视黄酸对海马神经元细胞内钙离子浓度的影响

探讨全反式视黄酸(all-trans retinoic acid,atRA)对原代培养的海马神经元胞内钙离子浓度的影响,以进一步了解atRA参与学习记忆可能机制。分离新生Wistar大鼠海马,采用添加B27的无血清培养液进行海马神经元原代培养,免疫荧光鉴定培养的神经细胞;以fura-2/AM温育海马神经元,采用钙离子测定系统动态观察视黄酸对海马细胞内钙离子浓度的影响。结果显示:(1)培养的神经元纯度达90%;(2)atRA作用于海马神经元,能引起海马神经元胞内钙离子浓度的升高;(3)这种升高与atRA浓度及神经元的发育时间相关;(4)钙离子升高的具体方式是通过细胞外钙离子内流;(5)视黄酸核受体alpha(RARα)的拮抗剂Ro41-5253(Ro)对atRA升高的神经元胞内钙离子浓度有抑制作用。atRA与RARα结合,促使海马神经元胞外钙离子的内流,这可能是atRA参与学习记忆的机制之一。     

垂体腺苷酸环化酶激活肽减轻谷氨酸对海马神经元的损伤并抑制胞内钙升高

对原代培养７～９ｄ的海马神经元给予谷氨酸处理,２４ｈ后,神经元的存活率降低。预先给予垂体腺苷酸环化酶激活肽（ＰＡＣＡＰ）能显著减少谷氨酸引起的海马神经元死亡。谷氨酸呈剂量依赖性增加海马神经元细胞内钙离子含量,ＰＡＣＡＰ能抑制谷氨酸引起的海马神经元细胞内钙离子浓度的升高,特异性ＰＡＣＡＰ Ⅰ型受体拮抗剂ＰＡＣＡＰ ６－３８能完全阻断ＰＡＣＡＰ减轻谷氨酸所致海马神经元损伤及降低谷氨酸所致神经元细胞内钙     

缺氧缺糖对培养海马神经细胞中一氧化氮和钙离子的影响

在缺血性脑损伤中 ,NO起着重要作用。研究了原代培养的海马神经细胞中 ,缺氧缺糖对NO合成的影响。利用激光共聚焦显微镜和荧光指示剂 ,对胞内钙离子和NO的变化进行实时检测 ,并用HPLC检测了缺氧缺糖导致的谷氨酸释放。结果表明 ,缺氧缺糖引起胞内钙离子浓度升高和NO合成增加。经过 2 0min缺氧缺糖处理后 ,胞外谷氨酸的浓度比对照组高出约10 0 %。N 甲基 D 天冬氨酸 (N methyl D aspartate,NMDA)的拮抗剂MK 80 1对缺氧缺糖引起的细胞内钙离子和NO的升高有明显抑制作用。去除细胞外液的钙离子和加入钙调蛋白抑制剂三氟拉嗪都可以抑制缺氧缺糖引起的NO升高。以上结果提示 ,缺氧缺糖引起神经细胞NO合成增加 ,这种合成受谷氨酸释放 ,胞内钙离子浓度和钙调蛋白的调控。     

应用激光共聚焦扫描技术对海马脑片神经元内钙的观察

用微量注射法将荧光剂Ｆｌｕｏ－３注入大鼠海马,对神经元进行在体荧光标记,可清晰地标记多个神经细胞。联合应用激光共聚焦扫描显微镜,观察大鼠海马脑片ＣＡ１锥体细胞在青霉素,谷氨酸模拟致痫及缺糖缺氧时胞内钙的变化。结果显示：无镁时,谷氨酸和青霉素可致海马ＣＡ１锥体细胞胞内钙的缓慢增加;离体缺糖缺氧时ＣＡ１锥体细胞胞内钙亦增多。     

大鼠海马脑片缺氧诱导Ca~(2 )/CaM PKII活性抑制机理的研究

采用大鼠海马脑片体外缺氧模型,观察了Ca2 和氯胺酮对海马脑片Ca2 ／CaMPKⅡ活性的影响,同时观察了缺氧对神经元胞外谷氨酸堆积的影响。结果如下：（1）有钙或无钙培养时,酶活性随缺氧时间的延长均下降,但前者比后者酶活性下降更显著,提示外ca2 在神经元缺氧损伤中起重要作用。（2）海马脑片在体外缺氧30min,谷氨酸在胞外的堆积增加2倍多。（3）单纯过量外源性谷氨酸能引起酶活性显著下降,提示脑缺氧时酶活性的抑制与兴奋毒性有关。（4）氯胺酮对缺氧和单纯外源性谷氨酸所诱导的酶活性抑制均有明显的拮抗作用,说明脑缺氧引起酶活性下降与NMDA受体介导有关。我们的结论是：脑缺氧时该酶活性的抑制是与下列途径有关：谷氨酸→NMDA受体→Ca2 →Ca2 靶酶。     

丙二醛破坏大鼠海马神经元胞质钙离子稳态的信号机制

目的研究丙二醛（MDA）对原代培养的海马神经元胞质中钙离子稳态的破坏作用及可能的信号机制。方法以Fur2／AM为荧光指示剂,采用荧光分光光度法定量测定原代培养海马神经元胞质游离钙浓度变化。结果随着MDA浓度的升高和作用时间的延长,导致胞质中游离钙水平显著升高,破坏其钙稳态。MDA所导致的海马神经元胞质游离钙水平升高包括两个过程：100μmol／L的MDA可使胞质[Ca2＋]i水平在0—10min内的早期渐进升高过程,经历中间大约5min的平台期后,接下来15—30min的晚期显著升高。以细胞膜电压依赖的Ca2＋通道抑制剂nimodipine抑制外钙内流后,可显著抑制晚期胞质[Ca2＋]i水平的升高,以PLC的抑制剂U73122作用后,则可抑制早期胞质[Ca2＋]i水平的升高。结论100μmol／L的MDA作用下,海马神经元胞质中早期钙离子水平的升高和晚期钙离子水平的升高可能分别由不同的信号机制所介导。     

ATP 调控大鼠胰腺β细胞胰岛素分泌的双重作用

实验以大鼠胰腺β细胞为研究对象,采用荧光测钙和全细胞膜片钳膜电容测量技术,研究 ATP 对胞内钙离子信号和细胞分泌的影响,并初步探讨了其作用机制 . 实验表明：胞外 ATP 刺激通过动员细胞内 thapsigargin 敏感的钙库 Ca2+ 释放,使大鼠胰腺β细胞内的游离钙离子浓度显著升高,细胞外的 ATP 信号对β细胞胰岛素分泌有双向调节作用,其一,主要通过降低去极化引起的钙电流而对β细胞胰岛素分泌产生较弱的抑制作用,其二,细胞在静息状态下, ATP 通过动员胞内钙库的 Ca2+ 释放使胞浆中的钙离子浓度显著增加,触发β细胞强烈分泌胰岛素 . ATP 的这种双向调节可能对胰岛素分泌的精确调控具有重要的生理意义 .     

芋螺毒素SO3对大鼠海马神经元缺氧后胞内游离钙离子浓度的影响

目的:研究芋螺毒素SO3对培养大鼠海马神经元缺氧后胞内游离钙离子浓度的影响.方法:运用激光共聚焦显微镜(CLSM)测定缺氧后大鼠海马神经元胞内游离钙离子浓度的变化.结果与结论:芋螺毒素SO3可以明显抑制因缺氧所致原代培养大鼠海马神经元胞内游离钙离子浓度的上升.     

谷氨酸对原代培养海马神经元的兴奋特性

目的:探索谷氨酸对培养大鼠海马神经元的兴奋特性.方法:分离及培养1日龄SD大鼠海马神经元,第9～15 d用膜片钳检测不同浓度谷氨酸对神经元兴奋特性,包括细胞膜电位、去极化/动作电位的影响.结果:谷氨酸降低海马神经元静息膜电位,诱发去极化/动作电位,高浓度谷氨酸处理组神经元的静息膜电位比低浓度组降低显著;100μmol/L谷氨酸长时间处理组的神经细胞膜电位显著低于短时间处理组.结论:谷氨酸对海马神经元兴奋性有浓度和时间依赖性.     

突触后钙通路有助于视锥与L型水平细胞间的突触可塑性

我们实验室以前发现,视网膜视锥与亮度型水平细胞（luminosity—type horizontal cell,LHC）之间的突触传递效率具有可塑性。重复性刺激红敏视锥增加了LHC对红光的超极化反应幅度,而且这种增强作用是可逆的。在本文中,我们运用细胞内记录技术和药理学分析的方法来考察重复性红光刺激引起的反应增强的可能机制。当通过胞内注射Ca^2＋的螯合剂EGTA来降低LHC内的Ca^2＋浓度后,重复性红光引起的反应增强被抑制,提示突触后钙信号是反应增强的一个重要因素。另外,反应增强现象还可以被钙离子通透的AMPA受体（Ca^2＋-permeable AMPA receptor,CP-AMPAR）的拈抗剂阻断,说明通过钙离子通透的谷氨酸受体内流的Ca^2＋与胞内Ca^2＋浓度的改变有关。进一步发现,胞外灌流ryanodine或caffeine也可以消除反应增强现象,说明由钙诱导的钙释放（calcium—induced calcium release,CICR）引起的钙信号可能也参与了反应增强现象的产生。结果提示,CICR和CP—AMPAR与重复性红光刺激引起的LHC对红光的反应增强有关。     

Ca~(2+)信号在肿瘤坏死因子-α诱导心肌肥大PI3-K信号途径中的作用

目的:研究Ca2+信号在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导心肌细胞肥大PI3-K信号途径中的作用。方法:Lowry法测心肌细胞蛋白含量;计算机图像分析系统测心肌细胞体积;[3H]-亮氨酸掺入法测心肌细胞蛋白合成;Till阳离子测定系统观察胞内[Ca2+]i瞬变。结果:①TNF-α(100μg/L)明显诱导心肌细胞蛋白含量、蛋白合成及体积的增加,PI3-K特异性抑制剂LY294002(50μmol/L)明显抑制TNF-α诱导的心肌肥大,但对正常心肌细胞生长无影响。L型Ca2+通道阻断剂verapamil(1μmol/L)对TNF-α诱导的心肌肥大无明显影响。②TNF-α引起心肌细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)瞬间变化幅度增高,LY294002明显降低TNF-α诱导的上述改变,L型Ca2+通道阻断剂verapamil(1μmol/L)对TNF-α引起的变化无明显影响。结论:PI3-K可能通过引起心肌细胞[Ca2+]i升高参与TNF-α诱导的心肌细胞肥大,但与L型Ca2+通道无关。     

肾上腺髓质素对低氧时肺成纤维细胞内钙离子动态变化的影响

目的 动态观察低氧(2％O2)对培养的人胚肺成纤维细胞内游离钙离子浓度的影响及肾上腺髓质素预处理对其作用.方法 1、采用体外细胞培养方法,培养并鉴定人胚肺成纤维细胞;2、建立人胚肺成纤维细胞低氧(2％O2)模型;3、采用激光扫描共聚焦显微镜技术动态观测低氧时成纤维细胞内游离钙离子浓度的变化及肾七腺髓质素对其影响.结果 低氧促进成纤维细胞内游离钙离子浓度升高.与常氧组比较,低氧后成纤维细胞内游离钙离子浓度增加,标准荧光值峰值上升了70％ (P＜0.01).肾上腺髓质素预处理成纤维细胞后,低氧引起的成纤维细胞内游离钙离子浓度升高受到抑制,标准荧光值峰值上升了40％(P＜0.01),持续时间缩短了20s.结论 肾上腺髓质索可以抑制低氧引起的人胚肺成纤维细胞内游离钙离子浓度增加,提示这可能是其发挥调节成纤维细胞功能的作用机制之一.     

噪声暴露对大鼠事件相关电位P300的影响及其海马水平的机制

目的：研究噪声暴露对大鼠事件相关电位（ERP）的影响及海马水平的机制。方法：雄性SD大鼠,随机均分为正常对照组（C组）、噪声暴露组（N组）。暴露条件：105dB白噪声2．5h／d×20d。观察试验过程中第0、7、14和20d ERP各波的峰潜伏期以及峰峰幅度值,并检测海马神经元尼氏体、NMDAR2B及胞内钙浓度的变化。结果：在实验第14d、第20d,噪声暴露组动物ERP P3a、P3和P3b的峰潜伏期显著增长,而且在噪声暴露20d后,大鼠海马齿状回以及CA1区尼氏体显著减少（P〈0．01）,齿状回、CA1及CA3区NMDAB2B的免疫反应强度显著降低（P〈0．01）,神经元胞内钙浓度显著升高（P〈0．01）。结论：噪声暴露可致事件相关电位的改变,这可能与其海马神经元尼氏体、NMDAR2B以及胞内钙的变化有关。     

多功能的钙／钙调素依赖的蛋白激酶II介导的细胞信号传导

钙调素（Calmodulin,CaM）是一个特别的对钙敏感的蛋白,在钙信号传导通路中扮演重要角色钙／钙调素依赖性蛋白激酶（Calcium／calmodulin-dependent kinases（CaMKs））与荷尔蒙、神经迷质及其他信号引起的细胞反应相关、作为重要的第二信使,钙／钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaM—KⅡ）是一类在细咆中无所不在的表达的蛋白激酶,能维持细胞内的钙浓度在很低的水平,再增加后续的特定的钙激动刺激。钙／钙调素依赖的簧白激酶Ⅱ独特的全酶结构和自我调节的性质使其对短暂的钙信号和胞内钙的变化能做出延长反应：本文从结构、合成、细胞分布、反应底物、生理功能等方面介绍了钙／钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ的激活对细胞信号传导的作用。     

二维回转培养对MLO-Y4骨样细胞PKD2表达定位及胞内钙信号的影响

目的：PKD2（polycystin2,多囊肾病蛋白2）能够在细胞膜上形成无选择性的阳离子通道,在肾上皮细胞中PKD2与初级纤毛共定位,通过改变胞内的钙信号过程参与细胞对力学刺激的响应。本实验通过二维回转培养来模拟失重效应,旨在探讨二维回转培养对MLO-Y4骨样细胞PKD2表达定位,及胞内钙信号的影响。初步了解PKD2在小鼠骨样细胞MLO-Y4响应力学刺激过程中起的作用。方法：采用二维回转培养骨样细胞MLO-Y4,用RT-PCR和western blotting检测PKD2的表达,用荧光共聚焦显微镜检测细胞中PKD2与初级纤毛的定位及细胞内钙离子含量。结果：与对照组相比,在二维回转培养后,骨样细胞MLO-Y4的PKD2表达在mRNA和蛋白水平都有明显的下降,PKD2、PKD1（polycystin1,多囊肾病蛋白1）和乙酰化的α-tubulin共定位,同时二维回转培养降低了细胞内钙离子含量。结论：在二维回转培养下,PKD2可能通过调节自身表达来改变细胞膜上PKD通道的数目和开放情况来影响细胞内钙离子含量,参与骨细胞对细胞外应力的感受过程,其详细机制还有待进一步实验研究。这将对探讨骨细胞响应力学刺激的具体机制提供重要的理论依据。     

Lysophosphatidic Acid Induces a Sustained Elevation of Neuronal Intracellular Calcium

Abstract: Lysophosphatidic acid (LPA) is a lipid biomediator enriched in the brain. A novel LPA-induced response in rat hippocampal neurons is described herein, namely, a rapid and sustained elevation in the concentration of free intracellular calcium ([Ca²⁺]_i). This increase is specific, in that the related lipids phosphatidic acid and lysophosphatidylcholine did not induce an alteration in [Ca²⁺]_i. Moreover, consistent with a receptor-mediated process, there was no further increase in [Ca²⁺]_i after a second addition of LPA. The LPA-induced increase in [Ca²⁺]_i required extracellular calcium. However, studies with Cd²⁺, Ni²⁺, and nifedipine and nystatin-perforated patch clamp analyses did not indicate involvement of voltage-gated calcium channels in the LPA-induced response. In contrast, glutamate appears to have a significant role in the LPA-induced increase in [Ca²⁺]_i, because this increase was inhibited by NMDA receptor antagonists and α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate (AMPA)/kainate receptor antagonists. Thus, LPA treatment may result in an increased extracellular glutamate concentration that could stimulate AMPA/kainate receptors and thereby alleviate the Mg²⁺ block of the NMDA receptors and lead to glutamate stimulation of an influx of calcium via NMDA receptors.     

河豚毒素停搏液对缺血／再灌注心肌细胞钠超载的影响

目的：观察Na^＋通道阻滞剂河豚毒素（TTX）极化心脏停搏液对离体大鼠心肌细胞内游离Na^＋浓度（[Na^＋]i）的影响。方法：成年Wistar大鼠心脏,用酶解法分离成具有搏动性的单个心室肌细胞悬液,随机分成基础组、STH2组（缺血／再灌注损伤对照组）和TTX组（实验组）,STH2组和TTX组分别应用St．ThomasⅡ号停搏液和TTX停搏液处理,建立模拟缺血／再灌注损伤的停搏／复搏细胞模型,激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）测定各组细胞不同时期的[Na^＋]。倒置显微镜观察细胞形态学变化。结果：TTX组和STH2组细胞复搏后[Na^＋];均明显高于基础组（P〈0．01）,但TTX组明显低于STH2组（P〈0．01）;在停搏期间,TTX组细胞[Na^＋]i上升速度和幅度明显低于STH2组;形态学观察,TTX组复搏后具有正常活力的杆形心肌细胞比例高于STH2组（P〈0．01）。结论：河豚毒素心脏停搏液较去极化心脏停搏液能减轻心肌细胞Na^＋超载和缺血／再灌注损伤。     

Hypoxia increases calcium flux through cortical neuron glutamate receptors via protein kinase C

The effects of 30 s to 10 min hypoxia (PO2-10 mmHg) on glutamate receptor activity were studied in murine cortical neurons. Receptor activity was assessed as a rise in intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) following a 10 s application of 1 mm glutamate or 100 micro mN-methy-d-aspartate (NMDA) in the presence of 0.1 mm Mg2+ and 10 micro m glycine. Change in [Ca2+]i elicited by glutamate increased 26% (n = 192, p < 0.001) and that to NMDA by 74% (n = 9, p < 0.01) during a 100-s period of hypoxia. After 10 min hypoxia, responses to glutamate were 62% smaller than those in normoxia, with increased basal intracellular [Ca2+]i predicting reduced receptor activity. When neurons were exposed to NMDA after 10 min of hypoxia, [Ca2+]i increases were 12% smaller than after 100 s hypoxia, but still 53% larger than in oxygenated neurons (n = 9, p = 0.01). Neurons expressed relatively similar amounts of NR2A, -B, -C, and -D subunits. The phosphorylation of NMDA NR1 subunits increased during hypoxia. Pre-treatment of neurons with a protein kinase C (PKC) inhibitor (chelerythrine, 10 micro m) prevented increases in N-methy-d-aspartate receptor (NMDAR) activity during hypoxia and reduced the phosphorylation of NR1 subunits. These results suggest that enhancement of glutamate receptor activity during the first minutes of hypoxia is mediated by phosphorylation of NMDARs by PKC and that other mechanisms, possibly involving intracellular calcium, limit glutamate receptor-mediated calcium influx during longer periods of hypoxia.     

谷氨酸、NMDA 和吗啡对培养大鼠星形胶质细胞内钙振荡的影响

目的:研究谷氨酸、NMDA、吗啡对原代培养的大鼠星形胶质细胞的胞内钙信号的影响及受体作用机制.方法:利用Leica AF6000活细胞工作站,检测谷氨酸、NMDA、吗啡分别灌流前后Fura-2/AM加载的星形胶质细胞内钙信号的动态变化,进一步观 察分别阻断代谢性谷氨酸受体5 (mGluR5)、NMDA受体(NMDA receptor,NMDAR)和阿片μ受体对诱导的胞内钙振荡的影响.结果:谷氨酸、NMDA、吗啡均可明显升高胞内游离钙的浓度([Ca2+]i),而将其相应受体拮抗后,星形胶质细胞[Ca2+]i升高的现象可以被显著抑制.结论:离体培养的星形胶质细胞膜上存在mGluR5、NMDAR和阿片μ受体,这些受体的激活可以升高星影胶质细胞的[Ca2+]i,且这些受体依赖的[Ca2+]i的调控机制可能是星形胶质细胞与神经元交互作用的重要途径之一.