生物发光法微生物快速检测试剂的性质及其影响因素研究*

研究了ATP生物发光微生物快速检测试剂的反应动力学、反应最适温度、pH以及各种影响因素。在ATP生物发光反应中,测试系统中D-荧光素用量为40～50μg／mL时对反应已经足够;发光脉冲计数CPM值随反应时间的延长不断降低,开始的1min内,其CPM值下降最快,然后下降速度不断减缓;反应的最适温度为24℃-25℃;而体系的最佳pH为7．2—7．4。配制好的发光试剂溶液置于4℃保存45h,可以保持86％的活力,在25℃时保温1h,活力下降较少,随时间的增加,活力逐渐下降,到6．5h时,仅剩53．5％的活力,而     

基于ATP生物发光法的微生物数量快速检测技术的研究进展

微生物数量的快速检测一直是工业生产与食品行业需要解决的问题,腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)生物发光法具有操作简便、检测周期短等优点,可满足一般微生物检测的需求。然而,ATP生物发光法的准确性也受到不同因素的影响,如微生物的ATP检测限值较高、微生物自身及其他因素(如非微生物ATP、提取剂种类、荧光素酶活性等)均对微生物数量的检测产生影响。本文简述了不同微生物数量检测方法的优缺点,介绍了ATP生物发光法的发展历程及原理,综述了非微生物ATP与游离ATP、微生物量、ATP提取剂、荧光素酶等因素对ATP生物发光法灵敏度与稳定性的影响,归纳总结了ATP生物发光法及检测设备在食品、医疗、污水处理等领域的应用现状,并就ATP生物发光法体系的优化及ATP在线检测的应用等方面进行了展望,以期为ATP生物发光法的高效应用提供新的思路。     

利用ATP扩增反应与生物发光法结合检测微量微生物

摘要:【目的】腺苷酸激酶（adenylate kinase, ADK）和多聚磷酸盐激酶（polyphosphate kinase, PPK）偶联催化的ATP扩增反应结合生物发光检测法能够对微量微生物进行检测。但是PPK当中结合的内源性的ADP会产生背景干扰,影响测定。本文旨在融合表达ADK和PPK,并建立一种方便有效的内源性ADP的去除方法,降低背景,使之与传统生物发光法结合,实现高灵敏生物发光法检测微量ATP及微生物。【方法】PCR扩增得到PPK、ADK基因,插入表达载体pET28a (+)中构建重组表达质粒pET28a (+)-PPKADK,表达PPK-ADK融合蛋白。利用表面包裹聚胺醇（Polyurethane）的磁珠（magnetic beads）,通过化学反应将腺苷酸双磷酸酶（apyrase）固定于磁珠表面,制备固相腺苷酸双磷酸酶（Beads-apyrase）,用于除去与融合蛋白结合的内源性ADP,降低ATP扩增反应的背景,从而使之与生物发光反应相结合,测定微量外源ATP及细菌菌落数。【结果】表达的融合蛋白具有PPK和ADK的活性,利用Beads-apyrase可以方便而有效的去除内源性ADP,显著地降低反应背景,从而实现了利用ATP扩增反应与传统生物发光反应结合,测定了小于1 fmol的外源微量ATP,使生物发光法检测ATP及微生物的灵敏度提高至少100倍。【结论】利用Beads-apyrase能够方便、有效地降低PPK-ADK中的ADP背景,从而使PPK-ADK催化的ATP扩增反应能够与传统生物发光法相结合,极大地提高了生物发光法的灵敏度。     

微生物检测用培养基、试剂质量控制方法研究

全面分析微生物检测用培养基、试剂质量控制方法,从培养基的购置、验收、储存、使用等方面进行分类研究,明确培养基的质量控制方法途径,对微生物实验室培养基质量控制工作提供系统指导,提高微生物检测结果的准确性.     

微生物高通量快速检测技术研究进展

微生物在大自然中广泛存在,特别是食源性致病菌是引发食源性疾病的主要因素,传统的检测技术已难以适应疾病预防控制和基层监管执法的需求,因此更加快速灵敏的高通量检测技术成为研究的热点.在对微生物快速准确识别方面,主要包括双功能抗体、核酸适配体筛选和噬菌体鉴定等方法.在多目标检测方面,主要包括多重PCR、基质辅助激光解吸电离飞...     

食品微生物快速检测技术研究进展

本研究概述了食品微生物引起的食源性疾病及对人类的危害;介绍了国内外9种食源性微生物快速检测技术的研究现状,指出电喷雾离子化多级质谱对氨基糖苷类抗生素的检测分析技术、分析即用型纸片技术、免疫分析检测技术、分子生物检测技术、阻抗技术以及其他新物理、生化技术检测方法,传统的检测的灵敏度和专一性有一定提高,但操作繁琐;现在发展的分子生物学方法为食品中快速、灵敏的病毒检测带来了更多的希望,各种快速检测方法还只是实践中的一个参考.其今后的发展方向主要是:克服现有分子生物学方法的缺点,绘制各种菌落图谱,开发在线检测软件,能定量测定微生物细胞特征和性能,简化采集、培养等程序,提高检测效率.     

病原微生物快速检测方法及研究进展

近年来,随着现代生物技术的快速发展,人类基因组计划的完成,尤其是生物化学、分子生物学、免疫学、生物仪器及计算机理论与技术的进步,新的诊断技术和方法不断涌现并被广泛应用于微生物检测,使得疾病诊断的水平有了很大的提高。根据目前国内外研究的动向,本文对一些常规及新型检测技术的原理、特点及应用做一综述。     

微生物快速检测技术在食品安全检测中的应用

在食品安全领域,微生物检测是确保食品质量和消费者健康的关键环节。随着食品工业的快速发展和消费者对食品安全要求的提高,传统的微生物检测方法已难以满足现代食品安全检测的要求。因此,快速检测技术成为了食品微生物检测领域的重要发展趋势。微生物快速检测技术因操作简便、检测速度快、灵敏度高和准确性好等特点在食品安全检测中表现出了巨大的应用潜力。文章对微生物快速检测技术在食品安全检测中的应用展开探讨,以期为相关人员提供参考。     

微生物絮凝剂水处理的影响因素及其工艺研究进展

本文对近年来微生物絮凝剂的发展进行了概述,在介绍微生物絮凝剂化学性质的基础上,讨论了与絮凝活性相关的絮凝剂投加量、投加顺序,待处理水体性质和水力条件等因素。重点论述了单一微生物絮凝剂水处理工艺、微生物絮凝剂和助凝剂复配水处理工艺、复合微生物絮凝剂水处理工艺和物理、化学方法和微生物絮凝剂联合水处理工艺。讨论发现结合现有研究成果,开发新的微生物絮凝剂水处理工艺具有重要的工业应用价值。     

悬浮培养法生产血型单抗的影响因素研究

目的：建立单克隆抗体血型定型试剂悬浮生产法最佳生产方案。方法：通过研究影响细胞生长及抗体产量的主要因素,找出合理的生产方法。结果：理论上用该方法每月可生产抗体１００万ｍｌ,比原贴壁培养法的产量提高数十倍。结论：建立一种简便、实用的血型定型试剂工业化大生产方法。     

微生物细胞ATP释放条件研究

在ATP生物发光法微生物细胞ATP释放剂的筛选研究中,发现采用环糊精等环状化合物可以解除表面活性剂类细胞ATP释放剂对发光反应系统的抑制作用,其中,7．5g／L环糊精CD（a）能中和1．5g／L的表面活性剂Ec和Es、Et,可以完全排除Ec、Es、Et对发光反应的抑制作用。通过比较各种细胞ATP释放剂释放ATP效果,筛选、组合出以表面活性剂Ec为代表的微生物细胞ATP释放剂;通过优化实验,发现用0．25～0．50g／L的Ec处理菌液1～2min时,细胞ATP的释放效果最好,从而建立了室温条件下简便、快速的微生物细胞ATP释放方法和ATP释放剂对发光反应系统抑制的消除方法。     

柑橘黄龙病病原快速检测技术研究进展

柑橘黄龙病是一种毁灭性的病害,一旦感染若不能及时发现,就会迅速传播蔓延,殃及整个果园。在尚无有效药剂根治的情况下及时的发现,并铲除病原是十分重要的防止措施。因此,研究开发出精确、快速、方便、易操作的检测方法显得尤为重要。本文针对柑橘黄龙病在田间诊断、血清学检测、分子诊断、光谱检测等方面的快速检测技术进行了综述,并对各种检测技术进行比较分析,以期为未来柑橘黄龙病快速检测技术研究提供参考依据。     

基于毛细管电泳的快速检测七种人冠状病毒技术方法的建立

近来,一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的COVID-19突发疫情,给全球公众健康和社会经济构成严重威胁。SARS-CoV-2成为继人冠状病毒229E(Human coronavirus 229E,HCoV-229E)、人冠状病毒OC43(Human coronavirus OC43,HCoV-OC43)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、人冠状病毒NL63(Human coronavirus NL63,HCoV-NL63)、人冠状病毒HKU1(Human coronavirus HKU1,HCoV-HKU1)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)后第七种感染人类的冠状病毒。本研究以高分辨毛细管电泳技术为基础,针对七种人冠状病毒基因保守区分别设计特异性引物对,经常规PCR扩增后,通过具备单碱基差异分辨率的毛细管电泳分析,实现快速检测七种人冠状病毒的目标。通过构建基于毛细管电泳的人冠状病毒分子靶标,实现同时快速精准鉴定七种人冠状病毒的目的。本研究建立的人冠状病毒毛细管电泳快速检测技术方法具有极高灵敏性和精确性,分辨率高而且特异性好,操作简便成本低廉,为人冠状病毒的临床诊断、口岸快速检测等提供了新的技术支持。     

一种适于转基因水稻PCR检测的微量DNA快速提取法

对已报道的小麦基因组DNA快速提取方法的部分步骤进行了简化,在水稻上进行了尝试。结果表明,简化法提取的水稻基因组DNA完整性好,PCR扩增效果与试剂盒提取法无明显的差异,结果稳定可靠;而且整个提取过程操作简单、花费时间少,样品用量少,仅需5-10mg,适用于大规模转基因水稻的PCR检测。     

显色培养基在几种食源性致病菌快速检测中的应用

用显色培养基鉴定微生物是一种新的微生物快速检测技术,该技术以生化反应为基础,通过在培养基中加入细菌特异性酶的显色底物直接根据菌落颜色对菌种作出鉴定。常见食源性致病菌检测中,李斯特菌显色培养基（BCM^TM Listeria mormcytogenes,Rapid’LMONO agar．CHROMagar^TM Listeria）、大肠杆菌显色培养基（CHROMagar^TM Ecoli）、沙门氏菌显色培养基（Rambach agar）、金黄色葡萄球菌显色培养基（CHROMagar Staphylococcus aureus）等已被广泛应用于食品、医药和环境监测等领域,极大提高了微生物检测的效率。但是,显色培养基也存在一些假阳（阴）性等问题,其设计尚待优化。     

改良逆转录环介导等温扩增检测技术快速实时检测H9亚型禽流感病毒

利用改良逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术建立一种快速、灵敏的检测方法用于H9亚型禽流感病毒检测。根据H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区序列中的8个区段设计6条特异性引物,在恒温条件下进行核酸扩增反应,并以琼脂糖凝胶电泳和目视检查绿色荧光两种方法对扩增结果进行判定。结果表明,RT-LAMP的最小检测限为100 fg,灵敏度比PT-PCR高100倍,且与H5亚型、H7亚型禽流感病毒,新城疫病毒(NDV)无交叉反应。目视检查绿色荧光与常规琼脂糖凝胶电泳的判定结果一致。整个扩增检测过程在35 min内即可完成。利用临床样本对RT-LAMP法进行验证,结果与RT-PCR一致。由实时浊度分析得到的标准曲线,计算出临床样本中的病毒质粒拷贝数均在2×107-2×104之间。因此,本研究建立的RT-LAMP方法快速、灵敏、特异性强,是H9亚型禽流感病毒的一种高效检测方法。     

Detection of genotoxicity of metallic compounds by the bacterial bioluminescence test

Twenty metallic compounds were assayed for their genotoxic mutagenic activity by the bioluminescence test restoration of the luminescence of dark mutant of the luminous bacterium Photobacterium fischeri). The activity of the metals was tested in a liquid medium as well as on a solid medium. K₂Cr₂O₇, MnCl₂, BeCl₂, KH₂AsO₄, ZnCl₂ and Na₂WO₄ showed strong activity in liquid medium while AgNO₃, Cd(OOCCH₃)₂, CoCl₂, CuCl₂, HgCl₂, Na₂SeO₃ and Pb(NO₃)₂ were more active in the solid medium test. BaCl₂, Na₂MoO₄, NaAsO₂, NiSO₄, Na₂SeO₄, RbCl, and SnCl₂ were not active in the bioluminescence test. The correlation between the genotoxic activity of the tested metallic compounds in the bioluminescence test and other bacterial tests for genotoxic agents as well as the correlation between these results and the carcinogenicity of these compounds is discussed.     

DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用

微生物是污水净化的主要作用者之一.采用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophresis,DGGE)方法培育和鉴定土壤微生物具有可靠性强、重复性好、方便快捷等优点,已被广泛应用于环境科学和污染防治研究领域.综述了基于PCR-DGGE技术的基本原理、关键环节及其在微生物多样性研究中的应用,同时就其自身存在的不足进行了评价并提出了解决方案.     

Deamination of Aliphatic Amines by Monoamine Oxidase A and B Studied Using a Bioluminescence Technique

Deamination of n-octylamine and n-decylamine has been studied in various tissues using a new bioluminescence technique. Selectivity of n-octylamine and n-decylamine as substrates for monoamine oxidase (MAO) A or B has been determined using both clorgyline and (-)-deprenyl inhibition curves and kinetic parameters. Homogenates of rat brain, liver and heart containing predominantly MAO-A or -B were prepared by preincubation for 60 min with (-)-deprenyl or clorgyline (30 nM), respectively. Human placenta (MAO-A) and platelet (MAO-B) were used as reference tissues containing only one MAO form. In tissues (rat liver, brain) containing both MAO forms in equal proportion, inhibition curve studies showed a preference of both substrates for the B form of the enzyme; however, where MAO-A was the major form (rat heart, human placenta), clorgyline was the more effective inhibitor. In the beef brain cortex n-octylamine showed marked preference for MAO-B, whereas n-decylamine was selective toward-MAO-A. Kinetic studies in general supported the picture of greater selectivity of the aliphatic amine substrates for deamination by MAO-B, as reflected by lower Km values for this enzyme type. However, n-octylamine was more selective for MAO-B than n-decylamine in both kinetic and inhibition curve studies. The deamination of these aliphatic amine substrates cannot be explained only by reference to the binary classification of MAO into types A and B.