醋酸杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆表达

根据已知α－乙酰酸脱酸酶（α－ALDC）的基因序称,用PCR法从醋酸杆菌（Acetobacter racens)中克隆到的1kb的DNA片段,经DNA测序证明是ALDC基因,将该基因重组到质粒pBV220中,转化大肠杆菌,实现了高表达,获得了目的蛋白表达量约40％的转化子,为下步研究其酶活性奠定了基础。     

α-乙酰乳酸脱羧酶的基因克隆及在大肠杆菌和酿酒酵母中的表达

以ｐＵＣ１９质粒为载体,以Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９为受体,构建了含α－乙酰乳酸脱羧酶（α－ＡＬＤＣ）基因的地衣芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＳ１０１０６的基因文库,得到４８００个重组转化子中均含有４～１０ｋｂ的外源插入ＤＮＡ片段,从基因文库中筛选到６个阳性克隆,对其中１个克隆的α－乙酰乳酸脱羧酶基因片段进行亚克隆分析表明,该α－乙酰乳酸脱羧酶基因位于１．６ｋｂ的ＢａｍＨⅠ     

α-乙酰乳酸脱羧酶加速啤酒成熟的研究进展与应用

较详细地介绍了国内外α－乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）的分子生物学研究,细菌ALDC基因在酵母菌中的克隆和表达,以及ALDC酶制剂加速啤酒成熟的应用。     

α－乙酰乳酸脱羧酶的研究

从细菌中筛选出１４株α－乙酰乳酸脱羧酶产生菌。从其中的一株α－乙酰乳酸脱羧酶产生菌提取粗酶,将粗酶样品分别加到主发酵的啤酒和主发酵后的啤酒中,在两种情况下均能明显降低啤酒中的总双乙酰量。     

α-乙酰乳酸脱羧酶在大肠杆菌中的克隆表达

根据已知的α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）的基因序列,通过PCR获得了枯草芽孢杆菌168的ALDC基因,将该基因克隆到克隆载体pUC18和表达载体pQE60中,构建了pUC18-ALDC和pQE60-ALDC,经DNA测序证明序列正确。重组大肠杆菌DH5a／pQE60-ALDC经IPTG诱导能够高表达ALDC。对该酶进行了活力测定,结果显示工程菌产酶活力为0．11U／mL。     

α-乙酰乳酸脱羧酶在毕赤酵母中的分泌表达

根据已知的α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）基因序列,通过PCR从枯草杆菌168基因组上扩增得到编码ALDC的结构基因。将该基因克隆到大肠杆菌一毕赤酵母穿梭载体pPIC9中,构建了重组质粒pPIC9-ALDC,电击转化毕赤酵母GS115。在甲醇诱导下,毕赤酵母分泌表达了ALDC。SDS—PAGE分析可见到Mr约62000的表达条带,经测定,表达产物活力为0．03U／mL。     

枯草芽孢杆菌α乙酰乳酸脱羧酶基因在啤酒酵母工业菌株中的表达

啤酒酿造中,双乙酰是影响啤酒生产熟化期长短及其风味的主要因素.存在于多种细菌中的a-乙酰乳酸脱羧酶(EC4.1.1.5,简称a-ALDC)[1]能将双乙酰的前体a-乙酰乳酸直接转化为对啤酒风味没有影响的乙偶姻,从而大大降低啤酒中双乙酰的含量,缩短啤酒熟化期.但所有的啤酒酵母菌不产生此酶.虽然在发酵过程中添加此酶是一个解决的途径,但解决问题的根本是将ALDC基因引入到啤酒酵母菌中.国外已开展这方面的研究[2,3],本研究组曾用随机克隆的方法获得了枯草芽孢杆菌a-ALDC基因[4],本文报道了枯草芽孢杆菌ALDC基因在工业用啤酒酵母中的表达研究结果.     

α-乙酰乳酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合型表达

α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒生产中能加快啤酒成熟,有重要的应用价值。本研究将枯草芽孢杆菌启动子P43克隆到质粒pUC19-ALDC中的α-乙酰乳酸脱羧酶基因之前,得到重组质粒pUC19-P43-ALDC。重组质粒pUC19-P43-ALDC与质粒pMLK83-BN同源重组,筛选得到枯草芽孢杆菌整合质粒pMLK83-ALDC。用此整合质粒转化枯草芽孢杆菌1A751,挑选出新霉素抗性且无淀粉酶活性的重组菌株。此菌株用LB培养基在37℃、220r/min摇瓶培养过夜,测得α-乙酰乳酸脱羧酶活力为15.6U/mL,说明整合的α-乙酰乳酸脱羧酶基因能够在重组菌株中稳定传代和表达。本研究首次在枯草芽孢杆菌中用整合型的方式重组表达了α-乙酰乳酸脱羧酶,提出了一种有潜力的生产α-乙酰乳酸脱羧酶的新方法。     

二种重组α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒生产中降低双乙酰的作用

利用已构建的含有短芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）和产气肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）α－乙酰乳酸脱羧酶（α－ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ, α-ＡＬＤＣ）基因的工程菌株,并使它们分别在大肠杆菌中高效表达,获得重组α－ＡＬＤＣ。在实验室,用 ２Ｌ体积的麦芽汁进行啤酒生产试验,添加 ２种重组α－ＡＬＤＣ后,使啤酒中的双乙酰含量快速下降到或始终保持在０.１ｍｇ／Ｌ以下。证明得到的重组ａ－ＡＬＤＣ能有效地降低啤酒中双乙酰含量。     

枯草芽孢杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆及表达

利用鸟枪法构建了供体菌的基因组文库,通过VP反应显色法进行筛选,从约7000个转化子中选出携带ALDC基因的重组质粒（pBG4～pBG5）．绘制了pBG4插入片段的限制酶图谱．Southern杂交证明该外源片段来源于供体菌。酶活性测定结果表明ALDC基因在大肠杆菌中获得了表达,为构建带有ALDC的啤酒酵母工程菌奠定了基础．     

α—乙酰乳酸脱羧酶的研究

从细菌中筛选出１４株α－乙酰乳酸脱羧酶产生菌。从其中的一株α－乙酰乳酸脱羧酶产生菌提取粗酶,将粗酶样品分别加到主发酵的啤酒和主发酵后的啤酒后,在两种情况下均能明显降低啤酒中的总双乙酰量。     

重组α—乙酰乳酸脱羧酶的表达及部分酶学特性

用聚合酶链式反应方法以短芽胞杆菌基因组ＤＮＡ为模板,克隆出０．９７ｋｂ的ＤＮＡ片段,经ＤＮＡ测序证明α－乙酰乳酸脱羧酶基因。将该基因重组到质ｐＢＶ２２０中,构建了重组表达质粒ｐＢＶＹＩ,转化大肠杆菌ＤＨ５α后,经筛选得到了能表达０６３３－ＡＬＤＣ活性的转化子细胞。     

二种重组α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒生产中降低双乙酰的作用

利用已构建的含有短芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）和产气肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）α－乙酰乳酸脱羧酶（α－ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ, α-ＡＬＤＣ）基因的工程菌株,并使它们分别在大肠杆菌中高效表达,获得重组α－ＡＬＤＣ。在实验室,用 ２Ｌ体积的麦芽汁进行啤酒生产试验,添加 ２种重组α－ＡＬＤＣ后,使啤酒中的双乙酰含量快速下降到或始终保持在０.１ｍｇ／Ｌ以下。证明得到的重组ａ－ＡＬＤＣ能有效地降低啤酒中双乙酰含量。     

产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆表达及鉴定

根据已知α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase,ALDC)的基因序列,用PCR法从产气肠杆菌(Enterobacter oerogenes)中克隆到约0.8kb的DNA片段,经DNA测序证明是ALDC基因,将该基因重组到质粒pBV220中,转化大肠杆菌,实现了高表达,获得了目的蛋白表达量约50％的转化子;表达产物经鉴定具有ALDC酶活性,为可溶性表达．为下一步应用基因工程手段对其进行改造奠定了基础．     

短芽孢杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用ＰＣＲ方法扩增短芽孢杆菌α－乙酰乳酸脱羧酶基因,引入原核表达载体ｐＢＶ２２０中,得到重组质ｐＡＬＤ１．ｐＡＬＤ１的ＡＬＤＣ基因在大肠杆菌中高效表达,每毫升发酵液产酶８０单位以上,双原始菌株提高２００余倍。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白质分析表明,大肠杆菌ＤＨ５α表达的ＡＬＤＣ占细胞总蛋白量的４０％以上。研究了重组质粒稳定性,大肠杆菌ＤＨ５α和ＨＢ１０１分别大无选择压力下３０℃连续培养５０代以上,４１℃诱导     

产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆和表达及影响重组酶活性的因素

用PCR方法从产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)中克隆出09kb的DNA片段,经DNA测序证明是α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase,α-ALDC)基因。将α-ALDC基因重组到质粒pBV220后,转化大肠杆菌,经筛选获得高效表达的重组子菌株。重组α-ALDC基因表达量占菌体总蛋白量的27%。酶活检测表明重组子细胞表达的α-ALDC活性是产气肠杆菌的12000倍。另外,粗提的重组α-ALDC的最适pH为6.5～7.0,pH稳定范围为5.5～8.0,适合的温度为35～45℃。Ba²⁺、Cd²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Sn²⁺可提高重组α-ALDC的活性。氨基酸修饰剂可降低其活性。     

α-乙酰乳酸脱羧酶产生菌的微波诱变

为获得α-乙酰乳酸脱羧酶的高产突变株,以产α-ALDC的枯草芽孢杆菌3226—5为出发菌株进行了诱变处理。经过微波（小火）物理诱变得到3株高产正突变株W181、W184、W195,经过多次传代实验,表明W181、W195是稳定的突变株。突变株W195的α-ALDC相对酶活（OD522）由出发菌株的0．35提高到0．617,提高了76％,突变株W181提高了66．9％。     

产气肠杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆和表达及影响重组酶活性？…

用ＰＣＲ方法从产气肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）中克隆出０．９ｋｂ的ＤＮＡ片段,经ＤＮＡ测序证明是α－乙酰乳酸脱羧酶（α－ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ,α－ＡＬＤＣ）基因。将α－ＡＬＤＣ基因重组到质粒,ｐＢＶ２２０后,转化大肠杆菌,经筛选获得的高效表达的重组子菌株。     

短芽孢杆菌a-乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用PCR方法扩增短芽孢杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因,引入原核表达载体pBV220中,得到重组质粒pALDl。pALDl中的ALDC基因在大肠杆菌中高效表达,每毫升发酵液产酶80单位以下,比原始菌株提高200余倍。SDS-PAGE蛋白质分析表明,大肠杆菌DH5α(pALDl)表达的ALDC占细胞总蛋白量的40％以上。研究了重组质粒稳定性,大肠杆菌DH5α(PALDl)和HB101(pALDl)分别在无选择压力下30℃连续培养50代以上,41℃诱导不同时间,DH5α(pALDl)在热诱导5h后,未发现质粒不稳定性,HB101(pALDl)在热诱导3h后,质粒基本稳定,但热诱导5h后,丢失质粒的细胞约占70％。     

枯草芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆及表达*

利用鸟枪法构建了供体菌的基因组文库,通过VP反应显色法进行筛选,从约7000个转化子中选出携带ALDC基因的重组质粒（pBG4～pBG5）．绘制了pBG4插入片段的限制酶图谱．Southern杂交证明该外源片段来源于供体菌。酶活性测定结果表明ALDC基因在大肠杆菌中获得了表达,为构建带有ALDC的啤酒酵母工程菌奠定了基础．