几丁质酶表达质粒pKChiA和pMChiA的构建及表达*

从质粒pLCHIA中切出含粘质沙雷氏菌 (Serratiamarcescens)几丁质酶基因 (chiA)的 1 8kbHinfI片段 ,将其插入到表达载体pKK223-3强启动子Ptac下游的SmaI位点内 ,构建成几丁质酶表达质粒pKChiA。再用内切酶BamHI从pKChiA质粒中切出 2.1kbPtac ChiA片段 ,并将其重组到质粒pMC71A的单一BamHI位点内 ,构建成另一种几丁质酶表达质粒pMChiA。这两种质粒可在大肠杆菌HB101和JM10     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在杆状病毒载体与昆虫细胞体系中的表达

根据杆状病毒A组代表种苜蓿Y纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica Nuclear Po-lyhedrosis Virus,简称AcNPV)的分子生物学资料,我们采用分子剪裁和拼接手段,对AcNPV多角体蛋白基因加以修饰,并用人工合成定位探针,获得大约在该基因的ATG转译起始密码子一9处加有合成BamHl连接序列的转移载体质粒pAc—MV。 再与从乙肝病毒adw亚型的表面抗原基因HBng亚克隆株pYPss一1分出带有Ban·Hl粘性末端的HBsAg基因,构建表达载体质粒pAc—MV—HBsAgo经与野生型AcNPV DNA对Spodoptem 7rugJPerda细胞共转染,借助同源交换,获得插有HBsAg基因的多角体缺陷的重组病毒。根据HBsAg诊断血球凝集试验和HBs^g诊断酶标免疫测定,表明重组病毒使HBsAg基因在昆虫细胞中得到了表达,免疫电镜显示表达产物呈球状颗粒,大小约为22nm。表达产物粗制品按1μg／鼠对bal b／c鼠免疫,并于三周后强化免疫能产生抗体。由HBsAg纯样品酶标免疫法标定的标准曲线估计每升培养物的表达产物约{一8mg,细胞量为1一2×106个/ml.用重组病毒感染玉米螟4龄幼虫,也获得HBsAg基因的表达,展示了简易生产HB sag诊断试剂和疫苗的可喜前景。     

蜂毒溶血肽前体蛋白cDNA的克隆及其融合蛋白的表达

从蜜蜂毒腺中提取总RNA ,通过RT PCR扩增得到了蜂毒溶血肽前体蛋白的cDNA ,将扩增产物克隆到 pT7Blu T载体上 ,再进一步将插入片段酶切并连接到 pUC1 1 8载体上 ,构建了重组质粒pUMP。DNA序列分析结果表明 ,克隆得到的cDNA序列与所发表序列完全相同 ,且与 β 半乳糖苷酶部分序列构成正确的读码框。含重组质粒 pUMP的大肠杆菌DH5α表达了与β 半乳糖苷酶部分序列融合的蜂毒溶血肽前体蛋白     

嗜麦芽假单胞菌的碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

用pUCl8质粒作为载体,将嗜麦芽假单胞菌(Psedeomonas maltophilia P27)的碱性蛋白酶基因克隆到大肠杆菌(E．Coli TGI)中,得到3株能分泌碱性蛋白酶的阳性克隆G1,G2和G3。其中G3所分泌的碱性蛋白酶活性最高,大约是出发菌株的3—4倍,对3株阳性克隆所含的重组质粒psJl,psJ2和psJ3进行限制酶酶切分析表明,酶活最高的阳性克隆G3所含的重组质粒psJ3的插入片段最小,大约是2．8kb;其它两株的重组质粒pSJl和pSJ2含有同样大小的插入片段,约为5．5kb。     

海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E.coli中的高效表达

为解决密码子偏好性差异造成的表达水平低下问题,采取了3种手段提高海栖热袍菌胞外α-淀粉酶在E．coli中的表达水平。用PCR方法从海栖热袍菌（Thermotoga maritima）基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶A的完整基因amyA,插入表达载体pET-20（b）中构建成质粒pET—amyA;运用基因工程手段将amyA基因富含稀有密码子的信号肽进行切除,将不含信号肽的amyAⅠ基因插入pET-20（b）中构建成质粒pET—amyAⅠ;用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增出argU基因,插入pET—amyAⅠ中构建成质粒pET—amyAⅡ。将重组质粒分别转化到E．coli JM109（DE3）,并将重组质粒pET—amyAⅠ转化E．coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIL。通过IPTG诱导测酶活性：在E．coli JM109（DE3）中表达的重组酶（pET—amyA）、（pET—amyAⅠ）、（pET—amyAⅡ）的酶活分别是1658．0U／mL、6721．7U／mL、8904．5U／mL,在E．coil BL21-CodonPlus （DE3）-RIL中表达的重组酶（pET—amyAⅠ）的酶活是13867．7U／mL。表明通过这些手段能大幅提高T.maritima胞外α-淀粉酶在E．coli中的表达水平。     

链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1-木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌及毕赤酵母中的高效表达

从橄榄绿链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1中克隆出木聚糖酶基因xynA,将带与不带原基因信号肽编码序列的xynA分别以正确的阅读框架克隆到大肠杆菌表达载体pET22b(+)上的pellB信号肽编码序列之后,得到2种构建的重组载体,在重组大肠杆菌中木聚糖酶得到了表达,表达产物具有生物活性。进一步将不带原基因信号肽编码序列的xynA插入到毕赤酵母转移载体pPIC9中,转化毕赤酵母得到重组子,在重组子中木聚糖酶基因得到了高效分泌表达,在摇床培养水平上的表达量达到200mg/L,且表达产物具有生物学活性。     

球形芽孢杆菌Ts-1原生质体电诱导质粒转化研究

本文探讨了球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus Ts-1原生质体电诱导质粒pHV 33转化的最佳条件：3个连续的间隔为1秒,时程为10μs,强度为21Kv／cm的脉冲,使其转化频率为2．44×102转化子／μgDNA,转化效率为3．16×10-6,质粒转化吸附的饱和浓度为5μg／l03CFU。利用此条件,将重组杀蚊毒蛋白克隆pJB41 7转入Bacillus subtillis 168M和Bacillumphaericus Ts-1中,使得B．Sublilis有了杀蚊活性,但未能提高Ts-1的毒性。     

苏氨酸操纵子的克隆与诱变

本文报道用Hind I+BamHI双酶切方法,从大肠杆菌K12的野生型菌株染色体上克隆苏氮酸操纵子的三个基因(thr A,thr B和thr C)到载体pBR322上,在合成培养基上筛选带thr操纵子的转化子。所得杂种质粒pTH1经羟胺体外诱变,筛选得到抗氨基酸类似物a-氧基-β-羟基戊酸(AHV)的突变质粒pTH2和pTH3,在宿主大肠杆菌C600中产苏氨酸最比初级克隆株高20倍以上,在解除天冬氨酸激酶—高丝氨酸脱氢酶(AKI—HDI)反馈抑制的宿主大肠杆菌A56—121中产苏氨酸量可达11g／L,比初级克隆株大肠杆菌 c600(pTHl)高100倍以上。     

苏云金芽孢杆菌δ－内毒素crylA?基因在大肠杆菌和变铅青链霉菌中表达

利用合成的寡聚核苷酸片段,从质粒pOS1000中分离出具有适合克隆位点的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis )δ－内毒索crylA?全长基因。将该基因与大肠杆菌表达载体pKK223-3重组,并引入大肠杆菌JMl09中,经IPTG诱导．获得了超量表达的CryIA?蛋白。将crylA?全长基因插入链霉菌表达载体pHZl272中,得到重组质粒pHZl256,将该质粒引入变铅青链霉菌(Streptomyces　lividans)JT46中,经硫链丝菌素诱导．通过Westerablotting测定表明,重组变铅青链霉菌JT46(pHZl256)已表达出相应的CrylA?蛋白。杀虫试验表明,大肠杆菌和链霉菌所表达出的δ－内毒索crylA?对小菜蛾均有毒杀作用,其致死率分别为93％和57％。     

枯草芽孢杆菌bgls基因在酵母染色体上整合

将枯草杆菌β－1,3—1,4－葡聚糖酶基因(bgls)2．7kbEcoRl片段和酵母染色体Rdna片段克隆到整合型不含酵母自主复制序列(Autonomusly replicating sequence)的大肠杆菌／酵母菌穿梭质粒YIP5上,构建成YIP5-bgls—Rdna的杂种质粒PCZH,转化S．Cerevisiae并得到表达。稳定性测定表明．Y 33(PCZH101)和Y 33(PCZH104)在无选择压力的YEPD培养基中繁殖70代以上,两个转化子90％以上的酵母细胞仍含有质粒并且遗传特征与染色体行为相似。以bgls基因作探针;与酵母染色体DNA的Southern bloot分子杂交证实bgls基因已整合到酵母菌染色体上。     

构建MicroRNA．29a和microRNA-29c腺病毒并探讨其对膀胱癌细胞增殖能力的影响

构建miRNA．29a／c的重组腺病毒并观察其对膀胱癌T24细胞增殖能力的调控。以人全基因组DNA为模板,PcR扩增miR-29a、miR-29c,克隆至腺病毒穿梭载体pAdtrace．TO4-CMV。重组穿梭载体经pmeI线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化感受态大肠杆菌BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒pAdEasy—1—miR-29a、pAdEasy—1．miR-29c,pacI线性化后转染HEK-293细胞,进行包装和扩增。实时荧光定量PcR检测感染腺病毒的膀胱癌T24细胞miR-29a、miR．29c的表达水平,并利用CCK．8实验检测细胞增殖能力。经DNA测序和限制性内切酶分析显示,重组腺病毒质粒pAdEasy—1—miR．29a、pAdEasy．1-miR-29c构建成功：感染腺病毒Ad—miR-29a和Ad—miR．29c后,经实时荧光定量PCR检测,膀胱癌细胞中miR．29a、miR．29c表达显著增高（P〈0．01）;过表达miR．29a／c后的CCK．8实验显示,细胞增殖能力明显低于对照组伊〈0．05）。以上说明已成功构建miR．29a、miR．29c腺病毒,过表达miR．29a／c可抑制膀胱癌细胞的增殖。     

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

构建了家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的+12位后连接有5个外源基因的克隆位点。将HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的+12位后,构建了pBmIFN+12;同时构建了HuIFN－β克隆在－3位后的转移载体pB．mIFN－3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm—N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN－β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN+12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性为2．0×10⁶Iu／ml,将BmIFN+12注射5龄家蚕虫体,表达水平为5．O×10⁷Iu／ml,是HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒表达量的2—4倍。构建的新型BmNPv载体能够在家蚕高效地表达HuIFN-β。家蚕虫体生产的rHulFN-β蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

含F／2A序列的抗P185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建

目的构建含F／2A序列的抗P185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体,观察其在293T细胞中的表达。方法用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶（Furin）／口蹄疫病毒2A多肽（F/2A）连接人鼠嵌合抗体的重链和轻链,形成一个开放阅读框（ORF）,插入慢病毒表达载体pWPI,构建重组抗P185神睨全长人鼠嵌合抗体表达载体pWPI／H-F2A—L。以已构建的慢病毒表达载体pWPI／H-IRES-L为对照质粒。应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体3质粒系统共转染入293T细胞进行包装,测定病毒滴度。再感染293T细胞,荧光显微镜下观察GFP的表达和转染效率,RT—PER、ELISA方法分别检测嵌合抗体mRNA和蛋白的表达。结果经测序鉴定,pWPI／H—F2A—L与预期设计一致;pWPI／H—F2A—L组的病毒滴度为4．3×10^5TU／ml,而pWPI／H—IRES—L组的病毒滴度为3．5×10^5TU／ml;两组重组慢病毒的转染效率分别为87．68％和79．08％;两组重组慢病毒感染293T细胞后,都有嵌合重链和嵌合轻链的表达,由F／2A介导的嵌合抗体的表达水平要高于由IRES介导的嵌合抗体。结论成功构建了含F／2A序列的抗P185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体,为今后抗P185^erbB2工程抗体的研究奠定了基础。     

生米卡链霉菌变株丙酰化酶基因的克隆和表达

麦迪霉素产生菌生米卡链霉菌(streptomyces mycarofaciens)变株具有丙酰化酶活性,可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素。为了进行丙酰化酶基因克隆,本实验以质粒pIJ702为载体通过鸟枪克隆法将变株DNA片段克隆至变铅青链霉菌TK54(Streptomyces livdansTK54),经薄层层析和高压液相色谱分析结果表明,在转化子中,N0．9菌株可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素,这证明丙酰化酶基因已在变铅青链霉菌TK54中克隆并得到初步表达,№．9重组质粒插入DNA片段为4．16kb,经southern杂交表明确实来源于变株。此外还构建了N0．9重组质粒的限制酶酶切图谱。     

鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原S1基因的分子克隆、序列分析及其DNA免疫的初步研究*

对来源于我国华东地区的鸡传染性支气管炎病毒流行株QD免疫原Sl基因cDNA进行了克隆、序列分析和DNA免疫的初步研究。RT—PCR扩增QD毒株的S1基因,将其5’和3’端分别进行分子修饰后插入克隆载体pUCl8的BamHⅠ／HindⅢ位电,在大肠杆菌中实现了目的基因的克隆;利用英国IBV毒株Sl全基因核酸探针与QD毒株S1基因的重组克隆质粒分子杂交后,采用HaeⅢ,PvuⅡ和XbaⅠ等限制酶对此流行毒株S1基固cDNA进行了酶切分析;在测定QD毒株S1基因5’端高变区核苷酸序列并以此与IBV　M41,H120,6／82及Beaud等参考毒株序列对比分析的基础上,构建了QD株S1基因DNA免疫表达质粒,肌肉注射免疫小鼠后,鸡胚病毒中和试验的结果表明,IBV S1基因DNA免疫表达质粒能诱导小鼠产生病毒特异的中和抗体,具有良好的免疫原性,初步显示基因疫苗在鸡传染性支气管炎防治上应用前景。     

针对潜伏结核感染的 A39 DNA 疫苗构建及其免疫原性研究

选取结核分枝杆菌潜伏相关抗原Rv2029c、结核分枝杆菌优秀抗原Ag85A和Rv3425,构建针对潜伏感染的结核分枝杆菌DNA疫苗pVAX1／Ag85A-Rv3425-Rv2029c （A39）,并对其免疫原性进行研究。首先用聚合酶链反应（PCR）扩增Ag85A基因,构建重组质粒pVAX1／Ag85A （A）;PCR扩增 Ag85A-Rv3425连接片段,插入pVAX1载体,构建重组质粒pVAX1／Ag85A-Rv3425（A3）;PCR扩增Rv2029c基因,插入A3,构建重组质粒pVAX1／Ag85A-Rv3425-Rv2029c （A39）。将构建成功的重组质粒转入 HEK293T细胞,蛋白免疫印迹法验证质粒在真核细胞中得到表达。在大肠埃希菌BL21中成功表达和纯化去除信号肽的Ag85A、Rv3425和Rv2029c蛋白。用质粒免疫C57BL／6小鼠,共分为5组：PBS、pVAX1、A、A3和A39组,采用电脉冲导入免疫,每2周免疫1次,共3次,用酶联免疫斑点检测（ELISPOT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、流式细胞术等方法检测细胞免疫和体液免疫水平。结果显示,A39免疫小鼠后,能引发强烈的细胞免疫反应﹝γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素2（IL-2）高水平分泌﹞,外周血CD4＋／CD8＋ T细胞比值增加,CD8＋穿孔素＋ T细胞比例增加。结果表明,构建的A39 DNA疫苗能引发强烈的免疫反应,显示出良好的抗结核潜力,可作为结核分枝杆菌新型候选疫苗。     

苜蓿根瘤菌nod A蛋白在细胞中的定位

应用噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子表达系统,质粒pT7—6作为载体,构建了带有首蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)nod A基因的重组质粒pBF3.nod A在T7启动子的控制下,经诱导在大肠杆菌JAKE中得到表达,产物为21.5kD多肽.对nod A基因在大肠杆菌中的翻译产物(NodA)进行细胞定位分析表明,NodA同时存在于细胞质和细胞膜中.     

苏云金芽孢杆菌蜡螟变种伴孢晶体蛋白基因的克隆及表达

用改进的碱解法分析基因供体菌苏云金芽孢杆菌蜡螟变种81-6(Bacillus thuringiensis var.galleriae 81-6)株有两种小质粒和一种大质粒。 将碱解法抽提到的质粒用Pstl完全酶解,与同样用PstI完全酶解的载体质粒pcAMPUC连接,以此重组质粒转化苏云金杆菌无晶体蛋白突变株 Bacillus thuringiensis var,kurstaki HD-1 Cry—B株的原生质体。用ELlSA法筛选到一株阳性转化菌落,分析了其质粒组成和插入片段的大小。毒性试验显示阳性转化子对昆虫幼虫有毒杀作用。     

枯草芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因(bglS) 在酵母菌中的克隆与表达

将大肠杆菌质粒pFG1中含枯草芽胞杆菌卢β-1,3—1,4-葡聚糖酶基因(bglS)的2.7kb EcoRI片段克隆到大肠杆菌,酵母菌穿梭质粒上组建成杂种质粒YCSH,转化S.cerevisiae并得到表达。两种不同方向的插入子(YCSH 1和YCSH 5)在酵母菌中表达出的β-1,3-1,4葡聚糖酶活性相差2．3倍。根据酶作用底物专一性测定和酶反应的最适pH分析表明：YCSH中bglS基因产物与出发菌株B．Subtilis 1．88的基本酶学特性完全相同,但YCSH中bglS基因在酶母中的表达水平远比大肠杆菌中低     

芽孢杆菌高表达质粒的构建及其性质的研究

以B.subtilis质粒pUB110为基础构建了双标记(Km²、cm²),多酶切点接头的表达质粒pNQl22和pNQll3系列。pNQl22的分子量为3．2×10⁶道尔顿,其对cm抗性水平和cat-86基因表达水平与质粒pPL600相同,pNQll3系列质粒分子量为3．1—4．1×10。道尔顿。其对cm抗性水平高于质粒pPL600,它们所携带的cat-86基因的表达水平无论在非诱导和诱导条件下部比pPL600高约5倍。无分解代谢阻遏现象,传代稳定,因而可以用作Bacillus属基因工程的载体。