利用恒溶氧．补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组人骨形成蛋白-2A

对表达人骨形成蛋白－2A(BMP－2A)的重组大肠杆菌YK537／pDH－B2m在500ml摇瓶中进行了培养条件的摸索实验,继后用5L自控发酵罐进行分批培养和分批补料培养,以获取rhBMP－2A两种培养方式结果比较表明,在培养过程中保持30％～40％左右的溶解氧和限制性流加葡萄糖可以使BMP-2A的含量达到2．78g／L,最终菌体密度为OD₆₀₀53(相当于干菌21．2g／L),重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的25％。该培养技术的关键是：(1)在培养过程中保持适当的溶解氧;(2)限制性流加葡萄糖;(3)42℃起始诱导的时间控制在对数生长中期,持续表达时间为4h;(4)细菌持续生长的比生长速率控制在0．3h -1左右。     

溶氧反馈分批补料高密度培养人骨形成蛋白-2工程菌

对表达人骨形成蛋白2成熟肽的基因工程大肠杆菌E.coli DH5α/pDH-B²m在500mL摇瓶中进行了培养条件的摸索实验,并在此基础上扩大至NBS Bioflo IV 20L发酵罐,利用溶氧反馈-分批补料培养技术：在培养过程中保持适当的溶解氧（40%）,以溶氧值在线反馈控制搅拌速度及流加补料培养基,使细菌保持适当的比生长率,成功地进行了工程菌的高密度培养,最终菌体密度达OD₆₀₀=57,每升干菌量22.8 g,目的蛋白的表达量占细菌总蛋白的30%,人骨形成蛋白2成熟肽的理论产率达到3.59 g/L。      

利用恒溶氧—补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组人骨形成蛋？…

对表达人骨形成蛋白－２Ａ的重组大肠杆菌ＹＫ５３７／ｐＤＨ－Ｂ２ｍ在５００ｍｌ摇瓶中进行了培养条件的摸索实验,继后用５Ｌ自控发酵罐进行分批培养和分批补料培养,以获取ｒｈＢＭＰ－２Ａ。两种培养方式结果结果比较表明,在培养过程中保持３０％－４０％左右的溶２解氧和限制性流加葡萄糖可以使ＢＭＰ－２Ａ的含量达到２．７８ｇ／Ｌ,最终菌体密度为ＯＤ６００５３,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的２５％。     

溶氧反馈分批补料高密度培养人骨形成蛋白-2工程菌

对表达人骨形成蛋白－2成熟肽的基因工程大肠杆菌E.coli DH5α/pDH-B2m在500mL摇瓶中进行了培养条件的摸索实验,并在此基础上扩大至NBS Bioflo IV20L发酵罐,利用溶氧反馈－分批补料培养技术：在培养过程中保持适当的溶解氧（40％）,以溶氧值在线反馈控制搅拌速度及流加补料培养基,使细菌保持适当的比生长率,成功地进行了工程菌的高密度培养,最终菌体密度达OD600＝57,每升干菌量22.8g,目的蛋白的表达量占细菌总蛋白的30％,人骨形成蛋白－2成熟肽的理论产率达到3.59g/L。     

重组大肠杆菌的分批补料培养方法

在重组大肠杆菌的培养过程中,存在着菌体的高浓度与外源蛋白的高表达这一矛盾,使得重组菌的比生长速率通常远远低于宿主菌,限制了基因工程菌由实验室规模向工业化规模的转变。要实现重组大肠杆菌的高密度培养,最常用和最有效的方法就是分批补料流加培养。     

重组大肠杆菌高密度培养研究进展

重组大肠杆菌细胞高密度培养(High cell-density cultivation,HCDC)是获得高外源蛋白产率的一种重要策略,影响重组大肠杆菌高密度培养的因素主要有以下几个方面:重组体的构建及其稳定性,培养基成分,培养方式,培养条件及培养过程中抑制性代谢产物的积累等。从以上几个方面对近期的研究进展进行了综述。     

高密度培养大肠杆菌YK537／pSBHL—11生产重组人细胞白介素—3

在Ｂ．Ｂｒａｕ ＥＳ－１０型１５Ｌ和ＮＢＳ ＤｉｏＦｌｏ３０００型５Ｌ发酵罐中,利用补料分批培养技术高工表达培养含重组质粒ｐＳＢＨＬ－１１的大肠杆菌ＹＫ５３７,生产重组人白细胞介素－３（ＩＬ－３）,发现在发酵过程中,限制性流加甘油,控制溶解氧在３０％－４０％左右,３０℃生长,１１ｈ,４２℃诱导培养４ｈ,能将发酵液中最终菌体密度从ＯＤ１６６００提高到ＯＤ５３６００,并且保持了白细胞介素－３的表达量。     

大肠杆菌表达的重组人骨形成蛋白-7的复性

带有pBV221-hBMP-7的E．coli表达得到的rhBMP-7以不溶的包涵体形式存在,用高浓度的变性利溶解后,经过DEAE-FF纯化,得到高纯度的目的蛋白,达95％以上。分别用尿素浓度梯度降低法、添加促复性剂及人工分子伴侣法对蛋白质进行复性,并通过不同方法对复性结果进行比较。Western blot中辉度扫描结果显示,GSH／GSSG法样品二聚体／单体比例为79．5／20．5,尿素浓度梯度降低法二聚体／单体比例为73．6／26．4,表明GSH／GSSG法复性样品溶液上清中含较高比例的蛋白质二聚体。根据不同复性样品对NIH3T3细胞ALP活性影响大小的比较结果,氧化还原剂最有助于二聚体的形成,蛋白质活性最高。     

重组人骨形成蛋白-3羧基端肽在大肠杆菌中表达及其诱骨活性

以双顺反子表达载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了人骨形成蛋白－３羧基端肽段（ｈＢＭＰ－３Ｃ）,表达量占菌体总蛋白量的１８．５％．目的蛋白为２５ｋＤ、含ｈＢＭＰ－３Ｃ端２１５个氨基酸残基组成的肽段,包括ｈＢＭＰ－３成熟肽和一部分前肽．表达产物以包涵体的形式存在,用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的洗涤液和５ｍｏｌ／Ｌ以下脲溶液连续洗涤,可获得较高纯度的重组人骨形成蛋白－３Ｃ端肽．经复性处理成可溶性蛋白,植入小鼠肌肉内,第１４ｄ组织切片显示有软骨细胞和软骨基质形成,第２１ｄ可见成骨细胞和骨基质形成．将ｒｈＢＭＰ－３Ｃ与脱矿去免疫原性异种骨粒复合后作小鼠肌肉植入试验,２１ｄ组织切片上可见硬质骨形成．结果表明：大肠杆菌表达的ｈＢＭＰ－３Ｃ经复性后具有诱骨活性,糖基化并非ＢＭＰ－３活性所必需．     

表达重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的大肠杆菌工程菌的高密度培养

采用溶氧反馈的分批培养流加补料的方法高密度培养重组大肠杆菌BL21(DE3)生产重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。通过摇瓶培养对菌种和培养条件的初步筛选,采用溶氧反馈的流加补料策略,进行了5L发酵罐的合成培养基和复合培养基的发酵工艺的研究。通过对培养条件的不断优化,重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)里得到了高效表达,菌体密度最终达到115g/L(WCW)以上,可溶性重组融合蛋白占菌体总蛋白的30%以上,含量约为1.1~1.2g/L。5L发酵罐的发酵工艺参数在40L发酵罐中进行了放大培养,结果表明该工艺能有效的放大,可适用于工业生产。     

重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白工程菌的高密度培养

在10L发酵罐中对戊型肝炎病毒衣壳蛋白在重组大肠杆菌中表达发酵工艺进行了研究,用分批培养方法探讨了不同培养基、培养基中磷酸盐浓度和Mg^2＋浓度等因素对菌体生长与重组蛋白表达的影响;用分批补料培养研究了不同的补料工艺对菌体生长与重组蛋白表达的影响,同时对重组菌诱导时期、诱导持续时间以及不同诱导温度表达包含体在尿素溶液中的溶解性进行了研究。结果表明,在优化后的培养基中,磷酸盐浓度、Mg^2＋浓度分别为80mmol/L 与20mmol/L时菌体生长与表达效果较好;分批补料培养中,37℃培养9h菌体达到对数期中期(约45OD600)为适宜诱导时期,加入终浓度为10mmol/L IPTG后诱导5h,OD600达到80以上,重组蛋白表达量达到29.74％,为最适收获菌体时间;37℃表达的包含体80％以上溶解在4mol/L的尿素溶液中,最终浓度达到14mg/mL; 10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在30L发酵罐中进行了放大培养,10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在30L发酵罐上具有可放大性与重复性, 可以应用于工业生产。     

重组大肠杆菌产普鲁兰酶的高密度发酵工艺研究

以表达普鲁兰酶的重组大肠杆菌作为出发菌株,在摇瓶培养的基础上,建立了大肠杆菌工程菌产普鲁兰酶的高密度发酵工艺。通过测定细胞密度、细胞干重、分离菌体可溶性成分与不溶性成分及SDS-PAGE电泳,分析重组大肠杆菌的生长和普鲁兰酶的表达情况。摇瓶试验使用合成培养基和LB培养基,重组大肠杆菌在合成培养基生长较慢,诱导5 h的普鲁兰酶表达量高于LB培养基,包涵体比例低于LB培养基。重组大肠杆菌的高密度发酵使用合成培养基,补料阶段采用指数流加的工艺,在设定细胞的比生长速率为0.12的前提下,限制补料中碳源的供应,以阻止乙酸的产生。当细胞密度OD600达到70.0开始诱导,最终细胞密度为每升53.3 g细胞干重,细胞内可溶性普鲁兰酶为每升1.35 g。     

表达重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的:研究表达重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的发酵和表达产物的纯化工艺。方法:利用16L发酵罐发酵培养工程菌,设定了溶氧、搅拌速度、诱导时机、补料和培养基pH值等发酵条件;通过包涵体洗涤、离子交换层析法纯化目的蛋白。结果:工程菌目的蛋白质表达量占菌体总蛋白质的30%以上,纯化后目的蛋白的纯度可达98%。结论:建立了大肠杆菌高效表达人骨形态发生蛋白-7的发酵及纯化工艺。     

重组大肠杆菌高密度发酵研究进展

重组大肠杆菌的高密度发酵是提高基因工程产品产量的一个非常有效的手段,是现代发酵工程研究的一个热点。本文就高密度发酵中影响重组大肠杆菌发酵产率的几个因素,包括宿主菌、培养基、培养条件、补料方法以及高密度发酵过程中存在的问题和对策加以讨论,着重探讨了高密度下大肠杆菌产生的有害代谢副产物———乙酸的产生机制、抑制作用机理,以及控制乙酸积累的技术方法 。     

高密度培养大肠杆菌YK537/pSBHL-11生产重组人细胞白介素

在 Ｂ． Ｂｒａｕｎ Ｅ Ｓ１０ 型１５ Ｌ 和 Ｎ Ｂ Ｓ Ｂｉｏ Ｆｌｏ ３０００ 型５ Ｌ 发酵罐中,利用补料分批培养技术高密度表达培养含重组质粒ｐ Ｓ Ｂ Ｈ Ｌ１１ 的大肠杆菌 Ｙ Ｋ５３７ ,生产重组人白细胞介素３（ Ｉ Ｌ３） ,发现在发酵过程中,限制性流加甘油,控制溶解氧在３０ ％ ～４０ ％ 左右、３０ ℃生长１１ｈ ,４２ ℃诱导培养４ｈ ,能将发酵液中最终菌体密度从 Ｏ Ｄ１６６００ 提高到 Ｏ Ｄ５３６００（ 相当于每升发酵液含１０６ 克湿菌体） ,并且保持了白细胞介素３ 的表达量,占菌体总蛋白的３０ ％ 左右,含量超过３３ ％ ｇ／ Ｌ,使 Ｉ Ｌ３ 包涵体产量从湿重２２ｇ／ Ｌ 提高到８５ ｇ／ Ｌ,纯化步骤比较简单,超声破菌后经两次洗涤纯度就达到７０ ％ 以上。     

培养模式对重组大肠杆菌高密度培养生产谷胱甘肽的影响

利用生物技术方法生产谷胱甘肽（ＧＳＨ）的研究正方兴未艾。本研究室已对面包酵母生产ＧＳＨ进行了较为深入的研究［１,２］,但距工业化生产尚有一段距离,关键在于高ＧＳＨ含量面包酵母的选育较为困难。近来这一方向的研究重点又转向构建重组大肠杆菌来生产ＧＳＨ。虽...     

重组人骨形态发生蛋白2在CHO细胞中的表达、鉴定及活性分析

构建真核表达载体pCDNA3.1( )-hBMP-2,与质粒pSV2-dhfr共转染CHO-dhfr-细胞,以含有700μg/mLG418的IMDM进行选择性培养,筛选抗性克隆,并用MTX扩增,提高rhBMP-2的表达量。收集的rhBMP-2蛋白进行Westernblot检测,还原蛋白样品电泳产生一条大小约为18kD的特异性条带,非还原蛋白样品电泳产生一条大小约为30kD的特异性条带,提示表达的rhBMP-2是经过糖基化修饰的,且以同源二聚体形式分泌表达。单细胞分离培养得到14株rCHO(hBMP-2)单克隆细胞株,ELISA法检测rhBMP-2表达水平,最高可达7.83μg/24h/106cells。活性分析结果表明,表达的rhBMP-2具有很强的生物学活性。