结核杆菌抗原85A与小鼠白细胞介素21共表达DNA疫苗的构建及其免疫效应研究

目的:利用真核表达质粒pRSC,构建结核杆菌抗原85A(Ag85A)与小鼠白细胞介素21(mIL21)共表达重组体pRSC-mIL21-Ag85A,为研究新型结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。方法:从质粒pcDNA3.1-mIL21中经PCR扩增出mIL21基因,并插入质粒pRSC中构成pRSC-mIL21;再从pIRES-Ag85A质粒中经PCR扩增出Ag85A基因,构建于pRSC-mIL21重组质粒上,成为共表达DNA疫苗pRSC-mIL21-Ag85A。结果:经酶切、基因测序证实,该疫苗构建正确并能成功表达目的基因。共表达DNA疫苗免疫小鼠后,CTL活性、特异性淋巴细胞增殖水平及小鼠血清特异性抗体均呈有意义的提高。结论:结核杆菌Ag85A与mIL21共表达DNA疫苗能诱导小鼠免疫反应,为进一步研究DNA疫苗抗结核杆菌攻击的免疫防护效应奠定了基础。     

结核杆菌Ag85B基因疫苗的免疫保护效果研究

为研究结核杆菌Ag85B基因疫苗的免疫原性和免疫保护效果,将雌性C57BL/6N小鼠32只,随机分为4组,即结核杆菌Ag85B基因疫苗组、BCG组、pcDNA3.1( )组和PBS组.取各免疫组小鼠脾细胞培养上清检测细胞因子水平;同时进行CTL杀伤活性检测;进一步用结核杆菌H37Rv国际标准强毒株静脉注射攻击小鼠,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,对小鼠部分肺和脾组织作病理切片,HE染色观察组织病变程度,Z-N染色检查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果.结果表明,结核杆菌Ag85B基因疫苗对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护效果,能够诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,细胞因子IFN-γ和IL-1分泌增加,IL-4分泌减少,CTL特异性活性增加;使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少,组织病变明显减轻.     

口服脂质体包裹Ag85A DNA疫苗诱导抗体的产生

制备脂质体包裹的Ag85A口服DNA疫苗,并观察小鼠口服后所诱生的抗体产生情况。用脂质体包襄重组质粒pcDNA3．1／mye—HisA—Ag85A制备口服DNA疫苗,并用脂质体包裹空质粒pcDNA3．1／myc—HisA作为对照。将C57BL／6小鼠随机分为3组,即生理盐水组、空质粒组和重组质粒DNA疫苗组。分别将生理盐水、空质粒和重组质粒DNA疫苗以灌胃方式投给各组小鼠,共免疫3次,每次间隔14d,末次免疫后14d处死小鼠,ELISA法检测血清中Ag85A特异性抗体水平,放射免疫法测定肠组织中分泌型IgA（sIgA）含量。重组质粒组血清中Ag85A特异性抗体滴度为1：160,空质粒组和生理盐水组血清中均未捡出Ag85A特异性抗体。重组质粒组肠组织中slgA含量（0．3761±0．0456）μg／mL较空质粒组（0．2374±0．0414）μg／mL和生理盐水（0．1993±0．0899）μg／mL组显著增高（P〈0．05）,而空质粒组和生理盐水组未见有意义的变化（P〉0．05）。口服脂质体包裹Ag85ADNA疫苗可诱导外周特异性抗体的产生和肠道黏膜局部sIgA的水平的升高。     

结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表达载体的构建

目的构建结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因,并对其在体外真核细胞中进行表达。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中分别扩增Ag85B、Esat6、HspX基因,插入到pUC19-T载体,序列测定正确后,将融合基因再次克隆到真核表达载体pcDNA3.1（-）。重组质粒经酶切鉴定并测序正确后,用MegaTran1.0转染293T细胞,并用Western-Blot检测目的蛋白的表达。结果 Western-blot检测到分子量大小约65 kDa的目的蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表达载体,且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达。     

IL-18 DNA免疫对HIV-1核酸疫苗诱导的免疫应答的影响

为了研究白细胞介素-18(IL-18)基因对人免疫缺陷病毒(HIV-1)核酸疫苗诱导免疫应答的影响,将人IL-18基因插入到真核表达载体pVAX1中,构建了真核表达载体pVAX1-IL-18;将pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18或者pCI-neoGAG单独免疫Balb/c小鼠,检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ,同时观察免疫小鼠脾淋巴细胞增殖和小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.酶切及测序结果表明成功地构建了人IL-18基因真核表达载体;与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠血清的抗HIV-1p24抗体滴度降低(P<0.01);而与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠血清的IFN-γ升高(P<0.01);pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)以及特异性CTL活性均高于pCI-neoGAG免疫组(P<0.01).IL-18基因联合HIV-1核酸疫苗免疫小鼠,可能增强特异性Th1细胞和CTL反应,白细胞介素-18基因对体液免疫有抑制作用.     

小鼠对结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫反应

目的研究结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫原性。方法将40只BALB/c小鼠随机分成4组,NS组、BCG组、pcDNA-HspX组和pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX组,每组10只。BCG组只在0周时皮内注射卡介苗1次。NS组、pcDNA-HspX组及融合基因组分别于0、2、4周肌肉注射生理盐水和重组质粒DNA,共免疫3次。在免疫的第2周,4周及最后一次免疫后2周检测体血清中的总IgG水平。同时,最后一次免疫后2周,取脾细胞检测细胞免疫反应。结果构建的融合基因重组质粒DNA免疫动物后能产生针对结核杆菌特定抗原的特异性细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性。结论结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因可作为DNA疫苗进行保护作用的研究。     

人IL-12与结核分枝杆菌抗原ESAT-6联合基因疫苗的免疫效果观察

人白细胞介素12(IL-12)与结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达质粒联合基因免疫,诱导免疫应答效果观察。近交系BALB/c小鼠,随机分组:A组(生理盐水对照)、B组(pcDNA3.1空质粒对照)、C组(BCG对照)、D组(pcESAT-6)和E组(pcIL-12 pcESAT-6)。B、D、E质粒免疫组小鼠分别于胫前肌肌肉注射布比卡因(7.5g/L)和质粒的混和物(1∶4,100μL,含质粒70μg/次),A组小鼠肌肉注射生理盐水和布比卡因的混和物(1∶4,100μL),均间隔2周免疫一次,共免疫3次;末次免疫时,C组小鼠皮下注射BCG菌液,0.3mL/只,含106CFU/mL。末次免疫后14d和28d,各组小鼠分别取血分离血清用于总IgG测定,同时分离脾细胞,经TB-PPD刺激后检测脾细胞增殖(XTT比色法)活性和脾细胞培养上清液中γ干扰素(IFN-γ)、白介素4(IL-4)分泌水平。pcESAT-6质粒DNA单独免疫(D组)或与pcIL-12质粒DNA联合免疫(E组),均能诱导小鼠产生特异性抗体,且抗体水平在末次加强免疫后14~28d逐渐增加;但pcIL-12与pcESAT-6联合免疫后,特异性抗体水平较pcESAT-6单独免疫增加不明显(P<0.05)。C、D、E组免疫小鼠脾细胞体外经TB-PPD刺激后,E组小鼠特异性淋巴细胞增殖活性和IFN-γ分泌水平明显强于C组和D组(P<0.05),而IL-4分泌水平相互间未发现明显差异。末次加强免疫后14~28d,E组小鼠脾细胞增殖活性维持在较高水平,而C组小鼠脾细胞增殖活性先低后高,D组则先高后低;IFN-γ诱生水平,E组最高,C组次之,D组最低。pcIL-12与pcESAT-6质粒DNA联合免疫后能刺激机体产生强烈的细胞免疫和稳定的体液免疫,在动物体内诱发的细胞免疫较ESAT-6或BCG单独免疫时均有明显增加并维持较长时间,此外联合免疫后诱导的体液免疫也较BCG免疫有明显增加。     

IL—18DNA免疫对HIV—1核酸疫苗诱导的免疫应答的影响

为了研究白细胞介素-18(IL-18)基因对人免疫缺陷病毒(HIV-1)核酸疫苗诱导免疫应答的影响,将人IL-18基因插入到真核表达载体pVAX1中,构建了真核表达载体pVAX1-IL-18;将pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18或者pCI-neoGAG单独免疫Balb/c小鼠,检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ,同时观察免疫小鼠脾淋巴细胞增殖和小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。酶切及测序结果表明成功地构建了人IL-18基因真核表达载体;与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠血清的抗HIV-1p24抗体滴度降低(P<0.01);而与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠血清的IFN-γ升高(P<0.01);pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)以及特异性CTL活性均高于pCI-neoGAG免疫组(P<0.01)。IL-18基因联合HIV-1核酸疫苗免疫小鼠,可能增强特异性Th1细胞和CTL反应,白细胞介素-18基因对体液免疫有抑制作用。     

IL-12基因对HIV-1核酸疫苗诱导的免疫应答的影响

研究白细胞介素-12(IL 12)基因对HIV-1核酸疫苗诱导免疫应答的影响,以探求治疗性HIV-1核酸疫苗的新策略.将pCI-neoGAG联合白细胞介素-12基因或者pCI-neoGAG单独免疫Balb/c小鼠,通过ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ,通过MTT实验检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖实验,通过乳酸脱氢酶(LDH)实验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应.与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合白细胞介素-12基因免疫组小鼠血清的抗HIV-1p24抗体滴度降低,有显著性差异(P＜0.01);而与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合白细胞介素-12基因免疫组小鼠血清的IFN-γ升高,有显著性差异(P＜0.01);pCI-neoGAG联合白细胞介素-12基因免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)以及特异性CTL活性均高于pCI-neoGAG免疫组,有显著性差异(P＜0.01).因此,白细胞介素-12基因基因联合HIV-1核酸疫苗免疫小鼠,可能增强特异性Th1细胞和CTL反应,白细胞介素-12基因对体液免疫有抑制作用.     

IL-12基因对HIV-1核酸疫苗诱导的免疫应答的影响

研究白细胞介素 12(IL 12)基因对HIV 1核酸疫苗诱导免疫应答的影响,以探求治疗性 HIV 1 核酸疫苗的新策略。将 pCI neoGAG联合白细胞介素 12基因或者 pCI neoGAG单独免疫 Balb/c小鼠,通过 ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体和 IFN γ,通过MTT实验检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖实验,通过乳酸脱氢酶(LDH)实验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。与 pCI neoGAG免疫组比较,pCI neoGAG联合白细胞介素 12基因免疫组小鼠血清的抗 HIV 1p24 抗体滴度降低,有显著性差异(P< 0. 01);而与 pCI neoGAG 免疫组比较, pCI neoGAG联合白细胞介素 12基因免疫组小鼠血清的 IFN γ升高,有显著性差异(P<0.01);pCI neoGAG联合白细胞介素 12基因免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)以及特异性 CTL活性均高于 pCI neoGAG免疫组,有显著性差异(P<0.01)。因此,白细胞介素 12基因基因联合HIV 1核酸疫苗免疫小鼠,可能增强特异性Th1细胞和CTL反应,白细胞介素 12基因对体液免疫有抑制作用。     

结核分枝杆菌Ag85A DNA的克隆与原核表达

抗原85(Ag85)复合体是BCG合成分泌的可刺激机体产生细胞免疫和体液免疫应答。Ag85A是抗原85复合体组成成分之一,可显著刺激细胞免疫功能增强。研究构建了高效表达的pTrcHisB-Ag85A基因重组质粒,并将其转化至大肠埃希菌TOP10中进行重组蛋白的表达,筛选转化物,SDS-PAGE进行蛋白表达的分子量检测,并通过Western Blotting方法,应用抗Ag85A的单克隆抗体进一步确认重组Ag85A蛋白的表达,建立了Ag85A的原核表达体系,为进一步制备出有效的重组Ag85A疫苗奠定基础。     

Ag85ADNA疫苗对荷瘤鼠Th1细胞免疫功能的影响

为了探讨肌肉注射Ag85A DNA疫苗能否在肿瘤宿主,一个低细胞免疫应答的机体内激发Th1型细胞免疫应答,将6~8周龄BALB/c雌性小鼠随机分成实验组(Ag85A-V1Jns.tPA组),空质粒组(V1Jns.tPA组)和生理盐水组3组,将生长旺盛的Meth-A细胞接种于各组小鼠右侧背部皮下,每只小鼠2×105个细胞,1d后于小鼠大腿肌肉内分别注射100μL Ag85A-V1Jns.tPA(1 g/L),V1Jns.tPA(1 g/L)或生理盐水。每10 d 1次,共3次,于末次注射后第8 d,无菌取脾,分离细胞进行培养。检测NK细胞活性以及脾细胞培养上清中IFN-γ含量。结果显示:实验组平均NK细胞杀伤率以及脾细胞培养上清中IFN-γ含量较空质粒组和生理盐水组均显著增高,而空质粒组和生理盐水组之间未见有意义的变化。提示肌肉注射Ag85A DNA疫苗可以提高Meth-A纤维肉瘤荷瘤小鼠Th1细胞免疫功能。     

分枝杆菌Ag85A DNA疫苗对膀胱癌小鼠细胞免疫功能的影响

为探讨分枝杆菌Ag85A DNA疫苗能否提高荷膀胱癌小鼠保护性免疫应答水平,将1×10^6个MBT-2细胞注射于C3H/HeN小鼠的右侧背部皮内,待肿瘤长至直径约5～8 mm时,将动物随机分成实验组、空质粒组和空白对照组3组,分别于小鼠双侧股四头肌内注射Ag85A-V1 Jns.tPA质粒,V1 Jns.tPA质粒总量0.1 mL（100μg）,或生理盐水0.1 mL,每14 d 1次,共3次,末次免疫后第14天分别检测T细胞亚群数量、NK细胞活性、FasL mRNA表达情况、淋巴细胞增殖水平及肿瘤重量。结果显示,实验组较空白质粒组和空白对照组免疫指标均无明显增高（P〉0.05）,提示肌肉注射Ag85A DNA疫苗不能明显提高荷瘤小鼠免疫功能。     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B、Hsp16.3和ESAT6在血清学检测中 的初步应用

目的:探讨结核分枝杆菌分泌蛋白Hsp16.3、Ag85B以及融合蛋白ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6用于TB病人血清学检测的意义。方法:将已构建的含5种目的基因的表达载体(pProEXHTb-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B、pProEXHTb-ESAT6-CFP10、pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6),分别转入宿主菌E.coli DH5α中,诱导表达后分别获得Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6五种蛋白,采用Ni2+亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性。将经过复性的5种蛋白分别作为抗原,采用间接ELISA方法检测待测的血清样本,经OPD显色,测定各孔OD490值并判定结果。结果:五种蛋白被成功纯化并复性,通过ELISA方法共检测了22例TB病人血清、10例非结核病人血清和6例正常对照血清,Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6这5种抗原的灵敏度分别为36.4%、90.9%、77.3%、95.5%、100%,特异性分别为100%、75%、100%、93.8%、93.8%。统计分析显示,ESAT6-CFP10和Ag85B、Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6这三种蛋白ELISA检测的结果无差异,而与Hsp16.3和痰涂片检测结果有显著差异。结论:Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6可作为结核分枝杆菌ELISA检测的初选抗原。     

结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16．3、Ag85B-ESAT6和分泌蛋白Hspl6．3体外对人肝癌细胞HepG-2的作用

目的：探讨结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hspl6．3、Ag85B-ESAT6及分泌蛋白Hspl6-3对人肝癌细胞HepG-2的作用。方法：将已构建的含3种目的基因的表达载体pProEXHTa-Ag85B-Hspl6．3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6和pProEXHTb-Hspl6．3,分别转入宿主菌EcoliDH5α中,诱导表达后分别获得Ag85B-Hspl6．3、Ag85B-ESAT6和Hspl6．3三种蛋白,采用Ni^2＋亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性。复性的蛋白按照不同浓度和作用时间分别与肝癌细胞HepG-2反应,用MTT法检测细胞生长情况。结果：三种蛋白被成功纯化并复性。MTT数据统计分析显示,终浓度101xg／ml的三种蛋白对HepG-2细胞生长没有明显作用,当三种蛋白的终浓度分别为20、40、801μg／ml时均能够抑制HepG-2细胞的生长,并且抑制作用随着蛋白终浓度的增大以及作用时间的延长而增强。不同类别的蛋白抑制作用没有明显差别。结论：结核分枝杆菌的部分分泌蛋白能够抑制肝癌细胞HepG-2的生长。     

结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6 和分泌蛋白 Hsp16.3 体外对人肝癌细胞HepG-2 的作用*

目的:探讨结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6及分泌蛋白Hsp16.3对人肝癌细胞HepG-2的作用。方法:将已构建的含3种目的基因的表达载体pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6和pProEXHTb-Hsp16.3,分别转入宿主菌E.coliDH5α中,诱导表达后分别获得Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6和Hsp16.3三种蛋白,采用Ni2+亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性。复性的蛋白按照不同浓度和作用时间分别与肝癌细胞HepG-2反应,用MTT法检测细胞生长情况。结果:三种蛋白被成功纯化并复性。MTT数据统计分析显示,终浓度10μg/ml的三种蛋白对HepG-2细胞生长没有明显作用,当三种蛋白的终浓度分别为20、40、80μg/ml时均能够抑制HepG-2细胞的生长,并且抑制作用随着蛋白终浓度的增大以及作用时间的延长而增强。不同类别的蛋白抑制作用没有明显差别。结论:结核分枝杆菌的部分分泌蛋白能够抑制肝癌细胞HepG-2的生长。     

Differential immunogenicity and protective efficacy of DNA vaccines expressing proteins of Mycobacterium tuberculosis in a mouse model

BALB/c mice were vaccinated three times (2-week intervals) with plasmid DNA separately encoding antigen Ag85B, ESAT-6 or Ag85A from Mycobacterium tuberculosis. The protective efficacy of these DNA vaccines against intravenous M. tuberculosis H37Rv challenge infection was measured by counting bacterial loads in spleen and lung and recording changes in lung pathology. The splenocyte proliferative response to the corresponding antigens and antigen-specific interferon (IFN)-γ secreted by splenocytes of the vaccinated mice were also detected. We found a clear hierarchy of protective efficacies among the three DNA vaccines tested in this study. Plasmid DNA encoding Ag85A provided the strongest protection and showed the least change in lung pathology, followed by plasmid DNAs encoding Ag85B and ESAT-6. However, DNA-85B reduced comparative bacterial load in lung tissue, as did DNA-85A. Compared to the control group, protective efficacies conferred by different DNA vaccines were consistent with the lymphoproliferative responses to the corresponding antigens as well as the secretions of antigen-specific IFN-γ. Our study demonstrates that both Ag85A and Ag85B are the most promising of the candidate antigens tested for future TB vaccine development.