固定化青霉素酰化酶生产6-APA通过中试鉴定

由中国科学院微生物研究所青霉素酰化酶组承担的国家“七五”攻关任务,经与太原制药厂、中国科学院生态环境研究中心协作进行的胞外青霉素酰化酶的筛选及固定化酶生产6-APA的研究工作,于1989年上半年完成。1989年8月28—29日,由中国科学院主持在山西省太原市召开     

固定化大肠杆菌AS1.76青霉素酰化酶的研究

用固定化青霉素酰化酶连续生产6-氨基青霉烷酸(简称6-APA)已有许多报道。近年来关于固定化微生物细胞的研究不断发展。Sato等曾用固定化的产青霉素酰化酶的细胞连续生产6-APA。我们用双功能试剂戊二醛固定化大肠杆菌AS 1.76的青霉素酰化酶,用来水解青霉素G生产6-APA。现将结果报告如下。     

温度对大肠杆菌青霉素G酰化酶基因表达的影响

含有大肠杆菌青霉素G酰化酶基因的质粒pWGA在菌株DH5α中表达时,表现为温度敏感。在30℃和37℃两种培养温度下,用Northern Blot和Western Blot研究了菌体的转录水平和翻译水平。结果表明菌体培养温度升高不影响mRNA的转录,但不利于青霉素酰化酶前体蛋白的正确加工,导致青霉素酰化酶在37℃发酵生产时酶活力单位的下降。     

渗透压冲击法快速高效提取青霉素酰化酶

青霉素在临床上的大量使用造成了细菌的耐药性增强,青霉素本身又具有不宜口服、过敏性强等缺点,人们正致力于研究有诸多优良特性的半合成青霉素。大肠杆菌青霉素酰化酶用于裂解青霉素生产6-氨基青霉烷酸(即6-ＡＰＡ,半合成青霉素的重要中间体),该酶的提取、纯化和固定化研究在半合成青霉素工业有重要的意义[1]。大肠杆菌青霉素酰化酶属胞内酶,文献报道多采用超声波法提取,该法得到的粗酶液比活低,一般要经过四、五步纯化才能得到较高比活[2,3,4]的酶液。采用渗透压冲击法提取青霉素酰化酶,得到的粗酶液比活高,只需经过硫酸铵沉淀一步纯化就…     

简讯

青霉素酰化酶水解青霉素-G生产6-氨基青霉素烷酸(6-APA)我们从9个属234株细菌中筛选出19株产青霉素酰化酶的大肠杆菌,其中AS1.76和E110两株菌的酶活较强。通过培养条件试验,选出了两种适宜的培养基。一种是玉米浆-蔗糖培养基,另一种是鱼胨培养基,     

一株产多种β-内酰胺类抗生素酰化酶菌株的筛选

为了从大量的候选菌株中快速筛选头孢菌素酰化酶产生菌,设计并合成了一系列头孢菌素酰化酶的底物类似物。这些酰胺类的底物类似物由二部分组成,一部分为与头孢菌素相同或相似的侧链,另外一部分为发色基团或便于检测的基团。它们被酰化酶水解酰胺键以后可以方便快速的检测,因此用于对大量菌株进行快速筛选。采用这些化合物筛选到6株酰化酶阳性菌株。其中菌株ZH0650能够同时水解GL7ACA和多个底物类似物。进一步研究表明,该菌至少产生3种酰化酶,ADNABA酰化酶,青霉素G酰化酶和头孢菌素C酰化酶。我们初步纯化了ADNABA酰化酶和青霉素G酰化酶,并对头孢菌素C酰化酶的活力进行了鉴定。这是首次报道的可以产生青霉素G酰化酶和头孢菌素酰化酶等多种酰化酶的菌株,具有良好的应用前景。     

一株产多种β-内酰胺类抗生素酰化酶菌株的筛选

为了从大量的候选菌株中快速筛选头孢菌素酰化酶产生菌,设计并合成了一系列头孢菌素酰化酶的底物类似物。这些酰胺类的底物类似物由二部分组成,一部分为与头孢菌素相同或相似的侧链,另外一部分为发色基团或便于检测的基团。它们被酰化酶水解酰胺键以后可以方便快速的检测,因此用于对大量菌株进行快速筛选。采用这些化合物筛选到6株酰化酶阳性菌株。其中菌株ZH0650能够同时水解GL-7ACA和多个底物类似物。进一步研究表明,该菌至少产生3种酰化酶,AD-NABA酰化酶,青霉素G酰化酶和头孢菌素C酰化酶。我们初步纯化了AD-NABA酰化酶和青霉素G酰化酶,并对头孢菌素C酰化酶的活力进行了鉴定。这是首次报道的可以产生青霉素G酰化酶和头孢菌素酰化酶等多种酰化酶的菌株,具有良好的应用前景。     

青霉素酰化酶基因的克隆与表达Ⅳ．宿主对青霉素酰化酶基因表达的影响

选用带青霉素酰化酶基因的HindI—A片段或HindI—A及其邻接的HindI—B,c片段的4种不同的质粒pPA2,pPA4,pPA 5,pPA 6分别转化于4种大肠杆菌宿主A56,c600,HBl01,Mcl000得16种转化子并测这些转化子的青霉素酰化酶活力。结果表明：同一质粒在不同宿主中青霉素酰化酶基因表达程度有明显差别,其中以A56为最高,其次是c600和Mcl000,而以HBl01为最低。在所试验的4个宿主菌中青霉素酰化酶基因表达都具温度依赖性,而且HindI—B片段对表达有相同程度的促进作用。用DNA-RNA点滴杂交试验测定青霉素酰化酶的信使RNA的量,发现同一质粒在不同宿主中信使RNA量的差异与酶活力的差异相一致。上述结果表明宿主在转录水平上影响了青霉素酰化酶基因的表达。     

青霉素酰化酶基因的克隆与表达Ⅲ、温度在转录水平调控青霉素酰化酶基因表达

高表达的基因工程菌大肠杆菌A56(pPA22)青霉素化酶基因表达对温度敏感。在37℃几乎不产生青霉素酰化酶,在28℃以下积累青霉素酰化酶,合成酶的最适温度为20—22℃,产量可达250u,100ml。当用DNA—RNA点滴杂交法定量分析RNA时,发现在37℃培养的细胞中不积累青霉素化酶mRNA,而22℃培养的细胞中相应mRNA的量是28℃培养的细胞中的5倍。同一质粒pPA22上的氯霉素乙酰转移酶的mRNA在三种温度培养的细胞中的。浓度相同。将37℃培养的细胞转移到22℃继续培养,当菌体不继续增殖时,细胞内仍无青霉素酰化酶及其mRNA的积累。上述结果表明温度在转录水平上专一地调控了青霉素酰化酶基因的表达,在37℃长时期培养的细胞中青霉素酰化酶基因被永久地关闭。     

大肠杆菌AE109青霉素G酰化酶的分离纯化及性质研究

 由发酵培养液所得大肠杆菌AE109菌体,先经高渗休克处理,继经D-苯甘氨酸-Sepharose 4B和DEAE-纤维素柱层析分离纯化得到青霉素G酰化酶,酶制品在非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈一条区带,而且可以结晶。在SDS变性条件下解离为α和β两个亚基。 酶性质的研究结果表明,由大肠杆菌工程菌AE109菌株所得青霉素G酰化酶与其亲本大肠杆菌AS1.76菌株所得青霉素G酰化酶性质相同。     

几种纤维素及无机吸附载体对青霉素酰化酶的吸附作用及其固定化

本文就几种纤维素和无机吸附载体对青霉素酰化酶的吸附作用及其固定化进行了研究,结果表明:DEAE-纤维素、EYI-纤维素、微晶纤维素、CM-纤维素、羟基磷灰石、中性氧化铝、硅藻土及粉末状膨润土对青霉素酰化酶都有很强的吸附能力,其固定化青霉素酰化酶的比活分别在1.47～19.43u/g之间,活力回收率为16.3％至84％,几种固定化酶的最适pH均较游离酶低,且其操作稳定性较好。     

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶在新型环氧载体ZH-HA上的固定化

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶共价结合在新型环氧-氨基型载体ZH-HA 上,通过对酶浓度、固定化时间、pH以及缓冲液浓度等条件的考察,确定了最优固定化条件:50 mg比活力6000 U/g的巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶蛋白和1g ZH-HA悬浮于pH 9.01 mol/L磷酸缓冲液,室温搅拌6 h,制得固定化巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶,活力2126 U/g湿载体,活力回收率7.67%.比较研究了固定化酶与原酶性质,原酶最适温度45℃,最适pH为8.0.固定化酶则分别是50℃和9.0,分别比溶液酶偏移5℃、1.0个pH单位.经过40批连续水解青霉素G钾盐,固定化巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶仍保持80%的活力,显示出良好的工作稳定性.     

固定化青霉素酰化酶的研究

将巨大芽孢杆菌胞外青霉素酰化酶通过共价键连接到醋酸纤维素载体上,制成的固定化青霉素酰化酶的表观活力达2000 u／g左右(PDAB法)。水解lO％(w／v)的青霉素G钾盐落液,使用30批,保留活力70％以上。6-氨基青毒烷酸(6-APA)总收率平均达88．37％。固定化青霉素酰化酶水解青霉素G的最适pH为9．95,最适温度为55℃,表观米氏常数为1.093×10-2mol／L,在pH 5．8-10．7,温度45℃以下酶的活力稳定。     

组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶重组大肠杆菌发酵条件研究

目的:对重组大肠杆菌组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(AfPGA)进行了发酵条件研究。方法:在摇瓶和5L发酵罐中研究了(NH4)2SO4和葡萄糖浓度对质粒的分离稳定性及青霉素G酰化酶表达的影响。结果:该工程菌质粒具有分离不稳定性,培养基中无(NH4)2SO4时发酵过程中pH和糊精水解生成葡萄糖的浓度变化较小,细胞前期(0h-12h)的生长速率降低,质粒分离稳定性和青霉素G酰化酶的表达水平提高。发酵过程中维持低葡萄糖水平可以限制细胞的生长速率,提高质粒稳定性和促进青霉素G酰化酶的合成。采用混合碳源发酵,发酵培养基含糊精2g/L,12h后以1g/L.h恒速流加葡萄糖至35h,控制流加过程葡萄糖浓度0.1g/L左右,平均比生长速率为0.06h-1,发酵结束时质粒稳定性为86%,青霉素G酰化酶的表达水平达23 000U/L。结论:重组大肠杆菌组成型表达青霉素G酰化酶的研究对工业生产有一定指导意义。     

粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在大肠杆菌中组成型表达及分离纯化

将粪产碱杆菌青霉素G酰化酶基因构建重组表达质粒pKKFPGA ,pKKFPGA再转化宿主菌DH5α,所得重组菌不需诱导便能高效表达青霉素G酰化酶 ,表达量达 2590u L ,比野生型粪产碱杆菌表达量高432倍 ,其菌体比活力达300 (u L) A₆₀₀。菌体破碎后的上清液经DEAE-SepharoseCL 6B离子交换层析和Butyl-SepharoseCL 4B疏水层析 ,即可得纯度提高 20倍、比活为 686u mg的青霉素G酰化酶 ,两步纯化的总收率达 91%。Western印迹分析表明5%的原前体青霉素酰化酶在胞内形成了包涵体 ,说明其成熟的限速步骤在胞内的运输阶段.     

青霉素G酰化酶工业进化的研究进展

青霉素G酰化酶是近几十年来β内酰胺类抗生素领域应用最广、开发最成功的酶之一。伴随着β-内酰胺类抗生素由化学合成法变更为酶法在中国的大规模产业化,得到了充分的开发与应用,取得了成功。青霉素G酰化酶不但用于水解制备6-APA、7-ADCA,更重要的是用于氨苄西林、头孢氨苄、阿莫西林、头孢拉定、头孢克洛等抗生素的制备。本文综述了近15年青霉素G酰化酶在我国研究与应用的历史沿革、基因与蛋白质结构、工业应用表达体系、工业评价标准与进化研究,还对各种突变株在具体医药工业领域的开发应用进行了综述,旨在梳理青霉素G酰化酶结构与性能的进化趋势以及在医药工业领域取得的巨大成就,同时也为相关人员在此领域进行深耕提供参考。     

重组毕赤酵母产青霉素G酰化酶的分批发酵动力学研究

构建了重组毕赤酵母产青霉素G酰化酶的分批发酵动力学模型。实验考察了分批发酵过程中甘油消耗、甲醇浓度、菌体浓度、溶氧、补料时间对青霉素G酰化酶活力的影响。应用Matlab软件,对菌体生长、基质消耗和产物生成方程进行最优参数估算和非线性拟合,得到相应的动力学模型。模型的计算值与实验值能较好地拟合,表明所建模型能较好反映重组毕赤酵母产青霉素G酰化酶的分批发酵过程。     

大肠杆菌AS1.76青霉素G酰化酶基因的克隆和定位

通过DNA体外重组,由E. colt AS 1.76菌株染色体DNA获得了青霉素G酰化酶基因克隆。测定了pPGA20质柱的限制性内切酶图谱,并构建了若干个pPGA2(／的变种。这些变种的酶活力及其酶切位点关系的分析结果表明,青霉素G酰化酶基因定位在 HindIII 和Sinai酶切位点之间小于2．8Kb DNA片段上。     

微波对青霉素酰化酶催化反应性能的影响

运用动力学方法研究了微波对青霉素酰化酶(pK1和pK2分别为5.69-6.06和11.56)催化反应性能的影响。结果显示:使用微波解冻档对青霉素酰化酶进行一定时间的预处理后,能够加速酶的水解反应。酶液的最适处理时间为15 s,微波处理后,酶的最适温度为从原来的37℃上升到40℃,操作稳定性基本不变。对最适微波条件处理后的青霉素酰化酶pH值依赖性催化反应进行研究,从logVm和log(Vm/Km)与pH值关系曲线计算得到该酶的pK1和pK2分别为5.66-6.55和11.05。