人I型免疫缺陷病毒gag—env嵌合基因在重组痘苗中的表达

Ｇａｇ和Ｅｎｖ蛋白是人Ｉ型免疫缺陷病毒（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １,ＨＩＶ－１）的结构蛋白,是ＨＩＶ－１诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的主要抗原。本实验通过多交亚克隆,将ｅｎｖ基因以正确的三联密码读框插入ｇａｇ基因的下游制备了ＨＩＶ－１ ｇａｇ－ｅｎｖ嵌合基因,并将嵌合基因分别置于痘苗病毒ｐ７．５启动子和牛痘病毒Ａ型包涵体（ＡＴＩ）启动子的下游,经过同源     

HIV—1结构基因与白细胞介素基因在重组痘苗病毒中的共表达研究

Env糖蛋白是决定HIV病毒粒子感染、穿入、融合及抗原性的主要结构蛋白,并且可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。Gag蛋白是HIV主要结构蛋白之一,氨基酸序列较为保守,抗源决定簇较少变异,也能够诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。利用O把蛋白研制巨分子颗粒化疫苗,可能克服env不有效抵抗异源变异毒株攻击的缺陷,这是近年来HIV疫苗研制新热点。在艾滋病的研究中,已成功地利用痘菌病毒表达了HIV－IGag、Env等蛋白。随着生物技术的发展,人们设想把细胞因子基因与某些外派目的基因在细胞中进行共表达,来增强免疫反应,现已证明多…     

EIAV env基因在痘苗病毒中的表达及其免疫效果的观察

将马传贫驴白细胞弱毒疫苗及其亲本株env基因克隆到痘苗病毒表达载体pSC65的pE／L启动子下游,通过同源重组插入到痘苗病毒天坛株基因组TK区,经蓝白斑筛选获得重组痘苗病毒rvv—DINenv和rvv—LNenv,Westem blot检测目的蛋白的表达,结果表明重组痘苗病毒能够有效表达完整的EIAV Env蛋白,其肌肉接种免疫小鼠后,表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,能够诱导机体产生有效的体液和细胞免疫应答,其中以细胞免疫效果更为显著,CTL特异性裂解最高可达28％。本研究为EIAV基因工程疫苗的开发研制奠定了基础。     

人Ⅰ型免疫缺陷病毒gag-env嵌合基因在重组痘苗中的表达

Gag和Env蛋白是人Ⅰ型免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV1)的结构蛋白,是HIV1诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的主要抗原。本实验通过多次亚克隆,将env基因以正确的三联密码读框插入gag基因的下游,制备了HIV1gagenv嵌合基因,并将嵌合基因分别置于痘苗病毒p75启动子和牛痘病毒A型包涵体(ATI)启动子的下游,经过同源重组和红细胞吸附试验筛选,获得了2株重组痘苗病毒。免疫荧光试验和酶免疫试验证明,两株重组痘苗病毒均能正确地表达HIV1gagenv嵌合基因。动物实验表明,gagenv嵌合基因重组痘苗病毒可诱导小鼠产生抗HIV特异性抗体。这些结果为艾滋病颗粒化疫苗的研制提供了借鉴。     

表达HIV-1多价合成基因的重组痘苗病毒疫苗株的构建

为研制适合我国使用的HIV疫苗,选择具有代表意义的中国流行株HIV CN54(B′/C)病毒gag、pol、nef等基因的合成基因syngpnef,插入到自行构建的能在病毒筛选过程中将标记基因去除掉的双标记基因痘苗病毒载体pVI75的KpnI酶切位点,构建成转移质粒pVI75-syngpnef,与我国的天坛株痘苗病毒共转染鸡胚成纤维细胞,通过蓝白斑筛选得到的重组病毒疫苗株DNA。经PCR鉴定标记基因已被删除并有目的基因的整合,Western blot可检测到目的基因的融合表达。此重组病毒疫苗株有望成为HIV/AIDS候选疫苗。     

HIV-1 Gag pl7-p24在痘苗病毒中的表达及性质研究

研究了重组痘苗病毒表达的ＨＩＶ－１核心蛋白（Ｇａｇ）ｐ１７－ｐ２４蛋白的些生物学及免疫学特点。间接免疫荧光、Ｄｏｔ 及ＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果表明,构建的两株重组病毒分别表达了ＨＩＶ－１Ｇａｐ ｐ２４及ｐ１７－ｐ２４融合蛋白。电镜观察证实,Ｇａｇ ｐ２４及ｐ１７－２４重组蛋白均可形成病毒样粒子。重组病毒可诱导小鼠产生抗ＨＩＶ－１Ｇａｐ ｐ２４抗体。重组病毒感染ＢＨＫ２１细胞后,可见由     

重组PAI－1在大肠杆菌中的高效表达

纤溶酶原激活物抑制因子－１（ＰＡＩ－１）在天然状态下含量很低。为了进行ＰＡＩ－１的结构与功能的研究,构建了表达重组ＰＡＩ－１的质粒ｐＢＶ２２０／ＰＡＩ－１,并在大肠杆菌中得到了高效表达。最高表达量为菌体总蛋白量的４９％以上,经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｉｎｇ检测,得到了分子量为４３．０ｋＤａ的反应条带。对形成包涵体的表达产物进行变、复性处理及Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５的初步纯化,得到了潜伏态的重组Ｐ     

用lac基因筛选表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒

为了研制基因工程狂犬病疫苗,我国于1991年首次报道了在痘苗病毒天坛株中表达狂犬病毒糖蛋白,但报道中重组病毒的选择是先经人骨髓瘤细胞(TK-143)在诱变剂5-溴脱氧尿苷(BrudR)作用下通过标记拯救技术筛选出携带有同源基因的重组病毒,然后再利用重组病毒中携带的Lac基因为选择标记,通过噬斑纯化获得重组病毒,用这种选择方式获得的重组病毒,经过了TK-143细胞和BrudR,因此不宜发展成疫苗,本研究探索不经过TK-143细胞和BrudR,仅利用Lac基因为选择标记,直接在鸡胚细胞上通过噬斑纯化获得重组病毒,现将研究结果报道如下。     

在大肠杆菌中高效表达人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)核心蛋白

将编码人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)核心蛋白(Gag)P24的大部分基因片段,插入大肠杆菌表达载体pEX31A中,获得的表达产物MS2-Gag融合蛋白占菌体总蛋白的20％左右。Western blot结果证明,这种表达产物能被艾滋病(AIDS)患者血清中的特异性抗体所识别。这是国内首次报道在大肠杆菌中高效表达人类免疫缺陷病毒Ⅰ型核心蛋白。对表达的重组核心蛋白的意义及应用前景进行了讨论。     

麻疹病毒融合蛋白(F)和血凝素(HA)在痘苗病毒中的表达

将麻疹病毒F和HA基因插入到痘苗病毒中,分别处于痘苗启动子P7.5与P11控制下,获得重组病毒vLmF和vCmH。用抗F多肽抗体和HA单抗进行ELISA检测,结果表明,两株重组病毒均能表达相应的麻疹蛋白。蛋白印迹显示重组病毒表达产物在分子大小,蛋白切割和糖化方面与麻疹病毒糖蛋白一致。两株重组病毒分别免疫家兔都能产生较高滴度的麻疹抗体,这些抗体具有中和作用和血溶抑制作用。此外,vCmH产生的抗体还具有血凝抑制作用。     

含甲肝病毒基因的重组痘苗病毒在动物体内产生针对甲肝病毒的中和抗体

用DNA重组技术得到的含甲肝病毒基因的重组痘苗病毒,可在家兔体内产生ELISA竞争抑制与中和抗体。基础免疫后,动物体内竞争抑制抗体滴度为10,加强免疫后达到80。由重组病毒产生的抗体中和指数比甲肝病毒产生者略低。     

汉滩病毒A9株M基因片段在重组痘苗病毒中的表达及鉴定

为发展国产化肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病毒基因工程疫苗,选择了汉滩病毒Ａ９株Ｍ基因片段为目的基因,构建转染质粒ｐＪＳＢＡ９Ｍ。以携带Ｌａｃ基因的重组病毒为亲本,使表达载体ｐＪＳＢ－Ａ９Ｍ上的Ｍ片段与痘苗病毒内的Ｌａｃ基因重组,将Ｌａｃ置换成Ａ９Ｍ片段。用蓝白斑法筛选重组痘苗病毒,经ＰＣＲ扩增证实Ａ９Ｍ片段重组入痘苗病毒基因组内。重组痘苗病毒感染的Ｖｅｒｏ Ｅ６细胞,用抗糖蛋白单克隆抗体（ＨＣＯ２、     

重组痘苗狂犬病毒糖蛋白的构建、表达及其遗传稳定性研究

狂犬病毒糖蛋白基因的痘苗病毒表达质粒 pWS 4在鸡胚细胞内与野生型痘苗病毒天坛株 (痘苗病毒 )同源重组 ,经蚀斑纯化 ,获得表达狂犬病毒糖蛋白基因的重组痘苗病毒 (重组病毒 )。该重组病毒DNAdotblot显示强阳性信号 ,间接免疫荧光试验胞膜及胞浆均见到强阳性荧光反应 ,Westernblot分析仅在 6 4ku处呈现一条狂犬病毒非融合性糖蛋白带。免疫小鼠和狗 ,第 2 8d抗狂犬病毒中和抗体滴度分别达 2 4 30和 >6 96。初免后 14d用 5 0～ 10 0LD50 狂犬病毒CVS株对小鼠脑内攻击 ,保护率达 80 %以上。致病性明显减弱。从第 11代起连续传至 30代 ,病毒纯度、病毒滴度、血凝滴度、蛋白的表达、抗原活性和保护性均无差异 ,说明该重组病毒有良好的遗传稳定性。     

用重组痘苗病毒感染动物细胞表达的Epstein-Barr病毒膜抗原检查IgA/MA抗体

用EB病毒膜抗原基因重组的痘苗病毒感染动物细胞,其细胞表面可表达EB病毒膜抗原,以此膜抗原作为诊断抗原检测血清中IgA/MA抗体,明显优于常用的B95-8细胞表面膜抗原,从而为研究人群血清抗体反应与鼻咽癌的关系,为鼻咽癌的诊断和普查开辟了新的途径。     

人重组白蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

The yeast Pichia pastoris was transformed by the multi\|copy Pichia expression vector that can express secreted human albumin.The high level expression of cell line was selected after screening.The expression of human recombinant albumin in Pichia pastoris induced by different methods were compared.The retio of secreted human albumin is 80% in total secreted proteins and the expression level reaches as high as is 10g/L.