B链N端缩短的胰岛素类似物研究——Ⅱ.去B~(1～3)胰岛素CD光谱及生物与免疫活性

本文在前文基础上报道了desB~1、desB~(1～2)、desB~(1～3)、desB~(1～3)B_4~(pYr)的近紫外、远紫外圆二色光谱。近紫外CD光谱显示因B链N端缩短其276nm负值下降,表明N端残基的去除影响分子六体甚至二体的形成。近紫外CD光谱显示随N端残基的逐步去除其分子有序性下降。     

B链N端缩短的胰岛素类似物研究 Ⅱ.去B胰岛素CD光谱及生物与免疫活性

本文在前文基础上报道了desB~1、desB~(1～2)、desB~(1～3)、desB~(1～3)B_4~(pYr)的近紫外、远紫外圆二色光谱。近紫外CD光谱显示因B链N端缩短其276nm负值下降,表明N端残基的去除影响分子六体甚至二体的形成。近紫外CD光谱显示随N端残基的逐步去除其分子有序性下降。     

B链N端缩短的胰岛素类似物研究——Ⅲ.猪desB~1[Trp]~(B_2)胰岛素的制备及性质

本文采用酸稳定性氨基可逆保护基甲基磺酰乙氧羰酰基(MSC)对猪胰岛素氨基进行选择性保护后,经Edman降解两次制得[MSC]_2~(A_1B_(20))desB~(1-2)INS,以此作为半合成起始物,在有N-乙基吗啉存在的二甲亚砜溶液中与甲基磺酰乙氧羰酰色氨酸对硝基苯酯(MSC·Trp·ONP)缩合,中间产物经SP-Sephadex C-25分离后脱保护、纯化,所得最终产物经醋酸纤维薄膜电泳,萤光光谱,氨基酸组成及N-末端分析确证为desB~1[Trp]~(B_2)INS。小白鼠惊厥活力和肝细胞膜受体活力分别为原料胰岛素的60%和52%,放射免疫活力低于原料胰岛素但高于去B_1胰岛素。     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究——Ⅰ.制备及性质

本文报道了一种改进的去B链羧端五肽胰岛素(DPI)的制备方法。按此法可获适宜单晶培养用的DPI制剂。其结晶制剂的受体结合活力为胰岛素的88%。其小白鼠惊厥活力为20I.U./毫克。在Zn~( )存在下和胰岛素有免疫交叉反应。     

去B链C端五肽胰岛素类似物的制备和性质

A_1B_(29)-(MSC)_2胰岛素经胃蛋白酶限制性地水解得A_1-(MSC)-DPI。通过Edman降解方法,从A_1-(MSC)-DPI制备了B链N端缩短的DPI类似物,即:去B_1(Phe)-DPI,去B_(1-2)(Phe Val)-DPI和去B_(1-3)(Phe Val Asn)-DPI。本文还叙述了它们的生物活力。     

2.2埃分辨率B链N端去三肽猪胰岛素(DesB1-3INS)的晶体结构研究

应用同晶差值Ｆｏｕｒｉｅｒ技术和立体化学制约最小二乘精化技术,测定了２．２Ａ。分辨率ＤｅｓＢ１－３ＩＮＳ的晶体结构。晶体属于Ｒ３空间群。精化后的结构模型最终Ｒ因子为０．１７８,同标准键长、键角的均方根偏差分别为０．０１７Ａ。和２．９９°。从电子密度图与模型的拟合来看,独立区内两个分子Ｂ链Ｎ端残基的表现十分清晰,相对于三方二锌猪胰岛素的两个分子,ＤｅｓＢ１－３ＩＮＳ分子Ｉ中Ｂ链Ｎ端的构象发生了变化     

B链N端去二肽(B1～2)C端去五肽(B26～30)胰岛素晶体结构的分子置换法研究

以B链羧端去五肽胰岛素(DPI)结构为模型,应用分子置换法对B链N端去二肽(B1～2)C端去五肽(B26～30)胰岛素(DesB1～2DPI)晶体结构进行了研究.DesB1～2DPI晶体单位晶胞中每个结晶学不对称单位包含1个DesB1～2DPI分子.交叉旋转函数和平移函数搜索均找到了明显突出的峰,确定了DesB1～2DPI分子在晶胞中的取向和位置.进一步的三维模型重建和结构精化结果巩固了DesB1～2DPI的分子置换法研究的正确性.     

胰岛素B链N端和C端缩短对其与胰岛素抗体结合力的影响

本文研究了B链N端和C端缩短的若干胰岛素类似物与胰岛素抗体的结合能力。结果表明:去B链C端五肽胰岛素(DPI)分子中B_1-Phe去除后其与胰岛素抗体结合力明显下降,这与去B_1-Phe胰岛素与胰岛素抗体结合力下降的趋势相似;去B链C端六肽胰岛素(DHI)与胰岛素抗体结合力与DPI非常接近,都为胰岛素的70%左右。而去B链C端七肽胰岛素(DHPI)与胰岛素抗体结合力与去B链C端六肽胰岛素(DHI)相比,其结合力下降了一个数量级。说明胰岛素B_1-和B_(24)-Phe残基对组成和维持胰岛素分子的抗原决定簇起着重要作用。去B链九肽胰岛素(DNI)与胰岛素抗体的结合力与去B链C端八肽胰岛索(DOI)及DHPI相似。本文对上述结果进行了讨论。     

胰岛素结构与功能关系的研究——Ⅲ.去B链羧端六肽胰岛素及其类似物的进一步研究

本文报道了DHI 及D-Ala~B_(22)-DHI制备上的一些改进。通过纯化以后,它们具有约40%天然胰岛素的活力。并能与豚鼠抗猪胰岛素血清产生免疫交叉反应。     

去B链羧端七肽(B24～30)胰岛素的制备——羧肽酶-A限制性水解去五肽胰岛素

用羧肽酶-A对去B链羧端五肽胰岛素进行限制性酶解,得到去B链羧端七肽胰岛素,反应条件是pH7.4,0℃,10小时。水解产物经Sephadex G-50柱分离,并经羧端顺序与氨基酸组成分析鉴定。用小白鼠惊厥法测定,这一去七肽胰岛素制剂有4.7%的胰岛素活力。     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究——Ⅲ.高分辨核磁共振研究

研究了胰岛素(Ins)和去B链羧端五肽胰岛素(DPI)的250兆周核磁共振,发现DPI、Ins核磁共振谱之间存在着差异。这说明胰岛素分子羧端五肽的切除引起在溶液中局部构象变化。这种构象变化似乎不影响Ins分子的生物活性。许多研究表明Ins分子在溶液中存在着解离聚合平衡,聚合状态与溶液浓度、pH有密切关系。如果改变DPI和Ins溶液的浓度及pH,前者波谱变化不明显,后者随溶液浓度、pH增加而增加。Ins波谱中的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸CH_3部分与芳香环质子部分共振峰均加宽。这些说明DPI在无Zn~( )溶液中不存在解离聚合平衡,而可能以单体形式存在。     

去B链羧端九肽胰岛素的制备和性质

去B链C端八肽胰岛素(DOI)经羧肽酶B作用除去B_(22)-精氨酸,产物经SP-SephadexC25分离以后得到电泳均一的去B链C端九肽胰岛素(DNI)。从CD光谱可以看出,在水溶液中DNI的构象比DOI更松散。DNI与人胎盘细胞膜胰岛素受体的结合能力很低,但却比DOI高一些。     

B链羧端去八肽胰岛素的核磁共振研究

用~1H核磁共振(简称NMR)卷积差谱和温度差谱技术对胰岛素与去八肽胰岛素(简称DOI)局部溶液构象进行了比较研究。通过二者NMR谱的比较发现胰岛素和DOI谱的CH_3峰区存在明显差异。DOI三维结构的屏蔽效应明显降低;以缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸CH_3组成的峰区变尖、变窄、接近自由蜷曲状态蛋白质谱。高场区0.42ppm的峰肩为A_2-异亮氨酸在三维结构中受邻近A_(19)-酪氨酸屏蔽影响的高场位移峰,该峰在DOI谱中消失。因此暗示着A链头尾密切联系着的三维结构遭到破坏。用温度差谱简化NMR谱。比较了胰岛素与DOI二者随温度上升构象变化的过程以及各自对热的不稳定性,表明DOI分子在溶液中还保存一定的特定构象;但结构相当松散,热不稳定性增加。胰岛素经去B链羧端八肽后局部构象将有明显变化,可能导致胰岛素某种特定空间结构受到破坏。这也可能是DOI分子生物活性丧失的一个重要原因。     

B 链羧端去八肽胰岛素的核磁共振研究

用~1H 核磁共振(简称NMR)卷积差谱和温度差谱技术对胰岛素与去八肽胰岛素(简称DOI)局部溶液构象进行了比较研究。通过二者NMR 谱的比较发现胰岛素和DOI 谱的CH_3峰区存在明显差异。DOI 三维结构的屏蔽效应明显降低;以缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸CH_3组成的峰区变尖、变窄、接近自由蜷曲状态蛋白质谱。高场区0.42ppm 的峰肩为A_2-异亮氨酸在三维结构中受邻近A_(19)-酪氨酸屏蔽影响的高场位移峰,该峰在DOI 谱中消失。因此暗示着A 链头尾密切联系着的三维结构遭到破坏。用温度差谱简化NMR 谱。比较了胰岛素与DOI 二者随温度上升构象变化的过程以及各自对热的不稳定性,表明DOI 分子在溶液中还保存一定的特定构象;但结构相当松散,热不稳定性增加。胰岛素经去B 链羧端八肽后局部构象将有明显变化,可能导致胰岛素某种特定空间结构受到破坏。这也可能是DOI 分子生物活性丧失的一个重要原因。     

B链C端去七肽(B24～B30)胰岛素的分子置换法

一个几近失活的胰岛素类似物———B链C端去七肽 (B2 4～B30 )胰岛素(DHPI)已被结晶 .该晶体属于空间群P2 ₁2 ₁2 ₁,晶胞的 1个独立区内包含有 2个DHPI分子 .应用分子置换法确定了DHPI分子在晶胞中的取向和位置 ,并在 0 .3nm分辨率水平上构建了结构模型 .研究结果表明 ,一个独立区内的 2个DHPI单体分子由一个非晶体学 2次轴联系着 ,该局部 2次轴近似平行于晶体学c轴 .这一特性直接影响了自身旋转函数对该局部对称轴取向的确定     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究——Ⅱ.晶体生长及其初步结晶学观察

培养了两种可供初步又一光衍射实验用的去五肽胰岛素的晶体,并对其进行了结晶学参数的测定。     

B链氨端去－肽（B1）羧端去五肽（B26—30）猪胰岛素的初步晶体学研究

应用悬滴气相扩散法在含６％氯化纳和１２．５％丙酮的柠檬酸缓冲体系中,获得可供Ｘ射线结构分析用的Ｂ链氨端去一肽（Ｂ１）羧端去五肽（Ｂ２６—３０）猪胰岛素（ＤｅｓＢ１－ＤＰＩ）单晶体。晶体属四方晶系,空间群为Ｐ４１２２或Ｐ４３２２,晶胞参数为：ａ＝ｂ＝３６．０Ａ,ｃ＝１２０．０Ａ,ａ＝β＝γ＝９０°。单位晶胞中每个结晶学不对称单位含有２个ＤｅｓＢ１—ＤＰＩ分子。     

B链氨端去－肽（B1）羧端去五肽（B26—30）猪胰岛素的初步晶体学研究

应用悬滴气相扩散法在含６％氯化钠和１２．５％丙酮的柠檬酸缓冲体系中,获得可供Ｘ射线结构分析用的Ｂ链氨端去－肽（Ｂ１）羧端去五肽（Ｂ２６－３０）猪胰岛素单晶体。晶体属四方晶系,空间群为Ｐ４１２２或Ｐ４３２２,晶胞参数为：ａ＝ｂ＝３６．０Ａ,ｃ＝１２０．０Ａ,α＝β＝γ＝９０度。单位晶胞中每个结晶学不对称单位含有２个ＤｅｓＢ１－ＤＰＩ分子。     

S-磺酸型胰岛素B链的直线聚合作用——Ⅰ.现象

在同种蛋白质分子间的相互作用中,直线聚合占有一特殊的地位。分子通过次级键的结合,首尾相连,又侧向聚集,形成纤维。此中,研究得最早的是结晶胰岛素形成纤维状胰岛素的过程;这个可逆的球状纤维状(G F)的变化,第一次填平了两大类蛋白质之间的鸿沟。Waugh和同工作者详细地研究了胰岛素直线聚合机制的一些方面。胰增血糖激素、镰刀状血红蛋白等与此同类。原肌球蛋白的直线聚合作用也有过不