B链N端缩短的胰岛素类似物研究——Ⅲ.猪desB~1[Trp]~(B_2)胰岛素的制备及性质

本文采用酸稳定性氨基可逆保护基甲基磺酰乙氧羰酰基(MSC)对猪胰岛素氨基进行选择性保护后,经Edman降解两次制得[MSC]_2~(A_1B_(20))desB~(1-2)INS,以此作为半合成起始物,在有N-乙基吗啉存在的二甲亚砜溶液中与甲基磺酰乙氧羰酰色氨酸对硝基苯酯(MSC·Trp·ONP)缩合,中间产物经SP-Sephadex C-25分离后脱保护、纯化,所得最终产物经醋酸纤维薄膜电泳,萤光光谱,氨基酸组成及N-末端分析确证为desB~1[Trp]~(B_2)INS。小白鼠惊厥活力和肝细胞膜受体活力分别为原料胰岛素的60%和52%,放射免疫活力低于原料胰岛素但高于去B_1胰岛素。     

猪B_1色氨酸去五肽胰岛素的制备及性质

本文采用甲基磺酰乙氧羰酰基(MSC)作为酸稳定性氨基可逆保护基,在二甲亚砜溶剂中与去五肽胰岛素(DPI)氨基选择性反应。经Sp-Sephadex C-25纯化得[MSC]~(?),单取代去五肽胰岛素。再经Edman 降解制得[MSC]~(?)desB_1DPI。作为半合成起始物与甲基磺酰乙氧羰酰色氨酸对硝基苯酯(Msc·Trp·ONP)在N-乙基吗啉存在下,在二甲亚砜溶液中进行缩合。缩合产物经Sp-Sephadex C-25分离,所得[MSC]_2Trp~(B_1)DPI 在0℃下以二氧六环∶甲醇∶水∶2N氢氧化钠(3∶0.5∶3.5∶1,V/V)混合溶剂脱保护。脱保护产物经Sephadex G-50纯化,制得[Trp]~(B_1)DPI。氨基酸组成和紫外吸收光谱分析,证实产物是[Trp]~(B_1)DPI。[Trp]~(B_1)DPI 经肝膜胰岛素受体结合活力分析,其受体结合活力为胰岛素的26%.     

抗肿瘤药物帕玛度胺类似物的合成

目的：设计并合成抗肿瘤药物帕玛度胺的3位N取代的新型类似物。方法：从3-硝基邻苯二甲酸（2）和N-（叔丁氧羰基）．L-谷氨酰胺（4）出发,经过六步反应得到目标化合物。3-硝基邻苯二甲酸（2）经脱水制得3-硝基邻苯二甲酸酐（3）。用N-（叔丁氧羰基）-L-谷氨酰胺（4）经闭环、脱保护制得3-氨基-2,6-哌啶二酮三氟乙酸盐（6）。4与6经缩合、钯碳催化氢化制得免疫调节剂Pomalidomide（8）,（8）经过酰化得到3-乙酰氨基-N-（2,6-二氧代-3-哌啶基）邻苯二甲酰亚胺（1）。以（4）计总收率约34．9％。结果：得到3-乙酰氨基-N-（2,6-二氧代-3-哌啶基）-邻苯二甲酰亚胺（1）,应用于细胞活性测试。结论：改进了帕玛度胺的合成工艺,得到了3位N乙酰化的新型帕玛度胺类似物（1）,初步研究显示（1）的生物活性与帕玛度胺接近。     

截短型人胰岛素样生长因子-Ⅰ 在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

利用PCR、删除突变和基因重组技术构建了N端缺失3个氨基酸的人胰岛素样生长因子-[des(1-3)IGF-]的表达载体pExSec/IGF,在大肠杆菌蛋白酶缺陷株BL21(DE3)中,通过用IPTG于超常规的12℃低温诱导16h,des(1-3)IGF-获得了可溶性表达。表达水平达到可溶性细菌总蛋白约15%。经超滤和SephadexG-50凝胶过滤,des(1-3)IGF-纯度分别达到49%和82%,且表现出明显的免疫学活性和刺激Balb3T3细胞增殖的生物学活性。     

胰岛素结构与功能关系的研究——Ⅳ.B_(22)-精氨酸的改变对胰岛素生物活性的影响

本文叙述了一系列B_(22)-精氨酸改变的B_(23)-D-Ala去B链羧端六肽胰岛素类似物的半合成。半合成途径是胰岛素六甲酯(INS-OMe)经胰蛋白酶和羧肽酶B作用得到去B链羧端九肽胰岛素五甲酯OMe-(DNIOH),A_1和B_1的α-氨基用Boc-基保护后与X-D-Ala·PheOMe(X=Gly,D-Arg,Val,Arg,Boc-Lys和OTB-Asp)缩合,三氟乙酸和皂化去除所有的保护基。这些类似物的生物活力表明;B_(22)-Arg并非不能改变,它用Lys甚至Asp代替后,不影响活力,活力水平约为天然胰岛素的20%。当B_(22)-Arg用Val代替后活力降低一半,而用Gly或D-Arg代替后,活力很低。文中对B_(22)-Arg在维持胰岛素构象和对胰岛素生物活力的影响以及豚鼠胰岛素活力低的原因等问题进行了讨论。     

多核苷酸合成的研究 Ⅺ.酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-端半分子中含N,N-二甲基鸟苷的四核苷三磷酸(CpGpCpm_2~2G)的合成

(1)参照已报道方法,从鸟苷合成了N,N-二甲基鸟苷(m_2~2G)。(2)N、2′、5′-O-三苯甲酰胞苷酸[_(Bz)C~(Bz)(OB_z)p],与2′、3′-O-二乙酰基-N,N-二甲基鸟苷[m_2~2(OAc)_2]经DCC缩合,脱去保护基后可分离出胞苷酰-(3′→5′)-N,N-二甲基鸟苷(Cpm_2~2G)。(3)_(Bz)C~(Bz)(OBz)p与N-二甲基氨基甲叉鸟苷酸(G_P~(DMM)),用DCC缩合,脱保护基后可得到胞苷酰-(3′→5′)-鸟苷-2′,3′-环状磷酸(CpG>p)。(4)用RNase N_1(E.C.2.7.7.26)催化CpG>p与Cpm_2~2G反应生成26%产率的CpGpCpm_2~2G。经纯化后产物不含酶,用RNase N_1水解得到等克分子的CpGp CpG>p和Cpm_2~2G,碱解可分离出Cp(2′ 3′),Gp(2′ 3′)及m_2~2G,克分子比为2.07:1.0:1.1。     

去B链C端五肽胰岛素类似物的制备和性质

A_1B_(29)-(MSC)_2胰岛素经胃蛋白酶限制性地水解得A_1-(MSC)-DPI。通过Edman降解方法,从A_1-(MSC)-DPI制备了B链N端缩短的DPI类似物,即:去B_1(Phe)-DPI,去B_(1-2)(Phe Val)-DPI和去B_(1-3)(Phe Val Asn)-DPI。本文还叙述了它们的生物活力。     

力生长因子在大肠杆菌中的表达及活性分析

MGF(Mechano-growth factor)是一种IGF-1变体形式, 研究发现该因子具有应力敏感性, 并且具有促进肌肉肥大、再生以及神经损伤修复的功能。通过RT-PCR从拉伸刺激的人成骨细胞中克隆MGF cDNA序列, 并去除5'端9 bp的序列, 使N端缺少对肠激酶(Enterokinase, EK)具有抑制作用的脯氨酸, 将截短型MGF (des(1-3) MGF) cDNA序列克隆入pET32a(+)质粒, 构建重组表达质粒。重组质粒转化E. coli BL21(DE3), 在30oC培养下以可溶形式表达融合蛋白Trx/ des(1-3)MGF, 采用离子交换层析和Ni2+金属亲和层析, 获得纯度95%以上的融合蛋白。再对融合蛋白EK酶切, rpHPLC分离获得纯度达98%的des(1-3)MGF, SDS-PAGE电泳及质谱分析蛋白分子量与理论值相符。生物活性实验显示, 所制备的des(1-3)MGF比des(1-3)IGF-1更显著的促进MC3T3-E1细胞的增值和迁移。     

谷胱甘肽S-转移酶活性中心的研究—羧基、氨基和胍基的化学修饰

用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC),2.4.6.三硝基苯磺酸(TNBS)和丁二酮(DIC)分别修饰人胎盘型谷胱甘肽S-转移酶(GST-π)的羧基、氨基和胍基,研究了酶的失活动力学,发现引起一分子酶亚基全部失活所需抑制剂的分子数分别为1.0、1.08和0.98,提示每亚基只有一个羧基、氨基和胍基参与酶的活性中心。底物及其类似物谷胱甘肽,S-己烷或S-辛烷谷胱甘肽可保护GST-π免受上述抑制剂的修饰,使假一级反应速度常数k_1明显降低,说明羧基、氨基和胍基是GST-π和GSH结合部位的组成基团。作者曾证明GST-π中的一个快反应巯基也参与酶与GSH的结合,故至少有四个不同的基团是酶亚基的结合基团,本文还对TNBS对氨基修饰的特异性作了验证,并讨论了GST-π与GSH结合时形成离子键的情况。     

多核苷酸合成的研究 Ⅺ.酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-端半分子中含N,N-二甲基鸟苷的四核苷三磷酸(CpGpCpm_2~2G)的合成

(1)参照已报道方法,从鸟苷合成了N,N-二甲基鸟苷(m_2~2G)。(2)N、2′、5′-O-三苯甲酰胞苷酸[_(Bz)C~(Bz)(OBz)p],与2′、3′-O-二乙酰基-N,N-二甲基鸟苷[m_2~2G(OAc)_2]经DCC 缩合,脱去保护基后可分离出胞苷酰-(3′→5′)-N,N-二甲基鸟苷(Cpm_2~2G)。(3)_(Bz)C~(Bz)(OBz)p 与N-二甲基氨基甲叉鸟苷酸(G_p~(DMM)),用DCC 缩合,脱保护基后可得到胞苷酰-(3′→5′)-鸟苷-2′,3′-环状磷酸(CpG>p)。(4)用RNase N_1(E.C.2.7.7.26)催化CpG>p 与Cpm_2~2G 反应生成26%产率的CpGpCpm_2~2G。经纯化后产物不含酶,用RNasc N_1水解得到等克分子的CpGp CpG>p 和Cpm_2~2G,碱解可分离出Cp(2′ 3′),Gp(2′ 3′)及m_2~2G,克分子比为2.07:1.0:1.1。     

人绒毛膜促性腺激素β链(β-HCG)羧端基因片段人工合成和表达的研究——Ⅰ.用改进的三酯法化学合成脱氧十二核苷十一磷酸dCCACAATGATAG

本文报道改进的三酯法的建立,并用此法化学合成了脱氧十二核苷酸dCCACAATGAT-AG。其改进之点包括:(1)采用较稳定的保护基,如以对甲氧三苯甲基(MMT)保护核苷的5′羟基,以苯甲酰基保护鸟核苷碱基上的氨基;(2)以3′和5′羟基都不保护的核苷或片段作中间体,它们容易制备,也容易从产物中分离除去;(3)采用高效和稳定的均三甲基苯磺酰硝基三唑为缩合剂;(4)以7M尿素中性(pH7.5)和酸性(pH3.5)阴离子交换柱层析结合使用,分离纯化得到较纯的完全脱去保护基的最终产物,避免了高压液相柱层析的应用。     

大鼠胃泌酸腺细胞膜和肝匀浆对五肽胃泌素及其类似物的降解

 本文用HPLC分离五肽胃泌素(Pentagastrin,Boc-β-Ala-Trp-Met-Asp-Phe·NH_2,PG_(1-5))及其N-端无保护基的TFA·五肽(β-Ala-Trp-Met-Asp-Pne·NH_2·TFA,TFA·PA_(1-5))被胃泌酸细胞膜和肝匀浆降解之产物,并对它们的氨基酸组成作了分析,又用薄层层析作了进一步验证,从而提出了酶促降解时可能的酶切位点。实验结果表明,N-端的Boc-基团能大幅度增加对酶降解的抵抗力,这从一个方面解释了为什么商品五肽胃泌素的泌酸活性大于其它胃泌素类似物的原因。     

胰岛素样生长因子-1对糖尿病勃起功能障碍大鼠的治疗作用研究

目的:研究携有胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因的重组单纯疱疹病毒-1(HSV-1)载体对糖尿病大鼠勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)病变的治疗作用。方法:选用8周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,应用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导糖尿病8周,阿朴吗啡(apomorphine,APO,80 ug/kg)皮下注射进行阴茎勃起试验,筛选出糖尿病ED大鼠模型。随机选取SPF级雄性SD大鼠10只为CN组,从筛选出DMED大鼠模型中随机选取40只,分为DM组,IGF-1组,INS组,IGF-1+INS组,每组10只。DM组、IGF-1组、INS组、IGF-1+INS组分别或同时每只给予胰岛素6 U/d和(或)5×10~8 pfu单纯HSV-1-IGF-1载体。基因治疗21天后,对各组大鼠的阴茎海绵体内压(ICP)进行测定。结果:电刺激诱导ICP值在CN组为(43.40±3.26)cm H_2O,DM组为(13.46±1.70)cm H_2O,IGF-1组(25.34±1.93)cm H_2O,INS组(28.79±2.01)cm H_2O,IGF-1+INS组(42.21±2.13)cm H_2O。各组的IGF-1阳性细胞百分比分别为CN组为(68.24±7.16),DM组为(55.74±5.02),IGF-1组(71.08±7.08),INS组(70.35±3.89),IGF-1+INS组(72.90±2.64)。结论:糖尿病大鼠ED的发生与发展可能与大鼠阴茎中IGF-1表达水平降低有关,通过引入可表达的IGF-1基因和INS治疗可在一定程度上改善大鼠阴茎勃起功能。     

白腐真菌对酸性橙7的脱色降解

偶氮染料广泛应用于纺织、造纸和包装等行业,因其具有三致性、结构稳定且难降解,已成为染料废水处理的研究热点之一。本研究以白腐真菌作为脱色菌株,考察了不同白腐真菌对偶氮类染料酸性橙7(acid orange 7,AO7)的脱色降解,探讨了AO7染料的浓度、pH、温度以及脱色时间对染料脱色率的影响,同时应用紫外-可见光谱吸收法、红外光谱吸收法、高效液相色谱法和气相色谱-质谱法对AO7的降解产物进行分析,并对其产物进行植物毒性实验,以推断AO7可能的降解途径及其降解产物的毒性。结果表明:在pH 4.5、28℃条件下,刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)和杂色云芝(Trametes versicolor)的混合菌丝脱色降解100 mg/L AO7,24 h脱色率可达93.46%。推测AO7可能的生物降解途径:AO7偶氮键断裂生成对氨基苯磺酸和1-氨基-2-萘酚;接着对氨基苯磺酸脱去磺酸基,生成对苯二酚;同时1-氨基-2-萘酚开环生成邻苯二甲酸和对羟基苯甲醛,之后进一步降解生成苯甲酸;最后对苯二酚和苯甲酸继续氧化成其他小分子中间体、H2O和CO_(2)。植物毒性实验表明,P.eryngii和T.versicolor混合菌丝对AO7脱毒效果较好。以上研究为探究白腐真菌在工业废水中降解偶氮类染料的应用奠定基础。     

用半合成方法证明B_(22)-精氨酸不是胰岛素表现活性所必需的

胰岛素六甲酯经胰蛋白酶和羧肽酶B水解,得去B链羧端九肽(B_(22-30))胰岛素五甲酯的两个α-氨基用叔丁氧羰酰(BOC)保护后与X-D—Ala—PheOMe(X=Arg,D-Arg,Gly,Lys或Asp)缩合,去除所有的保护基后得B_(22)改变的去B链羧端六肽胰岛素(D-Ala~B_(22)-DHI)。这些类似物的生物活性表明:Arg~B_(22)能为Lys或Asp代替,这结果说明Arg~B_(22)不是胰岛素活力所必需。但Arg~B_(22)若为D-Arg或Gly代替,活力很低。     

含短C肽人胰岛素原类似物DesB30在毕赤酵母中的表达及纯化

合成含短C肽AAK,并去掉B链第30位苏氨酸(T)的人胰岛素原类似物:HMPIDesB30(human mini-proinsulin des B30)的cDNA,将其插入大肠杆菌和酵母菌的穿梭质粒pPIC9K.用电转移的方法将重组质粒HMPIDesB30/pPIC9K转入甲醇酵母GS115.用含不同G418浓度的YPD平板筛选高拷贝重组子.经优化条件下的高密度发酵,发酵液用SIPI-40大孔树脂吸附,大孔吸附树脂洗脱液经SP柱进一步纯化后,再用10～20 mmol/L Zn2 沉淀,能得到纯度为95%的HMPIDesB30.通过16.5%Tricine SDS-PAGE、HPLC和质谱分析,表达产物分子质量与理论分子质量相符,经高密度发酵,表达量可达1.0 g/L.纯化回收率可达60%.说明人胰岛素原类似物HMPIDesB30能在甲醇酵母中高效分泌表达,并能通过经济有效的方法纯化.     

从胰岛素A及B链重合成胰岛素

(1)用亚硫酸盐及四硫硫酸盐将胰岛素的硫-硫键拆成S-磺酸基后,再经过离子交换或板型电泳分离,可以得到纯的A及B链。(2)用小白鼠惊厥法检查,S-磺酸型A及B链都不具有生物活力。用过量巯基乙酸将纯的A或B链的S-磺酸基还原为巯基,然后分别将还原型的A或B链溶液(pH 8.5)单独在空气中氧化也不产生活力。但将还原型A及B链混合,在同样条件下氧化时,可以获得有活力的产物。活力一般恢复到原活力的5-10%左右。(3)用还原型的A或B链分别与S-磺酸型的B或A链共同保温都可以得到有活力的产物。(4)将恢复活力的重氧化产物进行提纯的结果得到比活力为每毫克18.4国际单位的结晶。这样所获得的晶体其结晶形状、降血糖性质、电泳性质以及在三种溶剂系统中的比移都和结晶胰岛素相同。(5)以上晶体和结晶胰岛素的胃蛋白酶酶解图谱也基本上相同。     

四核苷酸Ap Gp Ap Gp的合成

本文报道了酵母tRNA~(ala)分子中第42—45核苷酸片段——四核苷酸AGAGp的合成。首先我们化学合成了N,2′,5′-全乙酰化腺苷-3′-磷酸N,N-二甲氨基甲叉鸟苷-3′-磷酸的二环己基码啉胍盐,经DCC缩合、脱保护得到Ap Gp,然后通过氯甲酸乙酯环化形成ApG>p,再经RNaseN_1酶促合成为四核苷酸AGAGp。     

胰岛素B链中肽段的合成 Ⅴ.胰岛素B链C-端十肽衍生物的合成及其降解的研究

胰島素B鏈中C-端十肽的衍生物,即cbz·(γ-OCH_3)glu·(N~G-NO_2)arg·gly·phe·phe·tyr·thr·pro·(ε-Tos)lys·ala·OCH_3(B_(21-30))曾从cbz·(γ-OCH_3)glu·(No-NO_2)arg·OH(B_(21-22a))和H·gly·phe·phe·tyr·thr·pro·(ε-Tos)lys·ala·OCH_3(B_(23-30b))用碳二亚胺法于DMF中縮合而得。其中B_(23-30b)由cbz·gly·phe·phe·tyr·thr·pro·(ε-Tos)lys·ala·OCH_3(B_(23-30))經催化氫化而得,B_(21-22a)系由cbz·(γ-OCH_3)glu·ONP和硝基精氨酸縮合而成。B_(21-30)經皂化所得的保护的十肽,cbz·glu·(N~G-NO_2)arg·gly·phe·phe·tyr·thr·pro·(ε-Tos)lys·ala·OH(B_(21-30a)),能为腎羧肽酶所全部水解,而为胰羧肽酶消化时只释放出C-端的丙氨酸,这与N-苄氧羰基八肽(B_(23-30a))或胰島素链經同样处理所得的結果相符。B_(21-30a)經較長时間的催化氫化可以脫除N~α-的苄氧羰基和N~G-的硝基,获得N~ε-对甲苯磺酰化的自由十肽,但用B_(21-30)在同样条件下进行催化氫化所释放出的α-氨基很容易消失,估計它和γ-甲酯縮合,形成四氫吡咯酮?木烹难苌铩T谖⑺嵝匀芤褐杏?0℃的长时期的暴露,短时期的热水浴的处理或在微碱性溶液中进行层析的放置,均能促使此种环化。任何胍基已游离的十肽衍生物,不論其中的α-氨基已否环化,均能定量地被胰蛋白酶水解成八肽和二肽的衍生物,因而肯定了十肽的光学純度。     

两种新型L-苏氨酸醛缩酶的鉴定及活性检测方法

为了实现重要医药中间体p-羟基-α-氨基酸的生物酶法合成,挖掘验证新型的L-苏氨酸醛缩酶.以pET-28a(+)作为表达载体,通过蛋白表达纯化、薄层层析色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)技术分析L-苏氨酸醛缩酶及其催化产物的性质.基于4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三氮唑(Purpald)显色试剂开发检...