核酸疫苗pcDNA3.1-EG95的构建及在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达

克隆细粒棘球蚴EG95基因cDNA并构建核酸疫苗pcDNA3.1-EG95。根据GenBank中细粒棘球蚴EG95基因序列(AF134378)设计引物并在上游引物起始密码子前加上Kozak序列(CCACC),提取细粒棘球蚴总RNA,RT-PCR扩增目的基因EG95cDNA,扩增片段克隆到pcDNA3.1(+)中构建重组载体pcDNA3.1-EG95后测序。重组质粒pcDNA3.1-EG95采用脂质体法转染绵羊胎儿成纤维细胞并用G418筛选,RT-PCR检测稳定转染细胞中目的基因的转录。测序结果表明克隆的目的基因包含了471bp的完整ORF并与载体连接正确。RT-PCR检测表明EG95基因在稳定转染的绵羊胎儿成纤维细胞中得到转录。成功构建pcDNA3.1-EG95核酸疫苗并可在绵羊胎儿成纤维细胞中转录目的基因,可进一步用于活体动物免疫研究。     

利用自裂解多肽T2A在牛耳皮肤成纤维细胞中实现多基因共同表达

目的:探讨利用自裂解多肽2A构建的多顺反子载体能否在牛耳皮肤成纤维细胞中实现多基因的有效表达。方法:利用来自一点褐翅蛾病毒(TaV)的2A元件(T2A)将GFP和Neo基因连接到同一载体中,构建pCMV-GFP-T2A-Neo质粒,将其转染牛耳皮肤成纤维细胞,以FACS检测GFP基因的表达,RT-qPCR检测GFP、T2A和Neo的表达。结果:由T2A连接的GFP和Neo基因在mRNA水平上都有显著表达,且表达水平相当。结论:以T2A连接的基因在转入细胞后能正常翻译和表达,显示T2A在牛耳皮肤成纤维细胞中具有自裂解功能,可作为一种构建多顺反子载体的有效工具用于牛耳皮肤成纤维细胞的基因转移,为其将来在转基因牛研制中的应用奠定了基础。     

抗病毒基因MxA真核表达载体的构建及在鸡细胞中的表达

将人抗病毒蛋白基因MxA与携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒重组后构建MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经PCR和酶切方法鉴定后,重组质粒在脂质体介导下转染鸡成纤维细胞和睾丸组织原代细胞,通过荧光观察,RT-PCR及细胞免疫组化检测目的基因的表达.结果表明,MxA基因片段已经被克隆到pEGFP-C1表达载体,成功构建了MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经该重组质粒转染后的鸡细胞的胞质中呈现颗粒状分布的绿色荧光,RT-PCR扩增出EGFP和MxA基因的特异性片断,免疫组化结果显示EGFP报告基因在细胞内的阳性表达,并表现出MxA的表达特征,间接证明了MxA可在鸡细胞中表达.MxA基因真核表达载体的成功构建以及在鸡细胞中的表达为进一步研究MxA基因在抗禽病毒性疾病中的应用打下了基础.     

构建LEF1基因毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞

旨在构建内蒙古白绒山羊(Capra hircus)淋巴样增强因子-1(Lymphoid enhancer factor,LEF1)基因真核表达载体并转染胎儿成纤维细胞,获得稳定表达红色荧光蛋白及毛囊特异性表达LEF1的转基因细胞克隆。以pCDsRed2载体为基本骨架将LEF1基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,连接红色荧光蛋白表达元件,构建LEF1基因毛囊特异表达载体pCDsRed-KL。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KL序列中,LEF1基因正确连接在KAP6-1启动子下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。脂质体介导的稳定转染效率约为14.0%,经G418筛选得到高效表达红色荧光蛋白转基因细胞克隆。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和LEF1基因整合到胎儿成纤维细胞基因组中。     

上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2转基因猪胚胎成纤维细胞的构建与鉴定

目的 构建上皮组织特异性表达鼻咽癌来源潜伏膜蛋白1（N-LMP1）和人补体受体2（CR2）真核表达载体,转染猪胚胎成纤维细胞并筛选整合有N-LMP1和CR2基因的细胞克隆,为构建与EBV感染相关的猪鼻咽癌模型奠定基础.方法 通过直接合成ED-L2启动子和N-LMP1,从人B淋巴细胞中的RNA经RT-PCR扩增出CR2,将上述3个片段逐个连接到真核表达载体pN1上,构建上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2的载体pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2;用脂质体转染猪胚胎成纤维细胞,经药物G418 筛选和PCR鉴定阳性克隆.结果 成功构建上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2的真核表达载体pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2,并成功整合到猪胚胎成纤维细胞的基因组中,获得了整合有目的 基因N-LMP1和CR2的猪胚胎成纤维细胞克隆.结论 获得了上皮组织特异性表达N-LMP1和CR2 的猪胚胎成纤维细胞克隆,为通过细胞核移植方法获得表达N-LMP1和CR2转基因猪提供了供体细胞.     

兔转基因单细胞克隆株的分离培养及其染色体倍性分析

为检测原代二倍体细胞转基因后单细胞克隆的增殖能力及其染色体倍性稳定性,用脂质体介导的转染方法将质粒DNA pEGFP-C1（带有报告基因GFP和Neo^r）导入体外培养的兔胎儿成纤维细胞中,经G418药物筛选后,分离出73个GFP阳性细胞克隆,最后存活13个（18％）,对其中9个克隆的染色体倍性进行分析,结果只有2个（22％）克隆的染色体倍性正常率在75％以上,分别为80％和75％,其余7个克隆的染色体倍性正常率均在70％以上。这表明,当使用转基因单细胞克隆株作为供核细胞产生克隆动物时,单细胞克隆的增殖代数和染色体倍性的稳定性需要进一步研究提高。     

TCR BV12-3重组载体构建及其抗肿瘤作用的初步研究

目的:构建pEGFP-C3-TCR BV12-3表达载体并初步研究其抗肿瘤作用。方法:TCR BV12-3基因片段从pGEM-T-TCR BV12-3载体上酶切并克隆至pEGFP-C3载体中,通过脂质体将pEGFP-C3-TCR BV12-3表达载体转染外周血单个核细胞(PBMCs),48小时后荧光显微镜观察转染效率。PBMCs细胞、pEGFP-C3载体转染的PBMCs细胞、pEGFP-C3-TCR BV12-3表达载体转染的PBMCs细胞分别与肝癌细胞BEL-7402和宫颈癌细胞HeLa共培养24 h,显微镜观察肿瘤细胞的生长情况。结果:测序证实TCR BV12-3基因片段成功亚克隆至pEGFP-C3载体中,荧光显微镜证实重组体转染PBMCs细胞48 h后可有效表达绿色荧光。显微镜观察发现pEGFP-C3-TCR BV12-3载体转染的PBMCs对肝癌细胞有杀伤作用,但对宫颈癌杀伤作用不明显。结论:成功构建pEGFP-C3-TCR BV12-3表达载体,初步证实TCRBV12-3对肝癌细胞有杀伤作用。     

EGFP-LacZ双报告基因真核表达载体的构建及体外表达

构建(β-半乳糖苷酶与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双报告基因的真核表达载体,并在真核细胞中表达。采用PCR方法从质粒pLenti6/V5-GW/LacZ 中获取LacZ全基因,与pEGFP-C1重组后构建真核表达载体pEGFP-C1-LacZ。该重组质粒经PCR和酶切方法鉴定后,在脂质体介导下转染293FT细胞株及鸡胚成纤维细胞,通过荧光观察和组织化学方法检测Egfp和LacZ基因的表达。结果表明,LacZ基因被克隆到pEGFP-C1,成功构建了双报告基因真核表达载体。该重组质粒转染后的细胞呈现绿色荧光,组织化学方法检测到呈蓝色的细胞,表明两个报告基因均能在细胞内正确表达。     

Ⅰ型马立克病毒UL24蛋白的原核表达及其亚细胞定位的研究

为研究Ⅰ型马立克病毒(MDV)UL24蛋白的亚细胞定位,以MDV GX0101为模板,PCR扩增UL24基因全长,分别克隆到原核表达载体pGEX-6P-1、pET-32a(+)和真核表达载体pEGFP-C1中。将原核表达重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中表达,并进行纯化和鉴定。用纯化蛋白免疫Balb/c小鼠,制备并鉴定抗UL24蛋白的多克隆抗体。通过间接免疫荧光试验(IFA)检测感染GX0101的鸡胚成纤维细胞(CEF)中的UL24蛋白。同时,将真核表达重组质粒pEGFP-C1-UL24转染CEF细胞,通过激光共聚焦显微镜观察UL24蛋白在CEF中的亚细胞定位。结果显示Ⅰ型MDV的UL24基因在原核表达载体中能够正确表达,免疫小鼠后获得抗UL24蛋白的多克隆抗体。该抗体可特异性识别MDV UL24蛋白,且MDV UL24蛋白在CEF的细胞质和细胞核中定位,以上研究结果为进一步研究MDV UL24基因的功能奠定基础。     

表达红色荧光及转胸腺素β4基因绵羊胎儿成纤维细胞系的制备

旨在构建胸腺素β4(thymosin beta4,Tβ4)基因真核表达载体并转染绵羊胎儿成纤维细胞,获得稳定表达胸腺素β4及红色荧光蛋白的转基因细胞克隆。将克隆载体pMD19TT中的胸腺素β4基因亚克隆到表达载体pIRES2-DsRed2的多克隆位点,构建表达载体pIRES2-DsRed2-Tβ4,脂质体介导转染绵羊胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。RT-PCR检测Tβ4基因在宿主细胞中的转录。测序结果显示,构建的表达载体pIRES2-DsRed2-Tβ4序列中,Tβ4基因正确连接在CMV启动子下游,顺序连接IRES2序列和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。脂质体介导的稳定转染效率约为15%,经G418筛选得到转基因细胞克隆并高效表达红色荧光蛋白。RT-PCR检测显示外源Tβ4基因在绵羊胎儿成纤维细胞中得到转录。成功构建具有红色荧光蛋白和新霉素抗性双选择标记的胸腺素β4基因真核表达载体并稳定转染绵羊胎儿成纤维细胞,筛选得到的超表达胸腺素β4绵羊胎儿成纤维细胞系为下一步通过核移植和克隆技术获得转基因绵羊提供了条件。     

TCRBV12—3重组载体构建及其抗肿瘤作用的初步研究

目的：构建pEGFP．C3-TCRBVl2—3表达载体并初步研究其抗肿瘤作用。方法：TCRBVl2—3基因片段从pGEM-T—TCRBVl2-3载体上酶切并克隆至pEGFP—C3载体中,通过脂质体将pEGFP—C3．TCRBVl2-3表达载体转染外周血单个核细胞（PBMCs）,48小时后荧光显微镜观察转染效率。PBMCs细胞、pEGFP-C3载体转染的PBMCs细胞、pEGFP—C3-TCRBVl2-3表达载体转染的PBMCs细胞分别与肝癌细胞BEL-7402和宫颈癌细胞HeLa共培养24h,显微镜观察肿瘤细胞的生长情况。结果：测序证实TCRBVl2-3基因片段成功亚克隆至pEGFP—C3载体中,荧光显微镜证实重组体转染PBMCs细胞48h后可有效表达绿色荧光。显微镜观察发现pEGFP—C3-TCRBVl2-3载体转染的PBMCs对肝癌细胞有杀伤作用．但对宫颈癌杀伤作用不明显。结论：成功构建pEGFP—C3一TCRBVl2—3表达载体,初步证实TCRBVl2．3对肝癌细胞有杀伤作用。     

牛c-myc基因的克隆及其在皮肤成纤维细胞中的表达

为了构建包含牛c-myc基因编码序列的重组载体,以胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR方法克隆出牛c-myc 基因的编码序列,将其亚克隆至pMD19-T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片段,定向克隆到pIRES2-AcGFP1-Nuc表达载体上,挑选序列正确的重组真核表达质粒转染牛皮肤成纤维细胞,用RT-PCR和Western blotting分别检测c-myc mRNA和蛋白的表达。结果表明,从胎牛原始生殖嵴中正确克隆了c-myc基因的全长编码序列,所构建的重组质粒能够在皮肤成纤维细胞中有效     

稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系的建立及鉴定

目的构建人c-jun氨基末端激酶3（c-jun N—terminal kinase 3,JNK3）真核表达载体,并在人神经母细胞瘤细胞（SHSY5Y）中稳定表达以探讨JNK3对细胞凋亡的影响。方法以pDBleu—JNK3为模板,PCR扩增人JNK3基因全长,目的片段亚克隆至真核表达载体pEGFP—C3,酶切及测序鉴定。Lipofeetamine^TM 2000转染SHSY5Y细胞,并通过G418选择性培养建立稳定表达JNK3的SHSY5Y细胞系,荧光垃微镜下观察细胞中JNK3表达,RT—PCR、Western印迹检测JNK3表达。结果成功构建了pEGFP—C3-JNK3真核表达载体,并建立了稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系,与对照组相比,其人JNK3基因表达明显升高。结论稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系的建立,为进一步研究人JNK3的功能及其与细胞凋亡的关系提供了重要的细胞模型和实验基础。     

PSF不同功能片段融合蛋白的构建及其在细胞内的分布

目的将人类PSF基因的不同功能片段定向连入pEGFP—C2质粒,使PSF蛋白的各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,观察其在HeLa细胞中的表达及定位。方法以重组质粒pEGFP—C2-PSF为模板,PCR法扩增出目的基因,将扩增片段双酶切后连接到质粒pEGFP—C2上,构建重组质粒pEGFP—C2-PSF（I—V）。将构建成功的pEGFP—C2-PSF（I—V）质粒脂质体法转染HeLa细胞,Western印迹检测融合蛋白的表达,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的定位与分布。结果成功构建质粒pEGFP—C2-PSF（I～V）,并在HeLa细胞中实现表达;Western印迹检测到融合蛋白GFP—PSF（I～V）;在激光共聚焦显微镜下观察到绿色的融合蛋白表达和定位。结论人类PSF基因的不同功能片段的重组质粒pEG—FP—C2-PSF（I～V）构建成功,可用于标记PSF蛋白的不同功能片段,为进一步研究PSF在信号转导中的作用机制以及其生物学功能奠定基础。     

APC11基因真核表达质粒构建及鉴定

目的克隆扩增APC11开放阅读框基因片段,构建其真核表达重组质粒,为后续研究其功能做准备。方法按照GenBank中人APC11序列设计引物,以HeLa细胞cDNA为模板,扩增出基因片段。该片段与真核表达载体pEGFP-C1连接,得到的重组质粒经双酶切和测序鉴定后用Western印迹检验表达。结果扩增片段长度为285bp,重组真核表达质粒经双酶切鉴定后测序鉴定正确。Western印迹证实pEGFP—C1-APC11在真核细胞内表达。结论成功克隆了APC11基因并构建了pEGFP—C1-APC11真核表达重组质粒,Western印迹证实其表达良好,对该基因功能的深入研究打下了坚实基础。     

CDADC1在人视网膜色素上皮细胞中功能研究

目的：研究细胞增殖相关基因CDADC1在人视网膜色素上皮细胞ARPE19中的表达及对ARPE19细胞增殖的影响。方法：采用基因重组技术构建荧光表达载体pEGFP－C1－CDADC1和真核表达载体pcDNA3．1-myc-CDADC1,用脂质体转染法转染ARPE19细胞,观察GFP—CDADC1融合蛋白在ARPE19细胞的表达定位,流式细胞仪测定CDADC1转染后对ARPE19细胞生长周期、凋亡的影响。结果：FP—CDADC1融合蛋白亚细胞定位显示,CDADC1低表达于ARPE19细胞胞浆,高表达于细胞核;pcD—NA3．1-myc-CDADC1瞬时转染ARPE19细胞显示24小时细胞无明显改变,48小时后重组质粒转染组S期细胞占细胞总数的19．37％,pcDNA3．1-myc空载质粒转染组S期细胞占10．87％,而空白对照组S期细胞占3．33％,重组质粒转染组与两对照组之间的差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：CDADC1在增生性玻璃体视网膜病变（PVR）发生和发展过程中可促进DNA的合成,引起细胞增生。     

A novel expression vector for transfection of bovine MHC class I genes

A vector is described for the expression of genomic or cDNA copies of bovine major histocompatibility complex (MHC) class I genes in transfected mouse Ltk⁻ cells. Class I gene fragments are amplified by the polymerase chain reaction, using primers in conserved parts of exon 2 and the 3′-untranslated region of the gene. Amplified class I gene fragments can then be subcloned into the expression vector, pBoLA-21, which contains the necessary 5′-and 3′-sequences for correct expression. The vector was tested by subcloning and expressing genomic and cDNA clones.     

稳定表达人Eps8基因的胶质瘤U251细胞系的建立

应用亚克隆方法构建pEGFP-C3／Eps8真核表达载体,经测序鉴定后,用脂质体进行胶质瘤U251细胞的转染,应用G418筛选出稳定表达pEGFP-C3／Eps8和pEGFP—C3的细胞系,最后通过Western blot和荧光定位证明印娼在U251细胞中过量表达。本实验成功建立了稳定转染Eps8的U251细胞系,为进一步研究Eps8基因在胶质瘤中的功能奠定了良好的实验基础。     

βig-h3基因的真核表达及其对人7721肝癌细胞基质金属蛋白酶表达水平的影响

目的：构建βig-h3基因真核表达载体pEGFP-C2 /βig-h3并转染人7721肝癌细胞,检测转染后细胞MMPs表达水平的变化。方法：用RT—PCR方法获得βig-h3基因,以pEGFP-C2为载体,构建重组表达质粒pEGFP-C2 /βig-h3。重组质粒用脂质体转染人7721肝癌细胞,明胶酶谱法检测转染后细胞MMPs表达水平的变化。结果：正确构建了pEGFP-C2 /βig-h3重组质粒,并且在人7721肝癌细胞达到高转染效率,转染后细胞MMPs表达水平明显升高。结论：成功构建了pEGFP-C2 /βig-h3真核表达质粒,βig-h3促进人7721肝癌细胞分泌MMPs,提示βig-h3与肝癌的侵袭和转移密切相关。