大豆中一个新防卫基因的克隆与鉴定

从大豆中分离鉴定了一个单拷贝的cDNA克隆,该基因所编码的蛋白质富含脯氨酸,命名为SbPRP .序列分析表明它具有完整的编码框,编码一个具126个氨基酸的蛋白质,其中含有一个由25个氨基酸组成的信号肽.成熟蛋白SbPRP具有典型的双模块结构,包括富含脯氨酸结构域(17个氨基酸)和一个长的疏水的富含半胱氨酸的结构域(84个氨基酸). SbPRP的表达具有明显的器官特异性,即叶中大量表达而根中不表达.Northern杂交进一步表明,SbPRP不仅对水杨酸处理作出迅速应答,而且也可对接种大豆花叶病毒Sa株系作出应答,同时还对其他非生物胁迫如盐和干旱也有明显的应答作用,因此SbPRP基因可能是一个新的防卫基因.     

水稻EPSP合酶第一内含子增强外源基因的表达

分离并克隆了水稻5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的第一内含子(EPI). 序列分析表明, EPI长704 bp, GC含量为36.2%. 为进一步研究EPI序列在转基因植物中对外源基因表达水平的影响, 将EPI序列插入CaMV35S启动子和报导基因β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase, GUS)基因(gus)之间. 采用基因枪法转化烟草叶片, gus基因瞬时表达表明, EPI序列的存在可以使GUS的表达水平提高. 利用农杆菌法转化烟草, 获得了gus基因稳定表达的植株. GUS活性检测表明EPI内含子的存在可以显著提高GUS基因的表达(P<0.01). Northern blot 分析表明, 在转录水平上gus基因在含EPI内含子的转基因植株中的表达高于不含EPI gus基因的表达, 并且成熟的gus mRNA中EPI被正确剪取掉了, 表明是一种非转译的内含子. GUS定量检测表明, EPI存在可以使GUS的平均表达水平提高3倍, 最高单株可提高6倍.     

豌豆核基质结合区的分离及其在转基因烟草中的功能分析

从豌豆基因组中分离出一段具有核基质结合区(matrix attachment region,MAR)特征的DNA序列,与已知序列相比,获得的序列中部缺失了115bp的重复序列.重复序列上、下游两段序列与已知序列相对应的序列有较高的同源性,并具有A-box,T-box和TATAAA等典型的MAR序列特征.为验证此DNA序列的功能,以β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因(uidA)作报导基因构建了植物表达载体,通过农杆菌介导转化了烟草.GUS定量检测表明,由于此DNA序列的存在,uidA基因的平均表达水平提高了2倍,最高的单株可达6倍.上述结果表明,该DNA具有MAR序列的特征序列,并且具有增加转基因表达的功能.     

银新杨中与DRE元件结合的转录因子的克隆及鉴定分析

DREB类转录因子特异地与DRE元件结合,在植物感受非生物逆境(干旱、高盐和低温)胁迫时,激活一系列逆境应答基因的表达。我们选用银新杨(Populus alba×P. alba var. pyramidalis)为材料,通过PCR和同源EST搜索的方法克隆得到了一个类DREB的基因,命名为PaDREB2。酵母单杂交实验表明,该基因编码的蛋白能特异地与DRE元件结合并激活下游报告基因的表达。用RT-PCR的方法研究了PaDREB2的表达模式,结果表明PaDREB2受低温、干旱和高盐的胁迫诱导。     

从水分胁迫的识别到ABA积累的细胞信号转导

由于植物在生长和发育过程中不可避免地要遭受各种环境胁迫的影响,植物只有通过对环境胁迫的快速感知和主动反应才得以生存和发展.植物这种对环境胁迫的快速感知和主动反应体现在环境胁迫下植物可以通过一系列基因的表达调控来实现各种抗逆的生理生化反应.虽然得以鉴定的水分胁迫应答基因越来越多,但其中只有极少的基因在抗逆中的基本功能已得到初步认识.从细胞对水分胁迫原初信号的感知到基因表达调控包括了一系列复杂的细胞逆境信息传递过程.脱落酸(abscisic acid, ABA)作为重要的细胞逆境信号物质介导了一系列基因表达,因此从细胞对水分胁迫原初信号的感知到编码ABA生物合成关键酶基因的表达是一条最为关键的细胞逆境信息传递途径.逆境应答基因功能的鉴定以及对整个细胞信号传递过程中详尽的分子机制的了解无疑是今后最有趣的也是最为重要的研究课题.     

NAC1上游调控区表达特征及其与侧根激素诱导的关系

从拟南芥(Arabidopsis thaliana）中克隆到与侧根原基发生相关的转录因子基因NAC1上游调控区序列,构建由该序列驱动β-葡聚糖苷酶基因(GUS)的植物表达载体并转化烟草(Nicotiana Tabaccum),经筛选获得了在根组织高GUS活性而地上部痕量表达的转基因烟草植株。对转基因植株进行GUS活性和染色分析,结果表明NAC1上游调控区驱动的GUS基因表达具有根部组织特异性,在侧根顶端分生组织区、侧根原基基部和幼嫩侧根基部表达。用IBA,GA₃,GA₄₊₇处理转基因植株根部,NAC1上游调控区驱动的GUS表达均增强,表明生长素、赤霉素可显著诱导NAC1上游调控区的表达,并参与侧根发生的调控。     

棉花半乳糖苷酶基因启动子的分离及其在转基因烟草中的表达

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, EC 3.2.1.23)由植物中广泛分布的一类糖基水解酶组成, 被认为与细胞壁多糖的代谢相关. 棉花(Gossypium hirsutum) β-半乳糖苷酶基因已被成功分离, 被命名为GhGal1. RNA杂交实验显示该基因在棉花纤维发育的伸长期优势表达. 为了分析GhGal1基因的时空表达调控, 本研究构建了GhGal1启动子区域(1770 bp)与β-葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase, GUS)基因融合的双元载体, 通过农杆菌转化烟草植株. 对转基因植株分析的结果表明: 此转基因果实中的GUS活性比阴性和阳性对照的活性高. GUS组织定位分析表明: β-半乳糖苷酶基因能在根组织的分生区、子叶、维管束组织、果实和表皮毛中表达. 此外, 调控区域的序列分析揭示该序列含有一些果实/种子特异表达以及与表皮毛表达相关的保守元件. 这些结果显示了GhGal1启动子在转基因烟草植株中的时空表达特征, 并提供了GhGal1基因参与棉花纤维发育的一些重要线索.     

水稻Rac家族新成员osRACB基因的克隆及结构分析

Rac基因是植物中惟一的一类分布广泛的信号GTP结合蛋白, 它在整个植物生长发育过程中起着极为重要的作用. 应用本实验室已有的水稻光周期育性转换相关基因osRACD为探针, 在低严谨杂交条件下, 筛选农垦58N-LD雌雄蕊形成期(第Ⅳ期)幼穗cDNA文库, 获得一水稻Rac家族新基因. 经同源性比较和序列分析显示, 该基因与玉米Rac家族成员RACB基因具有93%的核苷酸同源性, 且两者氨基酸序列长度相等, 仅存在一个氨基酸残基差异, 故命名新基因为osRACD. 进一步应用PCR技术, 以农垦58N基因组DNA为模板扩增得到长度为2930 bp的osRACB基因转录区核苷酸序列, 其结构包含7个外显子和6个内含子, 同时, 通过基因组文库筛选获得osRACB基因的启动区序列. Southern杂交分析表明osRACB基因同其他Rac基因相似, 是低拷贝基因. RT-PCR检测显示osRACB基因在水稻根、茎、叶中均有一定的表达, 但在茎中表达量最高. 此外, 还以人Rac1蛋白为模板, 利用InsightII软件包下的Homology, Discover等模块对osRACB蛋白进行了三级结构预测.     

IGF2基因对鸡生长及屠体性状的影响及印记状况的研究

以明星肉鸡和丝毛乌骨鸡杂交产生的F₂代鸡群为实验材料, IGF2基因作为控制鸡生长、屠体性状主基因的候选基因, 通过PCR-SSCP方法对IGF2基因多态性进行检测. 该基因外显子2中有一个单核苷酸多态性位点, 即71位碱基由C突变为G. 对F₂鸡群个体进行了基因型鉴定, 经方差分析表明：该基因对部分生长、屠体性状有显著性影响(如胸角宽、腺胃重、半净膛重等). 研究表明该基因可能调控鸡生长、屠体性状的表达, 或与控制生长、屠体性状的主基因连锁. 进一步分析发现, 正反交结果不一致, 即杂合子AB(父本等位基因在前)出生重、胸肌重较杂合子BA高, 而腹脂重后者较前者高. 另选丝毛乌骨鸡家系做IGF2印记状况检测, 杂合子与纯合子进行正反交, 然后检测后代基因型并选取杂合子, 利用RT-PCR-SSCP检测表达情况, 结果表明, 鸡的IGF2基因不受印记控制. 交互效应可能是由于其他遗传因素作用的结果.     

曲霉与木霉纤维素酶系基因组的属间遗传表达相容性

选用三类典型重组子3a、3b、A7-1和双亲本菌株AspersillusnigerAMSH、TrichodermareeseiQM9414为材料,按照所设计的纤维素酶系基因的通用序列和同工酶分型方法,进行基因组DNA指纹和酶系同工酶多态性比较分析。旨在提供重组子中基因重组的分子证据,阐明远缘双亲本基因组间的遗传表达相容性,并讨论其杂种优势的分子基础。结果发现重组子中基因组DNA指纹的重组特征稳定遗传,并能够相容性增强表达重组后的羧甲基纤维素酶（CMCase）和β-葡萄糖苷酶（βGlase）同工酶组分。纤维素酶系杂种优势的分子基础多样性包括：（1）3b中来自于双亲本部分编码βGlase的基因的杂合迭加和增强表达;（2）3a和A7-1中对应继承双亲本部分编码CMCase和βGlase的基因间协调性增强表达,并导致相应酶组分蛋白合成量的显著增加。由此综合提出了一个由βGlase介导的纤维素酶系活性调节和诱导合成调控的“双重协同增效”模型。此外还建立了考察重组子中杂种优势分子基础及其遗传稳定性的可行方法。     

油菜质膜水孔蛋白BnPIP1基因启动子区的克隆及初步的功能分析

利用双链接头介导PCR的染色体步行技术, 克隆了油菜质膜水孔蛋白BnPIP1基因上游1.6 kb的调控区域(GenBank登录号为AF472487). 序列分析表明, 该片段中含有种子萌发特异性序列及维管束特异性序列. 将其全长片段及5′端不同长度的缺失片段与gus(uidA)基因连接构建植物表达载体, 转化烟草. GUS组织化学染色表明, 全长1.6 kb片段具有较强的启动子活性. GUS染色主要分布在细胞迅速增生的部位及维管束组织中. 启动子缺失试验的GUS染色结果表明, -1610~-1030 bp区段的缺失使gus基因的表达明显变弱, 推测该区段含有启动子的正调控元件; -1030~-902 bp可能存在强烈抑制基因表达的负调控元件; -902~-19 bp的片段亦可驱动gus基因的高水平表达.     

p53对restin基因转录表达的调控作用

restin基因是Zhu等人从全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)诱导肿瘤细胞分化时克隆得到的一种黑色素瘤抗原相关基因. 前期研究表明, 该基因与细胞周期阻滞有关. 由于p53在细胞增殖调控中占据重要地位, 并且与维甲酸具有诱导关系, 因此本研究试图揭示维甲酸诱导restin基因表达是否与p53有关. 将p53转染真核细胞, 研究restin与p53的表达关系. 结果表明p53能诱导restin基因转录增加. 进一步分析发现, restin基因5¢端上游约2 kb基因组序列中存在p53蛋白结合位点. 扩增该序列构建荧光报告系统, 检测到该报告系统可以接受维甲酸的诱导调控. 在此基础上, 研究p53对缺失p53结合位点的截短体报告质粒和p53结合位点突变后的报告质粒的作用, 结果显示p53调控restin基因的表达与该基因上游序列区中的p53结合位点无关, 推测p53对restin基因的表达调控可能还存在其他分子的相互作用.     

从水分胁迫的识别到ABA积累的细胞信号转导

由于植物在生长和发育过程中不可避免地要遭受各种环境胁迫的影响 ,植物只有通过对环境胁迫的快速感知和主动反应才得以生存和发展。植物这种对环境胁迫的快速感知和主动反应体现在环境胁迫下植物可以通过一系列基因的表达调控来实现各种抗逆的生理生化反应。虽然得以鉴定的水分胁迫应答基因越来越多 ,但其中只有极少的基因在抗逆中的基本功能已得到初步认识。从细胞对水分胁迫原初信号的感知到基因表达调控包括了一系列复杂的细胞逆境信息传递过程。脱落酸 (abscisicacid ,ABA)作为重要的细胞逆境信号物质介导了一系列基因表达 ,因此从细胞对水分胁迫原初信号的感知到编码ABA生物合成关键酶基因的表达是一条最为关键的细胞逆境信息传递途径。逆境应答基因功能的鉴定以及对整个细胞信号传递过程中详尽的分子机制的了解无疑是今后最有趣的也是最为重要的研究课题。     

植物MicroRNA功能的研究进展

MicroRNA(miRNA)是真核生物基因表达的一类负调控因子,植物miRNA主要在转录水平上通过介导靶基因的甲基化、在转录后水平介导靶mRNA的切割或降低靶mRNA的翻译来调节基因的表达,从而调控植物器官的形态建成、生长发育、激素分泌与信号转导以及植物对逆境胁迫因素的应答能力。该文主要综述了近年来植物miRNA在植物生长发育、激素调节与信号转导以及逆境胁迫应答中的重要作用,并针对miRNA的网络调控特征提出了今后miRNA功能研究的方向。     

香蕉果实成熟相关基因ACO1启动子区的克隆及其功能初探

根据已报道的香蕉果实表达ACC氧化酶基因(ACO1)的序列,用改进的接头连接PCR法从香蕉基因组中扩增并克隆了此基因5′旁侧区1526bp的片段。其中包含一个推测的TATA盒序列;与已公布的两个香蕉ACC氧化酶基因启动子序列(分别为934bp和1451bp)的相似性各为97.3%(López-Gómez等)和88.8%(May和Kipp)。将4个含有不同大小启动子区的克隆片段与GUS基因编码区连接构建成嵌合基因,通过基因枪轰击转入香蕉叶、根和果实的细胞后。瞬时表达结果表明不同大小的ACO1-启动子区段都只在果实细胞中指导GUS基因表达,证明该启动子具有指导基因在果实中表达的功能;并推测负责果实特异性的顺式元件可能位于启动子近端0.7kb区段之内,在468至822 的355bp区段内可能存在与正控制有关的顺式元件。     

类核环形结构在耐辐射球菌电离辐射抗性中不起主要作用

近来基于透射电子显微镜研究的论点“耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans) R1类核致密的环形结构是其极端辐射抗性的关键因素”已引起广泛争议. 本文在以前研究基础上系统地比较了野生型R1菌株、pprI (DR0167)基因突变株YR1及pprI基因功能补偿株在电离辐射前后的类核结构的形态差异. 荧光显微镜观察结果显示: (ⅰ) 具有超强电离辐射抗性的野生型菌株R1细胞类核主要呈现紧凑的环形结构, 而同样有环形类核结构的pprI突变株YR1细胞却对辐射非常敏感; (ⅱ) 2个pprI基因功能补偿株, YR1001(pprI全基因功能补偿株)类核绝大多数呈现絮乱松散的不规则形态, YR1002(pprI部分基因功能补偿株)呈现约60%左右的环形类核结构, 这两个菌株都具有与野生型R1同样的电离辐射抗性; (ⅲ) 另一pprI部分基因功能补偿株YR1004 (敲除pprI基因3′端333个碱基对)对电离辐射极其敏感, 其约60%左右的细胞含有环形的类核结构. 上述结果表明, 耐辐射球菌类核的环形结构在辐射极端抗性中不起主要作用.     

外加紫杉醇对悬浮培养东北红豆杉细胞的诱导效应

研究表明外加紫杉醇能够诱导悬浮培养的东北红豆杉(Taxus cuspidata)细胞总DNA发生梯带化降解。利用mRNA差异显示技术比较了紫杉醇诱导凋亡与不诱导凋亡的东北红豆杉细胞基因表达的差异,得到了8个特异表达的cDNA克隆,经Northern杂交证实其中3个在不发生凋亡的细胞中表达,5个在凋亡的细胞中表达。对这8个cDNA克隆单向序列测定后,与GenBank/EMBL/DDBJ中同源序列进行了比较,结果表明：1个cDNA片段与拟南芥中ABA应答蛋白基因的保守区有86%的同源性;2个cDNA片段与番茄内切壳聚糖酶前体基因的保守区有50%的同源性;其他5个cDNA片段无明显的同源基因,可能是新基因。     

ATHKl基因调节拟南芥渗透胁迫信号转导过程

以拟南芥ATHKl基因T-DNA插入所产生的缺失突变体和野生型ws(wassilewskija)生态型为材料,分析了它们在生理和基因表达方面的差异.结果表明突变体的离体叶片失水率明显大于野生型;在30%PEG-6000胁迫后,野生型和ATHKJ突变体的细胞膜离子外渗率比胁迫前分别增加了50%和80%.PEG胁迫48 h时突变体的萎蔫程度明显大于野生型ws.以上结果说明ATHKl突变体的抗渗透胁迫能力低于野生型,即ATHKl基因参与了拟南芥适应逆境的调节反应.利用DDRT-PCR技术研究二者在PEG胁迫36h后的基因表达差异,分离到9个在野生型中被PEG诱导表达而在突变体中未被诱导的参与逆境应答的基因片段,其中包括MAPKKKl8和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因,即ATHKJ基因失活引起下游基因响应渗透胁迫的能力减弱,进一步说明ATHKJ基因参与拟南芥适应逆境的调节反应,并且ATHKl可能在逆境信号转导组分MAPK的上游起作用,很可能是植物体中的渗透感受器.     

盐生植物海滨锦葵幼苗盐胁迫下基因差异表达分析

利用cDNA-AFLP技术对海滨锦葵幼苗盐胁迫下叶片和根部的基因差异表达模式进行分析和比较, 并对部分盐胁迫应答的转录衍生片段进行了回收、测序和功能推测, 以从转录水平分析海滨锦葵的耐盐分子机制。结果显示：(1) 盐胁迫下海滨锦葵幼苗叶片和根部的基因差异表达多以量的变化为主, 包括盐胁迫下基因表达上调、下调或随盐处理浓度高低和胁迫时间长短而波动的差异表达模式; 只有少量基因的差异表达表现出质的变化, 如盐胁迫下基因沉默或诱导表达; (2) 仅在盐胁迫处理2 h的海滨锦葵幼苗根部, 基因的差异表达以质的变化为主的类型比例略高于量的变化类型比例; (3) 盐胁迫应答基因在不同组织中上调、下调、诱导或沉默的比例随胁迫处理时段而动态变化, 在刚胁迫时基因表达的差异加剧, 而后随胁迫处理时段的延长而渐趋稳定。结果预示, 从基因表达水平探讨植物的耐盐分子机理, 尽管有一定的规律可循, 但由于不同组织对盐胁迫的应答是动态变化的过程, 海滨锦葵不同组织在盐胁迫不同阶段的基因时、空、序表达特征并没有固定的程式。对部分盐胁迫下上调或诱导表达的转录衍生片段(Trivially distributed file system, TDFs)进行的序列分析和功能推测表明, 苗期海滨锦葵在盐胁迫下应答基因至少涉及3类：(1) 离子平衡重建或减少胁迫损伤相关基因(特别是运转蛋白类); (2) 恢复盐胁迫下植物生长和发育相关基因：如参与能量合成和激素调节途径相关基因等; (3)信号转导相关基因及功能未确定的新基因。文章并对盐胁迫应答基因的差异表达模式与海滨锦葵的耐盐性关系进行了讨论。     

假单胞菌M18菌株的PltR因子特异性正调控藤黄绿菌素合成

经生物信息学分析, 在假单胞菌M18(Pseudomonas sp. M18)菌株的藤黄绿菌素(pyoluteorin, Plt)生物合成基因簇上游定位了一个属于LysR家族的调控因子编码基因pltR. 运用同源重组技术, 构建了pltR失活的突变菌株M18TRG, 在King’s B培养基中, 与野生型菌株相比, Plt合成能力下降了70%, 而吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid, PCA)的合成能力不受影响. 反式互补pltR的突变株能回复Plt的合成能力达到野生型水平. 在菌株M18中过表达pltR, Plt产量提高13倍, PCA产量没有改变. 这些结果表明pltR基因表达产物是Plt生物合成的特异性正调控因子. 在野生型菌株M18和不产Plt的突变株M18T中, pltR基因表达量无显著差异, 表明pltR基因的表达不受Plt调控. 与野生株相比, 突变株M18TRG中的转录融合plt-lacZ表达量显著降低, 表明PltR对Plt的正调控作用主要发生在转录水平上. 对pltR基因在gacA突变株M18G和rsmA突变株M18R中的表达量的进一步研究发现, PltR参与了gacA基因对Plt的合成的正调控, 但不参与rsmA基因对Plt合成的负调控.