逆转录-聚合酶链反应快速检测柯萨奇B病毒

在柯萨奇B3病毒RNA5＇端非编码区选择并合成引物,用RT－PCR对我省苍山县23份无菌性脑炎患者的粪便标本进行检测,并与常规病毒分离、培养、鉴定进行了平行比较。两种检测结果基本一致。     

逆转录-聚合酶链反应快速检测柯萨奇B病毒

在柯萨奇B3病毒RNA5＇端非编码区选择并合成引物,用RT－PCR对我省苍山县23份无菌性脑炎患者的粪便标本进行检测,并与常规病毒分离、培养、鉴定进行了平行比较。两种检测结果基本一致。     

人B组轮状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

人B组轮状病毒曾在我国发生过散发和暴发流行,近年来在世界多个国家也均有报道。为建立一种灵敏和特异的人B组轮状病毒荧光定量RT-PCR检测方法,本研究针对人B组轮状病毒NSP3片段保守区设计和筛选特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并对该方法的灵敏性、特异性、稳定性进行评价。结果显示,该方法针对人B组轮状病毒检出限可以达到6.28拷贝/μL;与多种常见和罕见的人腹泻病毒没有交叉反应;批内和批间等重复性试验变异系数均小于5%。本研究建立的人B组轮状病毒荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、稳定性好、检出率高,可作为一种新的技术手段应用于人B组轮状病毒的快速筛查与诊断。     

B组轮状病毒的分子生物学研究进展

除Ａ组轮状病毒外，引起人类腹泻的还有Ｂ组和Ｃ组轮状病毒。本文就Ｂ组轮状病毒的基因结构、功能、所编码的蛋白及其与Ａ组轮状病毒蛋白的对应关系以及Ａ、Ｂ、Ｃ组间和组内不同株轮状病毒主要基因片段之间的遗传同源性关系作一概述。     

犬瘟热病毒反转录—聚合酶链反应诊断方法的建立和初步应用

根据Ｂａｒｒｅｔｔ报道的犬瘟热病毒Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株的融合蛋白基因序列,设计合成了一对能扩增３２４ｂｐ基因片段的引物。将异硫氰酸胍－酚－仿一步法提取得到的细胞总ＲＮＡ进行反转录,以此产物为模板进行ＰＣＲ扩增,并对ＰＣＲ扩增条件进行了优化。经鉴定,以此对引物进行的ＰＣＲ扩增,得到了与设计片段大小和酶切位点相同的产物,且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒犬的三种病原的核酸,这表明此方     

PCR制备地高辛素标记的探针检测轮状病毒核酸

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术,制备了轮状病毒第９基因部分片段的地高辛标记的ｃＤＮＡ探针。ＤＮＡ－ＲＮＡ斑点杂交表明该探针具有轮状病毒Ａ组的特异性,可检出１０ｐｇＨＲＶ－ＲＮＡ。实验中选择了粪便标本提取核酸后点膜和粪便上清直接点膜进行斑点杂交,两种方法的结果一致;同时将斑点杂交法与ＰＡＧＥ法的结果进行了比较。实验结果表明用ＰＣＲ技术直接制备地高辛索标记的ｃＤＮＡ探针具有方便、快速、标记率高、特异性强的特点,具有一定的应用前景。     

应用反转录—聚合酶链反应检测口蹄疫病毒

建立了一种适用于检测动物（猪、牛、羊）组织（肌肉、淋巴结、脊髓、扁桃体和蹄冠皮）和牛食道－咽部分泌物（Ｏ－Ｐ液）中的口蹄疫（ＦＭＤ）病毒核酸（ＲＮＡ）的反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术。引物对是人工合成的两条２０ｍｅｒ寡核苷酸片段,它们的序列相应于ＦＭＤ病毒结构蛋白ＶＰ１基因后２／３区段,在４个血清型之间基本一致（保守）。ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳检测。试验结果表明,ＲＴ－ＰＣＲ具有良好的     

应用单链构象多态性—聚合酶链反应研究我国大麦黄花叶病毒株系的分化

根据致病性差异,我国大麦黄花叶病毒（ＢａＹＭＶ）存在若干不同株系,血清学和核酸杂交技术不能区分这些株系。但还由于致病性不同,各株系的核酸序列同必定存在差异。最近建立的单链构象多态性－聚合酶链反应（ＳＳＣＰ－ＰＣＲ）技术能灵敏而有效地诊断和区分核酸序列间的差异,从而进一步证实我国ＢａＹＭＶ不同株系的分化。     

An Occurrence of Diarrheal Cases Associated with Group C Rotavirus in Adults

Six of the 23 college students who joined a group trip in February of 1991 developed acute nonbacterial gastroenteritis with severe diarrhea. The causal agent was identified as group C rotaviruses by electron microscopy (EM), immune-EM (IEM) and the molecular examinations including polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and polymerase chain reaction (PCR) on virus particles detected in the extract of watery fecal specimens of the patients. The patients positive for virus isolation showed significant increase in IEM antibody to the isolated virus in their paired sera. These findings suggest that the group C rotavirus is an important etiological agent of diarrhea and may also cause serious food-borne diarrheal disease in adults.     

Molecular Characterization of Human Rotavirus VP4 Genes by Polymerase Chain Reaction and Restriction Fragment Length Polymorphism Assay

A restriction fragment length polymorphism (RFLP) assay was developed to examine the genetic variability and similarity of the VP4 genes of human rotaviruses. The VP4 genes of 14 human rotavirus strains, including VP4 serotype P1A strains (Wa, P, VA70), serotype P1B strain (DS-1), serotype P2 strains (M37, 1076, McN, ST3) and serotype P3 strains (AU-1, AU228, K8, PA151, PCP5, MZ58), and those of 2 feline strains (FRV-1 and Cat2) were reverse-transcribed and amplified by the polymerase chain reaction (PCR). The amplified VP4 cDNAs were then digested with a panel of restriction endonucleases (HindIII, NruI, HaeIII, and EcoRI), resulting in the identification of at least one enzyme with which digestion produced an RFLP profile specific for a particular P serotype. Of interest was the presence of two distinct RFLP patterns within the serotype P3 VP4 genes: one corresponding to the VP4 gene carried by the members of the AU-1 genogroup and the other corresponding to the VP4 genes carried by naturally-occurring reassortants between members of the AU-1 and other genogroups.     

用逆转录套式PCR检测临床标本中的腮腺炎病毒RNA

流行性腮腺炎是儿童常见呼吸道传染病,并发症多为睾丸炎、无菌脑炎等。个别患者甚至因严重的脑炎并发症而死亡［１］。故有必要对患者进行早期病原诊断,以利于早期治疗。腮腺炎病毒ＲＮＡ中小疏水蛋白（ＳＨ）基因作为高变区在不同毒株的分子特性鉴别中比其它基因片段更...     

B组轮状病毒RT—PCR来源的cDNA探针核酸诊断方法的建立

近十年来,国内外学者相继报道在人以及牛、羊、猪、大鼠的腹泻粪样中检出Ｂ组轮状病毒〔１－３〕。洪涛等于１９８３年首次报道成人腹泻轮状病毒（ＡＤＲＶ）属于Ｂ组轮状病毒〔４〕。目前,轮状病毒Ｂ组已被公认为引起人及不同动物腹泻的流行病学的重要因素。由于Ｂ组轮...     

诺如病毒RT-PCR-反向斑点杂交检测方法的建立

旨在建立诺如病毒RT-PCR-反向斑点杂交检测方法。选取诺如病毒较为保守的RdRp基因作为扩增对象,经RT-PCR扩增后将目的片段克隆到pGEM-T载体中。以重组质粒为模版,选择合成寡核苷酸探针及生物素标记引物。生物素标记引物的扩增产物经热变性后与固定在硝酸纤维素膜上的探针进行杂交反应,经显色后判定结果。出现明显的蓝紫色斑点为诺如病毒阳性,如无斑点则为阴性。对5份临床样品进行检测,并以RT-PCR对比验证。结果显示,利用反向斑点杂交法对重组质粒的检测限为100拷贝/μL,在5例实际样品检测中有1例为阳性,与RT-PCR判定结果一致。建立了诺如病毒的RT-PCR-反向斑点杂交检测方法,该方法特异性好,灵敏度高,操作简便,具有重要的应用价值。     

丙型肝炎病毒RNA打点杂交检测方法同RT－PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针,建立了用打点杂交（ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法,同采用ＨＣＶ基因组５’端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法相比较,发现两种方法都能快速早期和特异地检出血清中ＨＣＶＲＮＡ,但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断,可采用这两种方法。这两种方法的敏感性在很大程度上依赖于引物和探针的敏感性,以及ＲＮＡ提取方法。ＲＴ－ＰＣＲ法适用于诊断病毒血症和复制,打点杂交法适用于研究ＨＣＶＲＮＡ量的变化,对治疗的评价,以及为实验筛选较高滴度的ＨＣＶＲＮＡ阳性样本。     

应用RT-PCR制备登革病毒诊断基因芯片探针

根据GenBank数据库中的生物信息,利用BLAST免费分析软件找出4种型别登革病毒的保守序列及各型特异性序列,针对上述序列设计引物经RT-PCR扩增登革病毒的特异片段,利用此RT-PCR法收集探针是一种快速、简便制备基因芯片探针的实用方法。     

用PCR检测细胞培养中支原体污染

细胞培养中支原体污染已经成为严重的问题.为了扩增6种支原体(精氨酸支原体,口腔支原体,人型支原体,猪鼻支原体,发酵支原体及莱氏支原体)核糖体RNA操纵子的16s和23s DNA间区,设计了三个通用PCR引物(F1,F2及R1).当以6种支原体DNA为模板时,引物F1和R1产生340到468bp的片段,引物F2和R1产生145到211bp的片段,当用Hela细胞或E.coli DNA作为模板,用引物F1和R1时,在电泳中未观察到特定区带.此法最小能检出8.5fg精氨酸支原体DNA,相当于13个精氨酸支原体.这说明,当这些支原体污染细胞培养时,能用PCR法检测出来.     

Heterogeneity of HLA-G Genes Identified by Polymerase Chain Reaction/Single Strand Conformational Polymorphism (PCR/SSCP)

A genomic HLA-G clone named 7.0E was isolated from a Japanese placenta. The deduced amino acid sequence of the 7.0E was identical to two HLA-G genomic clones and two cDNA clones previously described. The DNA sequences of α1 and α2 domains of the HLA-G gene from 5 cell lines also encoded the same amino acids. However, a 14 bp insertion, ATTTGTTCATGCCT, was present in the 3′ untranslated region of 7.0E compared with the originally described HLA-G clone (HLA 6.0). Polymerase chain reaction (PCR)/single strand conformational polymorphism (SSCP) analysis of exon 8 allowed the HLA-G gene to be classified into two alternative types, G6.0 and 7.0 E, those correlated to the absence or the presence of the 14 bp stretch. Each group had minor sequence variant(s), and the alleles of the 7.0E-type were more heterogeneous than those of the G6.0- type. The 14 bp deletion is present only in the G6.0-type of HLA-G alleles among HLA class I genes. Thus it was suggested that G6.0 alleles were generated after diversification of the HLA-G.