木糖发酵重组菌研究进展

木糖发酵是植物纤维原料生物转化制取乙醇商业化生产的基础和关键 ,但自然界存在的微生物菌株不能满足商业化生产的需要。利用基因工程技术对细菌和酵母进行改造 ,以提高它们在厌氧条件下的木糖发酵能力成为目前研究和开发的重点。通过转基因和基因删除技术 ,主要对Escherichiacoli、Zymomonasmobilis、Pichiastipitis和Saccharomycescerevisiae等典型的乙醇发酵菌株实施基因改造 ,构建出一系列不同类型的木糖发酵重组菌株。与野生型菌株相比 ,重组菌株在厌氧条件下的木糖发酵能力得到了不同程度的改善 ,但是它们仍然未能投入于商业化生产。微生物的木糖代谢工程和木糖发酵重组菌株的构建有待于进一步的深入研究 。     

豆粕发酵制备大豆肽菌株的筛选

微生物发酵豆粕可以降解大豆蛋白为大豆肽,试验以蛋白酶活力和水解度为指标,结合液体发酵和固体发酵工艺考察菌株的发酵能力,从而筛选优良的豆粕发酵菌株。结果表明,通过初筛和复筛获得3株能较好发酵豆粕的芽胞菌菌株,为豆粕发酵工艺的研究奠定了基础。     

菌株CICC 6287发酵特性研究及其在辣椒发酵中的应用

旨在对从新疆乳制品中分离菌株CICC 6287的发酵特性进行研究,并通过辣椒发酵试验评价菌株CICC 6287作为发酵菌株的优势。采用多相分类技术确定该菌株的分类学地位,通过测定耐酸耐盐特性、产酸能力、降解亚硝酸盐能力、氨基酸脱羧酶活性和抑菌能力表征其发酵特性。在此基础上,将菌株CICC 6287应用于新疆特色辣椒发酵中,评价其在辣椒发酵过程中的作用。菌株CICC 6287鉴定为产马乳酒乳杆菌,能够降解亚硝酸盐,耐受8%Na Cl和p H3,抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和沙门氏菌,产生生物胺的四种氨基酸脱羧酶活性为阴性。接种菌株CICC 6287的发酵辣椒亚硝酸盐的含量1.06 mg/kg,生物胺的含量为5.62 mg/kg,总酸含量达到2.54%。研究结果表明,菌株CICC 6287具有良好的发酵特性,能够应用于辣椒发酵,提高发酵辣椒的安全性。     

黑曲霉原生质体诱变选育β-葡萄糖苷酶高产菌株

本研究报道了以原生质体诱变技术选育高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株,并研究了其发酵特性。以黑曲霉CGMCC3.316为出发菌株,通过紫外诱变得到突变株3-3M。然后以3-3M为供试菌株,研究了其原生质体制备与再生的条件。最后通过原生质体诱变,选育得到一株β-葡萄糖苷酶活力较高的突变株60B-3D。该菌株具有良好的遗传稳定性,酶活力平均达到23IU/mL,与出发菌株CGMCC3.316相比提高39%。此外,该菌株的木聚糖酶活力也有所增加。同时考察了黑曲霉60B-3D的发酵特性,并与3-3M和出发菌株进行比较,结果表明该菌株有较高的蛋白分泌能力。本研究为发酵生产β-葡萄糖苷酶提供了一株良好的供试菌株。     

采用新型药物抗性选育高效黄酒酵母菌株

【目的】黄酒酵母菌种是影响大罐黄酒生产效率的关键因素之一,高发酵性能黄酒酵母的选育对于提升黄酒生产效率具有重要的实用意义。【方法】以一种药物抗性为基础设计快速初筛方法,对黄酒酿酒酵母XY进行诱变筛选得到克霉唑(CTZ)抗性的黄酒酵母突变株,进一步以酵母发酵性参数为指标筛选得到发酵速率提高的黄酒酵母新菌株XY-3。【结果】比较突变菌株与原始菌株酿造性能发现,XY-3菌株最大发酵速率较原始菌株提高5.21%。黄酒酿造小试结果显示发酵前4天XY-3菌株乙醇生成速率明显高于原始菌株,其最大乙醇生成速率从XY菌株的14.77 g/d提高到15.30 g/d。XY-3酵母菌株发酵速率的提高能够缩短黄酒发酵周期1-2天,有助于提高发酵设备的利用效率。进一步研究发现XY-3发酵速率的提升可能与XY-3菌株多药物抗性(PDR)有关。【结论】联合使用传统诱变和药物抗性筛选策略选育得到高效黄酒酵母新菌株,这种筛选策略也为发酵食品行业优良菌株的选育提供了一种新的思路。     

饲用微生物的分离鉴定及其对杏鲍菇菌糠发酵的效果

【目的】菌糠的营养素含量齐全,但纤维素含量过高是阻碍其饲料化利用的主要因素。故本研究筛选适合于发酵杏鲍菇菌糠的微生物菌株,以改善其饲用品质。【方法】首先,本研究采用纤维素-刚果红、苯胺蓝和MRS-Ca (De Man, Rogosa, Sharpe-Ca)筛选培养基,结合纤维素、木质素酶活力及抑菌活性的测定,从EM (effective microorganisms)原液发酵的杏鲍菇菌糠中分离筛选具有较强纤维素、木质素降解能力及抑菌能力的细菌/真菌。通过细菌16S rRNA和真菌18S rDNA基因序列分析确定菌株所属种属。其次,将筛选出的菌株菌液等体积混合制成复合菌剂用于固态发酵杏鲍菇菌糠。测定不同发酵时长菌糠营养成分含量以确定最佳发酵时间,并与相同工艺条件下EM原液发酵的杏鲍菇菌糠进行饲用品质比较。【结果】筛选并鉴定得到纤维素酶活性较高的特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)菌株P11、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)菌株R8和马克斯克鲁维应变酵母(Kluyveromyces marxianus)菌株MU5;木质素酶活性较高的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)菌株MU7;抑菌活性较高的类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)菌株R4和乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)菌株R9。使用以上菌株复合发酵杏鲍菇菌糠7 d后,各项指标达到稳定。与EM原液发酵的杏鲍菇菌糠相比,复合菌剂发酵杏鲍菇菌糠的NDF和ADF分别显著降低了19.6%和21.44%(P0.05);CP (crude protein)、CA (crude ash)和EE (ether extract)含量分别显著提高了10.44%、5.26%和123.53%(P0.05)。【结论】本研究筛选得到的芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌优势菌株复合后用于发酵杏鲍菇菌糠可以很好地改善其饲用品质,效果优于生产中常用市售EM原液。     

发酵黄芪的乳酸茵的驯化及其与黄芪相互作用研究

目的驯化能发酵黄芪的优良乳酸菌并研究其与黄芪的相互作用,为开发新型饲料添加剂做准备。方法选取能厌氧发酵黄芪药液的优良乳酸菌,通过在添加黄芪药液的发酵培养基中反复传代对其进行驯化,并用蒽酮-硫酸法测定发酵前后粗多糖的含量,用比浊法测定菌体浓度,并用单因素法研究了最佳黄芪添加量和最佳接种量,初步研究驯化菌株与黄芪药液的相互作用。结果经过6次传代驯化后,驯化菌株发酵黄芪药液后可使其粗多糖得率提高111．9％,而黄芪药液能促进驯化菌株的增殖,可使菌体浓度提高251％。结论驯化菌株与黄芪药液发生了良性的相互作用,有可能开发出新型饲料添加剂。     

发酵黄芪的乳酸菌的驯化及其与黄芪相互作用研究

目的驯化能发酵黄芪的优良乳酸菌并研究其与黄芪的相互作用,为开发新型饲料添加剂做准备。方法选取能厌氧发酵黄芪药液的优良乳酸菌,通过在添加黄芪药液的发酵培养基中反复传代对其进行驯化,并用蒽酮-硫酸法测定发酵前后粗多糖的含量,用比浊法测定菌体浓度,并用单因素法研究了最佳黄芪添加量和最佳接种量,初步研究驯化菌株与黄芪药液的相互作用。结果经过6次传代驯化后,驯化菌株发酵黄芪药液后可使其粗多糖得率提高111．9％,而黄芪药液能促进驯化菌株的增殖,可使菌体浓度提高251％。结论驯化菌株与黄芪药液发生了良性的相互作用,有可能开发出新型饲料添加剂。     

灵芝菌株固体发酵对枇杷叶主要活性成分的影响

采用灵芝固体发酵枇杷叶,筛选出了适合发酵的灵芝菌株并分析了固体发酵前后枇杷叶中主要活性成分的变化。本文选用8个灵芝菌株,根据不同灵芝菌株在枇杷叶基质中的生长情况选出最适合发酵的菌株,并通过灵芝菌株固体发酵三个品种的枇杷叶,研究发酵前后三种枇杷叶中多糖、总黄酮、三萜、总蛋白等活性成分的变化。结果表明:适宜发酵的灵芝菌株为松杉灵芝,经过灵芝菌株发酵枇杷叶后,不同品种的枇杷叶中多糖平均增长率为15.40%、总蛋白平均增长率为43.60%、三萜含量平均降低30.08%、黄酮含量大幅度降低视为未检出。     

霍乱弧菌甘露醇PTS操纵子中mtlR为转录抑制基因

产毒和非产毒的El Tor生物型霍乱弧菌对甘露醇发酵利用的速率有明显差别,在霍乱致病株的快速判断中有重要的参考价值。通过比较快发酵菌株(非产毒株)和慢发酵菌株(产毒株)mtlR缺失突变株与野生株在含0.2%甘露醇的M9培养液及甘露醇发酵液中生长、产酸等的变化,定性地证明了mtlR基因的抑制作用;另外通过定量RT-PCR进一步验证了MtlR蛋白在mtlCBA转录水平发挥负调控作用。但是mtlR还不是引起快慢发酵菌株对甘露醇发酵差异的直接原因。本研究也为我们研究霍乱弧菌甘露醇快慢发酵差异机制提供了必要的参考依据。     

胶质芽孢杆菌HM8841紫外线诱变育种研究

以胶质芽孢杆菌HM8841作为出发菌株,通过紫外线诱变和突变菌株性能测定,选育出3株适合生产发酵的优良菌种。与出发菌株相比,突变株具有缩短发酵周期,提高发酵水平,增强芽孢抗逆性能等特点。     

固体发酵生产Monacolin K的动力学模型

对红曲霉菌株Monacus-3合成Monacolin K的发酵动力学进行了研究,建立了该菌株固体发酵合成Monacolin K的菌体生长、产物合成和底物消耗的动力学模型,并对模型参数进行了非线形回归。结果表明预测值与实验值有良好的拟和性,说明所建数学模型能较好地描述实际合成Monacolin K的固体发酵过程。     

高产精氨酸菌株选育及发酵培养基优化

利用改良阿须贝培养基筛选出4种产精氨酸的菌株,其菌落特征分别为白色链球状菌株,干白分散球状菌株,金黄色杆状菌株,粉红色球状菌株,对它们分别进行了产精氨酸发酵试验,利用分光光度计测定精氨酸含量,最终确定金黄色棒状菌株为生产精氨酸产量较高的菌株。通过单因素和正交设计试验,分别考察玉米浆、硫酸铵、尿素、葡萄糖对金黄色杆状菌株发酵产精氨酸的影响,结果表明最佳条件为:玉米浆浓度3%,硫酸铵浓度6%,尿素浓度0.3%,葡萄糖浓度13%,在此条件下,可获得精氨酸最大产量为368.9ug/mL,与初始发酵培养基条件下发酵相比精氨酸产量提高约300%。该研究为精氨酸菌株的筛选提供了一条新途径,也为所筛选的金黄色杆状菌后期的研究及进一步规模生产精氨酸提供了参考依据。     

苏云金杆菌SD—5菌株发酵生理学研究及生产

通过苏云金杆菌SD－5菌株对混合氨基酸的抗性及在3吨发酵罐中发酵生理学的研究,显示SD－5菌株具有优良的发酵性能。用正交试验设计方法筛选出SD－5菌株发酵培养基配方,菌数可达110－130亿／ml,芽孢率达95％以上。     

过表达MRP8提高酿酒酵母乙酸耐性及乙醇发酵效率

乙酸是木质纤维素水解液中含量较多的抑制物,因此提高酿酒酵母菌株对乙酸的耐受性有助于提高纤维素乙醇生产效率。本文中,笔者利用基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术过表达了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288c线粒体核糖体蛋白编码基因MRP8,并比较了过表达MRP8的菌株与对照菌株的生长和发酵特性。平板耐性检测发现,MRP8过表达明显提高了菌株的乙酸胁迫耐受性;乙醇发酵结果表明,在4.8 g/L乙酸胁迫条件下,过表达菌株MRP8-3在51 h消耗全部的葡萄糖,发酵时间缩短了25 h,显著优于相同时间的对照菌株。本研究结果为构建高效纤维素乙醇发酵的酿酒酵母菌株提供了新思路。     

响应面法优化杀鱼假交替单胞菌2515发酵培养基

杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)2515是一株具有广谱抗弧菌性能的菌株，为提升菌株2515的培养生物量，通过单因素优化方法，研究碳源、氮源、无机盐等营养成分对菌株2515的发酵产量的影响，确定关键营养因子，利用响应面分析法对影响菌株2515生物量的关键营养因子进行优化。结果显示，菌株2515的最佳发酵培养基配方为麦芽糖2.85 g/L、CaCl₂ 0.65 g/L、MnCl₂ 0.10 g/L、酵母膏3.85 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L。优化后的培养基使菌株2515在锥形瓶和发酵罐中发酵的OD₆₀₀值分别为1.416和1.866,生物量分别提高了36.4%和40.4%,其发酵上清液和细胞内容物的抑菌活性分别提高了28.2%和27.2%。表明响应面法优化后的培养基有利于提高菌株2515的发酵生物量及抗菌效果，研究结果为菌株2515的后续开发应用提供了参考。     

从海水环境分离筛选甘蔗渣纤维素降解菌

【目的】筛选海水环境高效甘蔗渣纤维素降解菌,并研究不同菌株间的混合发酵对甘蔗渣纤维素酶活力的影响,为纤维素降解菌在海水养殖中的应用提供理论基础。【方法】采用刚果红染色法进行菌株初筛,利用DNS法测定各菌株胞外纤维素酶活力及不同菌株间的混合酶液与混合发酵酶液的纤维素酶活力。【结果】筛选得到两株具有较强纤维素分解能力的细菌菌株Z4和S5,经16S rRNA基因序列分析,初步鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。菌株S5具有最高的全酶活和甘蔗渣纤维素酶活,分别为1.16 U/mL和2.80 U/mL。菌株Z4与S5间混合发酵能明显提高菌株的纤维素酶活力,比S5单独发酵时全酶活、甘蔗渣纤维素酶活分别提高40.60%、14.21%。同时菌株S5与芽孢杆菌BZ5混合发酵也能提高其纤维素酶活力,比S5单独发酵时全酶活、甘蔗渣纤维素酶活分别提高6.23%、25.92%。【结论】筛选得到两株酶系较全且酶活较高的纤维素降解菌Z4、S5,适宜的混合发酵可明显提高纤维素降解能力,在海水养殖中有较大的应用前景。     

代谢工程与全基因组重组构建酿酒酵母抗逆高产乙醇菌株

将酿酒酵母海藻糖代谢工程与全基因组重组技术相结合,改良工业酿酒酵母菌株的抗逆性和乙醇发酵性能。对来源于二倍体出发菌株Zd4的两株优良单倍体Z1和Z2菌株进行杂交获得基因组重组菌株Z12,并对Z1和Z2先进行(1)过表达海藻糖-6-磷酸合成酶基因 (TPS1) ,(2)敲除海藻糖水解酶基因 (ATH1), (3)同时过表达 TPS1和敲除ATH1, 经此三种基因工程操作后再进行杂交获得代谢工程菌株的全基因组重组菌株Z12ptps1、Z12 Δath1和Z12pTΔA。与亲株Zd4相比,Z12及结合代谢工程获得的菌株在高糖、高乙醇浓度与高温条件下生长与乙醇发酵性能都有不同程度的改进。对比研究结果表明:在高糖发酵条件下,同时过表达 TPS1和敲除ATH1 的双基因操作工程菌株胞内海藻糖积累、乙醇主发酵速率和乙醇产量相对于亲株的提高幅度要大于只过表达 TPS1,或敲除ATH1 的工程菌。结合了全基因组重组后获得的二倍体工程菌株Z12pTΔA,与原始出发菌株Zd4及重组子Z12相比,主发酵速率分别提高11.4%和6.3%,乙醇产量提高7.0%和4.1%,与其胞内海藻糖含量高于其它菌株、在胁迫条件下具有更强耐逆境能力相一致。结果证明,海藻糖代谢工程与杂交介导的全基因组重组相结合,是提高酿酒酵母抗逆生长与乙醇发酵性能的有效策略与技术途径。     

赤霞珠葡萄酒自然发酵中酿酒酵母的菌株区分

采用Interdelta指纹图谱分析, 对分离自宁夏地区赤霞珠葡萄自然发酵过程中的45个酿酒酵母单菌落进行菌株区分, 研究发酵过程中酿酒酵母菌株的变化, 为发酵的有效控制及选育优良酿酒酵母菌株提供依据。结果发现, 本研究分离到的45个酿酒酵母单菌落中, 产生5种指纹图谱, 代表5种不同的基因型, 基因型I-V分别占所分离单菌落的71%、13%、9%、5.0%、2.0%, 基因型I是发酵过程中的优势菌株。本研究中, 二氧化硫处理影响自然发酵过程中酿酒酵母菌株的类型、数目及比例, 但其影响不是很大。     

多拷贝毕赤酵母重组菌表达GCL摇瓶优化和高密度发酵

目的:构建高效表达白地霉脂肪酶的毕赤酵母重组菌株,并对筛选得到的菌株进行摇瓶发酵条件优化和分批补料高密度发酵工艺研究。方法:将诱导型表达载体pPIC9K-gcl电转化至毕赤酵母GS115。通过橄榄油-罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组菌株,运用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR 法确定其拷贝数,并对菌株进行摇瓶发酵条件优化。在此基础上,研究重组菌在3L 发酵罐中的高密度发酵工艺。结果:筛选得到一株具有3 个白地霉脂肪酶基因拷贝的菌株GS115/pPIC9K-gcl 78#,初始酶活力为220 U/ml。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96 h,每24 h甲醇添加量1 %,接种量2 %,培养基初始pH 7.0,500 ml摇瓶装液量50 ml,甲醇诱导温度25℃ 时酶活力达735 U/ml。3L 发酵罐高密度发酵176.5 h,酶活力达到3360 U/ml,总蛋白含量达到4.30 g/L,且发酵过程中细胞活性一直保持在96 % 以上。结论:基因拷贝数与重组菌株的产酶水平呈正相关,摇瓶优化可显著提高重组菌株的产酶能力,为白地霉脂肪酶的工业化生产奠定了技术基础。