重组人干扰素α2b的提取和纯化

为了提高重组人干扰素α2b的质量 ,增加产量 ,降低成本 ,通过破菌 ,包涵体提取 ,离子交换层析 ,凝胶过滤等纯化方法制备干扰素纯品。结果表明干扰素纯度可达 95%以上 ,比活达到 1.2× 10 8IU/mg以上。结果提示 ,采用本方法收率高 ,纯度好 ,工艺稳定 ,适合大规模生产     

重组人干扰素α2b栓剂稳定性研究

将重组人干扰素α2b栓剂在不同温度下保存不同时间,检验干扰素生物活性、溶出度试验、融变时限、pH值和微生物限度及外观的稳定性。重组人干扰素α2b栓剂在4~8℃条件下放置48个月;在20~25℃条件下放置24个月IFN生物活性未见下降,37℃放置4个月IFN生物活性未见下降。重组人干扰素α2b栓剂的生物学活性及理化性质有较好的稳定性。     

重组人干扰素α2b栓剂稳定性研究

研究重组人干扰素α2b栓剂的稳定性。方法将重组人干扰素α2b栓在不同温度下保存不同时间,分别检验干扰素生物学活性、溶出度试验、融变时限、pH和微生物限度及外观的稳定性。结果重组人干扰素α2b栓在4~8℃条件下放置当时和放置48个月后的IFN生物学活性基本一致,未见下降;在20~25℃条件下放置24个月后IFN生物学活性未见下降,放置32个月后活性下降32%,36个月后IFN生物学活性下降55%;37℃条件下放置4个月后IFN生物学活性未见下降。结论重组人干扰素α2b栓剂的生物学活性及理化性质的稳定性好。     

人干扰素α-2b生产工艺的研究

人干扰素α-2b的简易、高效生产工艺研究,包括高效率、小型化的发酵技术．不用单克隆抗体亲和层析的纯化工序．以及大肠杆菌表达的人干扰索α-2b包涵体蛋白的天然构型复性等问题．从10L基因工程大肠杆菌发酵液所得l000g菌体中得人干扰素α-2b约500mg,效价为l×10³u／mg,设备投资少,生产成本低,产品表现了高纯度、高效价。适宜大量生产,为广大人民群众提供廉价高质量药品创造了条件。     

疏水相互作用层析分离重组人干扰素α2b

目的采用疏水相互作用层析分离重组人干扰素α2b,去除干扰素样品中的二聚体,得到高纯度的干扰素用于进一步的研究。方法首先采用阳离子交换层析纯化复性重组人干扰素α2b,去除了大部分的杂蛋白,然后采用疏水相互作用层析纯化重组人干扰素α2b,去除复性过程中产生的错误折叠体和二聚体,并考察盐浓度、pH值、流速和洗脱液中尿素对疏水相互作用层析纯化效果的影响。结果硫酸铵初始浓度1.2 mol/L、缓冲液pH值6.0、流速2.5 mL/min、洗脱液中添加尿素浓度为2 mol/L时疏水相互作用层析纯化效果最佳。最终得到的重组人干扰素α2b非还原型SDS-PAGE电泳均呈单一条带。结论确定了疏水层析纯化重组人干扰素α2b的最优条件,成功提取到具有高活性、高纯度的重组人干扰素α2b纯品。     

人干扰素α—2b生产工艺的研究

人干扰素α-2b的简易、高效生产工艺研究,包括高效率、小型化的发酵技术,不用单克隆抗体亲和层析的纯化工序,以及大肠杆菌表达的人干扰素α-2b包涵体蛋白的天然构型复性等问题,从10L基因工程大肠杆菌发酵液所得1000g菌体中得人干扰素α-2b约500mg,效价为1×10~8u/mg,设备投资少,生产成本低,产品表现了高纯度、高效价。适宜大量生产,为广大人民群众提供廉价高质量药品创造了条件。     

重组人干扰素α-2b滴鼻剂的研制

重组人干扰素α-2b(rIFNα-2b)滴鼻剂的试制及临床前工作研究.进行了理化和生物学性质试验、稳定性试验、鼻腔局部刺激性试验、急性毒性试验、长期毒性试验和动物体内抗病毒试验等.本品连续三批工艺稳定,检定合格,性质稳定,2～8℃保存24个月后生物学活性无明显下降,使用安全,无不良反应.其它各项试验均符合现行<中国药典>的要求.表明该制剂具有比较好的开发与应用前景.     

重组人干扰素α2b阴道泡腾片的研制

目的:制备重组人干扰素α2b阴道泡腾片,并对其质量和局部用药安全性进行研究。方法:将重组人干扰素α2b经制粒干燥,用酸、碱分开制粒法制备重组人干扰素α2b阴道泡腾片,按照《中国药典》对其性状、重量差异、崩解时限、pH、干扰素效价、水份含量、稳定性以及局部刺激性进行了考察。结果:本品处方、工艺合理,制备过程对干扰素生物活性影响较小;制剂质量符合规定,在4℃低温条件下保存具有较好的稳定性;局部刺激试验对家兔阴道组织无明显的刺激性。结论:该制剂质量稳定、可控,具有良好的稳定性和安全性。     

注射用重组人干扰素α2b冻干制剂稳定性试验

本文通过对三批注射用重组人干扰素α２ｂ（ｒＩＦＮ－α２ｂ）冻干制剂在不同温度下,保存不同时间取样,对其外观、生物学活性、ｐＨ值、溶解状态及无菌试验等各项理化指标的观察试验,结果本品的冻干制剂在－２０℃和４－８℃的条件下保存４２个月,其上述各项检定指标无明显变化,均符合质检规程,即本文制品在此条件下稳定性良好,有效期可定为三年。同时说明该产品的生产工艺稳定。     

聚乙二醇化重组人干扰素α-2b体外抗乙肝病毒作用的研究

研究聚乙二醇化重组人干扰素α-2b（PEG-IFN）和重组人干扰素α-2b（IFN）的体外抗乙型肝炎病毒作用。以HepG2.2.15为细胞模型,采用MTT法考察两种药物对细胞的毒性作用;分别以高、中、低剂量的PEG-IFN和IFN每隔一日反复作用细胞,连续8d,采用ELISA法测定细胞上清液中的HBsAg来考察两种药物对病毒的抑制作用;将相同剂量的PEG-IFN和IFN模拟临床给药频率作用细胞一周,即PEG-IFN给药1次,IFN给药3次,观察细胞HBsAg的分泌情况,评价药效。PEG-IFN和IFN的TC50均〉20000IU/mL,IC50分别为559.88、478.71IU/mL;反复给药时,高、中、低3个剂量组的PEG-IFN对病毒的抑制作用略低于同剂量的IFN;模拟临床给药一周后发现,PEG-IFN与IFN对病毒的抑制作用无明显差异。PEG-IFN和IFN在体外均可抑制HepG2.2.15细胞乙肝病毒的表达。     

基因工程人干扰素α2b和α2a亚型抗病毒效应的实验研究

本文采用鸡胚接种法和微量细胞病变抑制法研究了不同亚型α干扰素（α２ａＩＦＮ和α２ｂＩＦＮ）抗流感病毒、脊髓灰质炎病毒以及麻疹病毒的作用。结果表明：两种亚型α干扰素均显示明显的抗病毒效应,其中（１）α２ｂＩＦＮ抗流感病毒作用略强于α２ａＩＦＮ,（２）两亚型α干扰素抗脊髓灰质炎和麻疹病毒作用相似。     

重组人α2b型干扰素的纯化与鉴定

采用单克隆抗体亲和层析一步纯化法对大肠杆菌表达的重组人a2b型干扰素(IFN－α2b)进行了纯化,然后利用凝胶过滤高压液相层析、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳和N端25个氨基酸的序列测定等方法对纯化产品进行了鉴定,表明一步纯化的IFN—α2b达到95%以上的纯度,其比活性为2．54×10⁸U／mg但重组IFN—α2b产品N端不均一,含有约30％的去Met分子和约70％的带Met分子。从蛋白质序列的水平上证实,本实验室用定位诱变法构建的IFN—α2b基因在大肠杆菌系统中得到了正确的表达。     

人干扰素IFNα-2b在果蝇细胞中的稳定表达

以人干扰素IFNα-2b全长基因的质粒为模板,PCR扩增,PCR产物克隆到表达载体获得重组质粒,经转染和筛选,得到稳定表达的果蝇S2细胞株.经CuSO4诱导表达并对表达产物进行检测,结果显示,在果蝇S2细胞中成功地进行了人干扰素IFNα-2b的蛋白表达,表达产物的大小约为26kD.并且,通过体外的抗病毒活性测定,证明所表达蛋白具有抗病毒活性.该研究为进一步利用该系统表达真核细胞蛋白,研究其结构和功能提供了重要的基础.     

聚乙二醇修饰重组人干扰素α-2b的碘染色法

目的：建立检测聚乙二醇位点特异性修饰重组人干扰素α-2b反应的方法。方法：采用分子量20000的甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺修饰重组人干扰素α-2b,反应混合物样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后,碘染色法判断反应产物组成。结果：该修饰反应产物除含有单PEG化的干扰素α-2b外,还有不同修饰程度的多PEG化干扰素。结论：本方法方便快捷、分辨率高、特异性强,同时可用于其它聚乙二醇修饰蛋白质的分析研究。     

人干扰素α-2b基因在德氏乳杆菌的表达与鉴定

目的:试图用乳酸杆菌在局部分泌干扰素,以达到预防和治疗病毒感染.方法:以pBLUE/IFN α-2b为模板,采用PCR技术将IFNα-2b基因扩增然后插入乳酸菌表达载体pSClllAE,将重组质粒电转德氏乳杆菌DM8909,获得重组菌株.在含乳糖的MRS培养基培养并诱导表达,表达产物分泌到菌液上清.结果:分别用PCR和ELISA鉴定目的基因和表达产物,利用WISH-VSV系统采用细胞病变抑制法,测定表达产物IFN α-2b的抗病毒活性,平均效价为1.41×105IU/ml.结论:本研究为以乳酸杆菌为载体在局部产生治疗性药物奠定了基础.     

重组人干扰素α-2b在大肠杆菌中分泌表达

人干扰素α-2b原始基因在重组原核工程菌中表达量偏低,所以我们在不改变干扰素原有氨基酸组成的前提下,根据大肠杆菌密码子偏爱性使用定向突变技术对huIFNα-2b基因进行点突变。将大肠杆菌STⅡ信号肽基因与突变后huIFNα-2b基因融合并于信号肽5′端和huIFNα-2b基因3′端引入合适的酶切位点。融合基因克隆至载体pCSE,pET-22b和pPAK4L中,此3种载体分别含有组成型启动子、T7启动子和phoA启动子。融合基因在载体pCSE中表达量很低,其中约有50%的目标蛋白能够成功实现分泌。在E.coliBL21中,pET-22b经过IPTG诱导可以实现huIFNα-2b的高表达,但STⅡ信号肽不能被有效切除。含有phoA启动子的载体pPAK4L其在E.coliW3110中可以实现huIFNα-2b较高水平的分泌表达,经过低磷诱导其表达量最高可至20μg/mL(A550)菌液,约有30%的目标蛋白质信号肽能够被成功切除并分泌到胞间质中。     

干扰素α-2b的聚乙二醇修饰

采用分子量为20 kD的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)修饰重组人干扰素α-2b(IFN α-2b),建立了修饰反应及分离纯化工艺.考察了修饰反应各因素对单修饰转化率以及单修饰产物体外活性的影响,获得了优化的修饰反应条件,即在pH 6.5,20 mmol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中,干扰素α-2b的浓度为4 mg/mE,PEG与IFN α-2b的摩尔比为8:1,4℃时反应20 h;在优化的反应条件下,单修饰PEG-IFN α-2b的转化率达到55%.并且,采用离子交换层析对修饰产物进行分离纯化,单修饰产品纯度达到97%,体外活性保留达到未修饰干扰素α-2b的13.4%,其在SD大鼠体内的循环半袁期得到了较大的延长,且具有较好的水溶液稳定性.     

重组人干扰素α-2b注射液雾化吸入与重组人干扰素α-2b喷雾剂局部外用喷咽部治疗手足口病的疗效

目的:探讨重组人干扰素α-2b注射液雾化吸入与重组人干扰素α-2b喷雾剂局部外用喷咽部治疗手足口病的疗效。方法:选择2016年1月至2017年12月就诊于河北省儿童医院的160例手足口病患儿作为研究对象,通过随机数表法分为对照组和试验组,每组80例。2组均给予手足口病常规治疗措施,对照组在此常规治疗基础上给予重组人干扰素α-2b喷雾剂治疗,喷涂于咽喉部,每次1喷,3次/d,试验组在常规治疗基础上,给予重组人干扰素α-2b注射液10万U(kg·次)加入生理盐水2 m L中进行雾化吸入治疗,2次/d;2组疗程均为3～5d。比较2组临床疗效、临床症状改善时间、血清指标及不良反应。结果:治疗后,试验组和对照组临床疗效总有效率分别为91.25%(73/80)和76.25%(61/80),差异具有统计学意义(P0.05);试验组和对照组体温正常时间分别为(2.78±0.42)和(4.13±0.58)d,皮疹消退时间分别为(3.53±0.55)和(5.05±0.63)d,口腔溃疡愈合时间分别为(3.35±0.58)和(4.80±0.58)d,正常进食时间分别为(3.91±0.58)和(4.98±0.50)d,住院时间分别为(5.91±0.92)和(8.14±0.81)d,差异均具有统计学意义(P0.05);治疗后,试验组和对照组血清淀粉样蛋白A(SAA)分别为(133.43±25.74)和(178.53±26.96)mg·L~(-1),C反应蛋白(CRP)分别为(4.75±0.71)和(8.54±1.29)mg·L~(-1),差异均具有统计学意义(P0.05);治疗期间,对照组出现恶心呕吐5例,皮疹1例,试验组出现7例恶心呕吐,2例腹泻,2组不良反应总发生率分别为7.50(6/80)、11.25%(9/80),比较无显著差异(P0.05)。结论:在手足口病患儿中使用重组人干扰素α-2b注射液雾化吸入效果显著,可有效促进疾病缓解,且用药安全性高,值得应用推广。     

α-2b干扰素重组质粒的建立及在毕赤酵母中的表达

目的:采用基因工程手段构建基因工程菌表达α-2b干扰素。方法:根据毕赤酵母密码子嗜好性原理设计并合成α-2b干扰素基因序列,将其插入到毕赤酵母Pichia pastoris的分泌型表达质粒pPIC9K中,得到重组分泌表达质粒pPIC9K-IFNα-2b,并用电转化法转化P.pastoris GS115。筛选出整合型His Muts菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子,经5d诱导表达后SDS-PAGE检测。结果:菌落PCR和序列测定结果显示重组表达质粒已成功构建,SDS-PAGE结果显示目的蛋白已成功表达。结论:在毕赤酵母中成功表达α-2b干扰素。     

重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白的稳定性研究

研究重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白(rHSA-IFNα-2b)的稳定性.以抗病毒活性和纯度为主要检测指标,考察rHSA-IFNα-2b的热稳定性,酸碱稳定性以及冻融耐受性.rHSA-IFNα-2b在37℃、55℃下放置5h后生物学活性无明显降低,60℃水浴lh即可见活性降低了约40%;pH值(分别为2、3、9)改变时,生物学活性未发生明显变化;rHSA-IFNα-2b反复冻融后聚合体逐渐增加,冻融4次后聚合体含量达到17.91%,但生物学活性无明显降低.重组人白蛋白干扰素α-2b融合蛋白对热、酸碱变化稳定,但不宜冻融.