日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达

研究了外源基因日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）在卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓＣａｌｍｅｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ,ＢＣＧ）、耻垢分枝杆菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）和大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达．运用重组ＤＮＡ和聚合酶链反应（ＰＣＲ）等分子生物学技术,以表达Ｓｊ２６ＧＳＴ的Ｅ．ｃｏｌｉｐＧＥＸ衍生质粒为模板,经ＰＣＲ得到编码Ｓｊ２６ＧＳＴ的全长ｃＤＮＡ片段．将其按正确的阅读框顺序,克隆到人结核杆菌热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ,ＨＳＰ）７０的启动子下游,再将ＨＳＰ７０启动子和Ｓｊ２６ＧＳＴ基因一起亚克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中,得到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭表达质粒ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６．ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６电转化入ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ２１５５中表达Ｓｊ２６ＧＳＴ抗原,所表达的天然重组Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＳｊ２６ＧＳＴ）为可溶性蛋白,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带．其表达量分别占ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌体总蛋白的１５％和１０％．可见,Ｓｊ２６ＧＳＴ基因能在ＢＣＧ中高效表达．     

利用突变的绿色荧光蛋白基因为标记构建新型克隆载体

将三位点替换突变的绿色荧光蛋白（ＧＦＰ＿Ｓ６５Ｔ、Ｖ６８Ｌ、Ｓ７２Ａ）基因插入到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）的ＸｂａⅠ和ＳａｃⅠ之间,构建为新型的克隆载体ｐＧｒｅｅｎＬＤ。此质粒载体在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达后使菌落在日光下呈现黄绿色,而在长波紫外光照射下呈现亮绿荧光,当外源ＤＮＡ片段插入该载体的多克隆位点使ｇｆｐ基因表达受阻时,转化的Ｅ．ｃｏｌｉ菌落为白色。因此可以用Ｅ．ｃｏｌｉ菌落黄绿色／绿色荧光的消失作为检测指标来筛选含有重组质粒的克隆。     

甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物RNA3序列分析及编码25kD蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）内蒙分离物的总ＲＮＡ为模板,通过反转录－ＰＣＲ扩增获得ＢＮＹＶＶＲＮＡ３全长ｃＤＮＡ。将其克隆到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）上,得到重组质粒ｐＧＢＹ５６。序列分析结果表明,内蒙分离物ＲＮＡ３基因组全长为１７７５ｎｔ,其中包含３个开放阅读框架,分别编码２５ｋＤ蛋白、４．６ｋＤ蛋白和一种由５９个氨基酸组成的Ｎ蛋白。与法国Ｆ２分离物、德国Ｇ１分离物和日本Ｓ分离物相比,其核苷酸序列的同源性分别为９６．４％、９６．８％和９７．３％。将２５ｋＤ蛋白编码基因克隆到ｐＪＷ２上,构建了该基因的原核表达载体。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析结果表明,２５ｋＤ蛋白基因在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中经温度（４２℃）诱导后,可特异地表达２５ｋＤ蛋白     

利用突变的绿化荧光蛋白基因为标记构建新型克隆载体

将三位点替换突变的绿色荧光蛋白（ＧＦＰ－Ｓ６５Ｔ、Ｖ６８Ｌ、Ｓ７２Ａ）基因插入到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）的ＸｂａⅠ和ＳａｃⅠ之间,构建为新型的克隆载体ｐＧｒｅｅｎＬＤ。此质粒载体在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达后使菌落在日光下呈现黄绿色,而在长波紫外光照射下呈现亮绿荧光,当外源ＤＮＡ片段插入该载体的多克隆位点使ｇｆｐ基因表达受阻时,转化的Ｅ．ｃｏｌｉ菌落为白色。因此可以用Ｅ．ｃｏｌｉ菌落黄绿色／绿色     

木糖代谢基因表达水平对酿酒酵母重组菌株产物形成的影响

以Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ穿梭质粒ＹＥｐ２４为骨架,将树干毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＣＢＳ６０５４）的木糖还原酶（ＸＲ）基因ＸＹＬ１及木糖醇脱氢酶（ＸＤＨ）基因ＸＹＬ１分别以不同的相对表达方向置于酿酒酵母的乙醇脱氢酶Ｉ（ＡＤＨ１）启动子和磷酸甘油激酶（ＰＧＫ）启动子下,构建不同ＸＹＬ１及ＸＹＬ２的重组质粒。这些重组质粒分别转化酿酒酵母（Ｈ１５８）受体菌。得到的重组菌株     

用蛋白质工程方法改变葡萄糖异构酶最适pH和最适温度

用寡核苷酸诱导的定点突变方法构建了葡萄糖异构酶基因的突变体（Ｎ１８４Ｄ和Ａ１９８Ｃ）。含突变体的重组质粒ｐＴＫＤ－ＧＩ１（Ｎ１８４Ｄ）和ｐＴＫＤ－ＧＩ２（Ａ１９８ｃ）在Ｅ．ｃｏｌｉＫ３８菌株中表达,用ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ和Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ＨＲ柱层析分离纯化突变酶。与野生型葡萄糖异构酶比较实验表明：（１）突变酶Ｎ１８４Ｄ的最适ｐＨ值下降了１个单位;等电点下降了０．６个单位     

HSP70基因上游调控序列对GST基因在耻垢分枝杆菌中表达效率的 影响

将外源基因———日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）基因克隆到大肠杆菌分枝杆菌穿梭质粒中,构建成四个不同的表达截体,研究它们在耻垢后分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｍｅｇｍａｔｉｓ）中的表达效率。首先将含有结核杆菌热休克蛋白７０（ＨｅａｔＳｈｏｃｋＰｒｏｔｅｉｎ,ＨＳＰ７０）的启动子的质粒ｐＭＴ７０用ＮｃｏＩ切,进行两种不同的修饰后,得到不同的ＳＤ序列;将Ｓｊ２６ＧＳＴ基因克隆进去。再将含ＨＳＰ７０启动子和Ｓｊ２６ＧＳＴ基因的片段切下,克隆到分枝杆菌大肠杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ２０００中,筛选出不同ＳＤ序列、不同方向和不同拷贝数的分枝杆菌表达载体四个。所表达的重组天然Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＳｊ２６ＧＳＴ）为可溶性蛋白,在ＳＤＳＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带。通过薄层扫描分析,发现表达质粒中双拷贝启动子外源基因组合,表达效率最高,是单拷贝组合的１６倍,占分枝杆菌菌体总蛋白的２８％。而不同的克隆方向和不同的ＳＤ序列（两者相差３个碱基）对表达效率的影响不明显。     

Egr-1基因调控序列连接OSM cDNA表达质粒的构建及其在黑色素瘤细胞中的表达

ＯＳＭ是一种对黑色素瘤细胞显示抑制作用的细胞因子．为进行ＯＳＭ针对黑色素瘤的基因－放射治疗研究,构建了小鼠Ｅｇｒ－１基因调控序列引导入ＯＳＭｃＤＮＡ真核表达质粒（ｐＥＯ）,ｐＥＯ质粒转染小鼠Ｂ－１６黑色素瘤细胞,经Ｇ４１８和抗人ＯＳＭ抗体的筛选,获得了稳定表达ＯＳＭ的克隆细胞（ｐＥＯ－１细胞）,ＯＳＭ表达量可达５．９７ｎｇ每１０５细胞天,分子量为３２ｋＤ．ｐＥＯ－１细胞用一定浓度Ｈ２Ｏ２处理后ＯＳＭ表达量可提高６２％,表明ｐＥＯ重组质粒可在氧自由基的刺激作用下增强ＯＳＭ表达     

苏云金杆菌以色列亚种cryIVB基因在E.coli中的高表达

韭菜迟眼蕈蚊（Ｂｒａｄｙｓｉａｏｄｏｒｉｐｈａｇａ）幼虫以取食根部危害韭菜的生长．为了研究有效的生防制剂,采用ＤＮＡ聚合酶链式反应方法,从苏云金杆菌以色列亚种（Ｂｔｉ）得到３．５ｋｂ的开放阅读框架（ＯＲＦ）,其包括Ｂｔｉ杀虫蛋白基因ｃｒｙＩＶＢ的结构基因和部分上游启动区．将结构基因亚克隆到高表达载体ｐＱＥ５２中,构建了高表达质粒ｐＱＥ５２Ｂ．在Ｅ．ｃｏｌｉＳＧ１３００９（ｐＲＥＰ４）中,经ＩＰＴＧ诱导,１３０ｋＤ的蛋白表达量约占细胞总蛋白的７．９％,其对韭菜迟眼蕈蚊三龄幼虫具有较强的毒杀作用．为进一步利用ｃｒｙＩＶＢ基因,构建生防工程菌株打下了基础     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素—3融合蛋白的表达研究

利用ＰＣＲ扩增得到粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白细胞介素－３（ＩＬ－３）完整基因片段,将其分别克隆ｐＧＥＭ－Ｔ构建成ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白基因,ＤＮＡ序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对７２ＲＮＡ聚合酶表达载体ｐＴ７ｚｚ,得到表达质粒ｐＦｕ,经转化至表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,在ＩＰＴＧ诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴     

霍乱弧菌zot基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从霍乱疫苗菌中抽提基因组ＤＮＡ,用ＰＣＲ的方法扩增ｚｏｔ基因。序列分析表明,ｚｏｔ基因编码３９９个氨基酸,其中４个氨基酸与文献报道有差异。将ｚｏｔ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－２８（ａ＋）构建表达质粒ｐＥＴ－ＺＯＴ,转化大肠檑菌ＢＬ２１（ＤＥ３）筛有达菌株ＢＬＺＯＴ。表达菌株经１ｍｍｏｌ／ＬＴ ＩＰＴＧ诱导表达３－５ｈ后,表达大量ＺＯＴ蛋白,并形成包涵体,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析重组ＺＯＴ蛋白分     

不同流加发酵方式对重组大肠杆菌细胞外Hegf表达水平的影响

人表皮生长因子 (ｈＥＧＦ)是由 5 3个氨基酸组成的单链多肽 ,内有 3个二硫键。它具有多种重要的生物学功能 ,能够促进表皮细胞的生长繁殖 ,加速皮肤和角膜创伤的修复 ,加速胃溃疡的治疗和抑制胃酸的分泌 ,具有广阔的医疗应用前景[1 ] 。最近又发现ｈＥＧＦ在化妆品产业中有潜在的重大应用[2 ] 。这些都促进了人们试图采用基因工程技术大规模地生产ｈＥＧＦ。1982年Ｓｍｉｔｈ等人首先在Ｅ .ｃｏｌｉ中以融合蛋白形式实现了ｈＥＧＦ的表达[3 ] ,随后在枯草杆菌和酵母菌中亦相继实现了表达[4] 。由于ｈＥＧＦ在酵母菌中表达水平很低 ,大肠杆…     

Bt毒素蛋白基因的PCR鉴定及定位

利用合成的cryI、cryIII和cryV基因专一性引物 ,检测了从土壤中分离到的 56株苏云金芽孢杆菌菌株所含的晶体毒素蛋白基因。含有cryI基因的有 7株 ,含有cryIII基因的有 2株 ,同时含有cryI和cryV基因的有 2 1株。斑点杂交及Southern杂交分析表明 ,cryV基因定位于 1 50MD的大质粒上。     

一种来源于链霉菌的纤溶酶的纯化及其基因的克隆

链霉菌C3662的发酵液上清经 80 %硫酸铵沉淀 ,DEAE Sepharose和CM Sepharose层析分离后纯化出一种纤溶酶。SDS PAGE显示为单一的条带 ,分子量约为 30kD。以 pIJ699为载体 ,S .lividansTK2 4为宿主菌 ,鸟枪法克隆纤溶酶基因 ,从 30 0 0个转化子中挑选到 1个具活性转化子 ,经亚克隆 ,序列测定得到一个 90 3bp的完整ORF ,其GC %为 68.33% ,密码子第三位GC %为 95.6% ,符合链霉菌基因的典型特征。与多种蛋白酶具有较高的同源性     

叉角厉蝽对斜纹夜蛾不同龄期幼虫的选择捕食作用

应用二次回归通用旋转组合设计探讨了叉角厉蝽与斜纹夜蛾低龄幼虫,中龄幼虫和高龄幼虫共存系统中,天敌对猎物不同年龄等级的选择捕食作用,建立了3个年龄等级的幼虫被捕食量模型。根据被捕食量模型可计算出斜纹夜蛾3个年龄等级不同密度组合下,天敌对猎物的选择捕食比率,结果表明,在3个年龄等级相同密度的组合下,叉角厉蝽倾向于捕食个体大的中高龄幼虫。     

轮状病毒VP7基因在大肠杆菌中的表达及其免疫原性

轮状病毒是世界范围内引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体。VP7是轮状病毒的主要外壳蛋白和中和抗原,是发展基因工程疫苗的首选。把包含全部3个主要抗原性区域的轮状病毒SA11 VP7基因片段以谷胱甘肽S转移酶融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行表达,表达产物占菌体总蛋白的30%左右。经一步Glutathione Sepharose4B亲和纯化,重组蛋白纯度超过90%。Western blot实验表明,重组蛋白可被抗SA11的多抗特异地识别。动物实验表明,重组抗原可在小鼠和家兔体内诱导VP7特异的抗体和一定水平的SA11中和抗体。     

解毒酶基因的克隆及其在大肠杆菌和蓝藻中的表达(英文)

近几年来 ,在明确了杀虫药剂抗性机理的基础上 ,从杀虫药剂抗性的昆虫中分离出高抗性基因 (即解毒酶基因 ) ,将该基因克隆到表达载体 pRL 4 39上 ,得到表达载体 pRL B1,将其转化大肠杆菌HB10 1,获得了可以表达解毒酶基因的转基因工程菌株。同时构建了穿梭表达载体 pDC B1,并转化大肠杆菌HB10 1后 ,在抗生素氨卞霉素 (30 μg/mL)和卡那霉素 (30 μg/mL)平板上挑选阳性克隆 ,将阳性克隆的细胞、蓝藻和结合质粒以三亲结合转移的方式转入蓝藻。斑点杂交、Southern分析结果表明已经获得了Synechococcussp .PCC 794 2转基因工程藻。     

人肝细胞生长因子(hdHGF)基因在毕赤酵母中的分泌表达

研究了hdHGF基因在毕赤酵母中的表达 .以人胎盘mRNA为模板 ,经逆转录、重叠PCR获得hdHGF全长和成熟基因片段 .将该基因片段克隆到pPIC9载体上 ,将重组表达质粒转化巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115,筛选mut+ 表型 ,经甲醇诱导可实现rhdHGF的分泌表达 .经摇瓶培养筛选出 4株表达水平较高的酵母工程菌株 ,SDS PAGE分析和Western印迹试验表明 ,产物分子量约为80kD ,5L发酵罐高密度培养已使生物量达 13 5g L(干重 ) ,发酵液上清总蛋白量为 8 0g L ,电泳结果表明rhdHGF表达水平为总蛋白的 12 3 % .     

苏云金芽胞杆菌YBT1520杀虫晶体蛋白基因的属性

通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交发现高毒力苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＴＢＴ－１５２０菌株含有两个杀虫晶体蛋白基因片段,其５’＝末端所在ＨｉｎｄⅢ片段分别为６．８ｋｂ和４．６ｋｂ,它们对应的基因分别命名为ｃｒｙ２１８和ｃｒｙ４．６。经ＰＣＲ鉴定,该菌含有ｃｒｙ１Ａａ、ｃｒｙ１Ａｂ和ｃｒｙ１Ａｃ基因,以及ｃｒｙ２基因,其中ｃｒｙ２１８属于ｃｒｙ１Ａｃ。分析了ｃｒｙ１Ａｃ基因     

彩叶草红色素的理论性质

天然色素可从动植物相应组织中提取。从吊竹梅（Zebrina pendula Schnizl．）中已得到非常稳定的天然色素,从Acalypha uilkesiana中得到大量的花青苷色素,从Setcrease purpurea中也得到非常稳定的天然紫红色素。彩叶草（Coleus blumei Benth）含有大量类黄酮物质,目前,对其色素的理化性质没有详细的报道。本文探讨彩叶草红色素的理化性质,旨在为该色素的开发应用提供科学依据。