮、皮肤的表达中,眼的表达最高,明显高于其他组织,腮、卵巢、肠的表达次之,肌肉、鳔、胆囊、睾丸、皮肤、脑的表达紧随其后,鳍、肝、心、肾的表达最低。结论：NUP98基因可能在个体脑部、脊索及眼部的早期发育过程中起到了重要作用;NUP98基因可能具有抑制肿瘤发生的作用,该基因的调节异常对白血病的发生发展可能有重要影响。这些研究结果为进一步研究NUP98基因在造血系统中的作用,评估其是否适合作为血液系统恶性肿瘤的新的治疗靶点等奠定了理论基础。     

γ谷氨酰环化转移酶对斑马鱼早期发育的影响

γ谷氨酰环化转移酶(γ-Glutamyl cyclotransferase,GGCT)是谷胱甘肽循环过程中催化L-γ-GlutamylL-amino acid分解为L-amino acid和5-oxoprodline的关键酶,在防止细胞氧化性损伤中发挥重要作用。研究以斑马鱼为模型,利用吗啡啉(Morpholino,MO)敲降GGCT,发现早期胚胎发育出现脑部发育缓慢、尾短弯曲和环心室水肿等异常表型,原位杂交检测发现脑发育相关标记基因shha、wnt8b与fgf8的表达发生改变。体外转录ggct-m RNA与GGCT-MO共注射,畸形率降低,部分脑部标记基因表达回复正常。此外,使用化学阻断剂阻断GGCT上游的γ谷氨酰转肽酶(γ-Glutamyl transpeptidase,GGT)和下游的5羟脯氨酸酶,斑马鱼胚胎产生发育停滞和水肿表型。敲降GGCT和阻断GGT都降低了胚胎的谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的含量,研究表明γ谷氨酰环化转移酶可能通过谷胱甘肽循环在斑马鱼早期胚胎发育过程发挥重要作用。     

银鲫dmrt2b基因的分子特征及功能分析

实验克隆了银鲫dmrt2b基因的全长cDNA序列,并对其表达图式和在胚胎发育过程中的功能做了初步研究。银鲫dmrt2b和斑马鱼dmrt2b有相似的基因组结构。在胚胎发育过程中,银鲫dmrt2b主要在体节中表达。在成体中主要分布于肌肉中。注射银鲫的dmrt2b可以挽救斑马鱼dmrt2b敲降胚的表型。上述结果表明银鲫dmrt2b基因同斑马鱼dmrt2b基因有相同的功能。