PAMAM介导基因转染的机制与应用进展

聚酰胺-胺型树枝状高聚物(PAMAM)是一种新型的高度分枝的球形纳米级高分子,其表面带有多价功能基团,结构规整呈放射状对称,目前广泛用于生物化学、纳米医药的研究开发中.介于其作为基因载体转染效率高、低毒性、装载量大、可介导遗传物质的稳定表达等优点吸引越来越多的科学家对其进行更深入的研究.本文在简述PAMAM结构和功能的基础上,对近年来关于其介导基因转染的生物学机制、优化与应用进展展开综述.     

一种新的非病毒基因转移载体及其体外细胞转染活性研究

目的：用低分子量的聚乙亚胺(PEI)有效地进行基因转染,为基因转染在基因治疗中的应用提供一种可靠、廉价、高效的方法。方法：将带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的真核表达质粒与阳离子聚合物聚乙亚胺(PEI)结合,用肝癌细胞系SMMC7721实验,研究PEI分子量与转染活性以及可能引起的细胞毒性之间的关系;进一步研究在血清存在的情况下,PEG(聚乙二醇8000)、叶酸等物质对PEI介导的转染效率的影响。结果：分子量为600Da的PEI在pH值为6．0时与质粒DNA以1：1的质量比混合,细胞转染效率最高为43．6 /-7．3％,随着分子量的增大,转染活性略有下降;进一步研究发现,在血清存在下,20μM的叶酸和15％的PEG能有效地改善PEI介导的转染活性,使其转染活性提高了13％;用光学相差显微镜检测了PEI潜在的细胞毒性,结果发现分子量为600Da的PEI没有使细胞形态改变或死亡,但是随着分子量的增大,PEI潜在的细胞毒性也相应增大。结论：PEI是一种高效、有用的非病毒载体,能够在培养的哺乳动物细胞中进行基因转移,这对疾病的基因治疗具有潜在的应用价值。     

运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌载体研究

减毒沙门氏菌通过自然感染的方式高效地将DNA疫苗直接运送给体内的抗原提呈细胞（APCs)如树突细胞（DCs)和巨噬细胞,在粘膜和全身淋巴组织诱发以Th1型应答为主的细胞免疫和体液免疫,APCs尤其是DCs可能在其中起到了关键作用。减毒沙门氏菌已被应用于运送病毒,细菌和肿瘤DNA疫苗并取得一定效果,该途径所诱发的细胞免疫要强于肌注途径接种的相同DNA疫苗,原核表达的重组沙门氏菌和接种蛋白质抗原等免疫方法。本文还对如何增强携带DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌的免疫效果作了探讨。     

DNA疫苗的转染载体及免疫途径

本介绍了阳离子脂质体、聚合胺、减毒侵袭性细菌、Cochleates等可介导疫苗DNA转染的载体,并对肌肉注射、基因枪导入、皮内皮下注射及粘膜接种等可用以DNA疫苗接种的几种免疫途径作一简述。     

减毒活疫苗作为DNA疫苗载体的研究进展

由于胞内感染菌与宿主细胞之间的相互作用,使相应的减毒活疫苗有可能成为更为理想的DNA疫苗载体,本文就减毒活疫苗作为理想的DNA疫苗的生物学基因,研究进展,存在的问题等方面进行综述。     

正常人淋巴细胞程序外DNA合成的水平

程序外DNA合成(unscheduled DNA synthesis,UDS)反映了细胞对DNA损伤进行切除修复的能力,在毒理学、肿瘤学、放射医学等多种学科中都有应用。关于我国正常人外周血淋巴细胞UDS的水平,仅在近几年才有零星的附带观察,例数都较少,而专文报道,迄今未见。本文报告对60例正常人的观察结果。 1 材料与方法1.1 血液样品来源 本院医护人员(除外放射科     

氨基葡甘聚糖的质粒DNA转染载体作用的研究

目的 :发展一种新的半人工合成的质粒DNA转染载体。方法 :用氨基化方法将纯化的葡甘聚糖阳离子化 ,用凝胶阻滞检测法 (gelretardationassayforcomplexformation)观察氨基葡甘聚糖 DNA复合物的形成 ,以及用氨基葡甘聚糖作报告基因质粒pEGFP Cl的载体 ,转染HEK2 93细胞 ,观察转染效率。结果 :葡甘聚糖氨基化后溶液离子强度增大 2 0倍左右 ,氨基葡甘聚糖可与质粒DNA形成复合物 ,形成的复合物转染HEK2 93细胞后 ,报告基因pEGFP Cl获得阳性表达。氨基葡甘聚糖最大至 1 0 %仍未显示细胞毒性。结论 :氨基葡甘聚糖可发展为DNA载体系统 ,在HEK2 93细胞中获得理想的目的基因表达。     

DNA—处理的精子作为基因转移载体

继１９８９年首次报道成功地利用精细胞作为载体把ＤＮＡ转入小鼠胚胎及随后ＤＮＡ整合入小鼠基因组后,现又取得了一些进展和新的发现。据报道,ＤＮＡ可结合或掺入不同种类的动物和昆虫的精子中,包括小鼠、猪、山羊、绵羊、牛、鸡、鲤鱼、海胆、蜜蜂和丽蝇类等。通常,人们用脂质体或电激法来促进ＤＮＡ进入精细胞。这些研究出现的一个意外结果是质粒转基因作为染色体外遗传因子的持久性。１９９５年,澳大利亚研究人员在《动物生物技术》杂志上曾发表了一篇用ＤＮＡ处理的精子人工授精生产转基因牛的报道。经Ｓｏｕｔｈｅｍ印迹分析表明…     

DNA改组在病毒新型疫苗研究中的应用

DNA改组是一种全新的体外人工进化模式,它改变了传统的进化途径,大大加速了蛋白质的进化进程。该技术自1994年建立以来,在医药和酶工程等领域得到了广泛的应用。本文综述DNA改组在病毒新型疫苗及其相关领域的研究进展。介绍DNA改组的原理和在体外人工进化上的优势、病毒疫苗研究、病毒载体的改造等方面的研究进展,同时对DNA改组中面临的困难也进行了剖析。     

减毒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的研究进展

随着沙门氏菌基因组学的深入研究以及DNA重组技术的发展,使得对沙门氏菌进行精确的不可回复性的基因缺失减毒成为可能。减毒沙门氏菌可作为DNA疫苗载体,特异性地将其携带的质粒DNA靶向性的传递给巨噬细胞、树突细胞等抗原递呈细胞,从而有效激发相应的体液与细胞免疫应答。减毒沙门氏菌已作为疫苗载体在针对细菌、病毒、寄生虫等的DNA疫苗研究中得以广泛应用。     

Electrostatic theory of the assembly of PAMAM dendrimers and DNA

The electrostatic interactions mediated by counterions between a cationic PAMAM dendrimer, modelized as a sphere of radius and cationic surface charge highly increasing with generation, and a DNA, modelized as an anionic elastic line, are analytically calculated in the framework of condensation theory. Under these interactions the DNA is wrapped around the sphere. For excess phosphates relative to dendrimer primary amines, the free energy of the DNA‐dendrimer complex displays an absolute minimum when the complex is weakly negatively overcharged. This overcharging opposes gene delivery. For a highly positive dendrimer and a DNA fixed by experimental conditions to a number of phosphates less than the number of dendrimer primary amines, excess amine charges, the dendrimer may at the same time bind stably DNA and interact with negative cell membranes to activate cell transfection in fair agreement with molecular simulations and experiments. © 2016 Wiley Periodicals, Inc. Biopolymers 105: 276–286, 2016.     

体外分子定向进化研究进展

体外定向进化作为近几年发展起来的一种蛋白质改造新策略,可以在未知目标蛋白三维结构信息和作用机制的情况下,通过对编码基因的随机突变、重组和定向筛选,获得具有改进功能或全新功能的蛋白质,使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现,因而是发现新的生物活性分子和反应途径的重要方法,已在短短几年内取得了令人瞩目的成就.     

粤紫萁离体再生技术研究

粤紫萁(Osmunda mildei)为新近形成的自然杂交种,其分布区狭窄、种群个体数量少、有性繁殖能力极低.该文以孢子为外植体,以MS、3/4MS、1/2MS和1/4MS为基本培养基,探讨不同生长调节剂对粤紫萁孢子萌发、原叶体增殖和孢子体形成的影响.结果表明:粤紫萁孢子中极少的可育孢子在植物生长调节剂的作用下,能够萌...     

pNEgr-mIL-12真核表达载体的体外和体内生物学活性检测

肿瘤的基因-放射治疗是近年来发展起来的新技术.分别于体外和体内检测含辐射敏感启动子和mIL-12基因的真核表达载体（pNEgr-mIL-12）的生物学活性.体外经酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法检测转染pNEgr-mIL-12重组质粒的COS-7和B16细胞可经辐射诱导mIL-12 p70表达,于1.5～2.0 Gy照射后表达增高最明显,COS-7细胞于照后4 h 达峰值,B16细胞的表达水平随照射后时间延长而逐渐增高;pNEgr-mIL-12重组质粒联合电离辐射治疗小鼠移植肿瘤,单次或多次注射pNEgr-mIL-12重组质粒,联合局部照射能够抑制小鼠移植肿瘤生长,与单纯照射组比较肿瘤生长速度减慢,瘤重降低,尤以多次给予质粒治疗组效果明显.为进一步探讨最佳治疗方案及临床肿瘤病人的基因放射治疗提供了初步依据.     

铜绿假单胞菌Las系统信号分子对小鼠巨噬细胞影响的体外研究

对于包括铜绿假单胞菌在内的众多微生物而言,群体感应系统是细菌表达毒力因子的重要调节子．Las和Rhl是群体感应两个主要组成部分．Las和Rhl分别受自诱导剂N-3-氧化十二烷酰基-L-高丝氨酸内酯(3-oxo-C₁₂-HSL)和N-丁酰-L-高丝氨酸内酯(C₄-HSL)的影响．最近的研究进展显示群体感应分子尤其是3-oxo-C₁₂-HSL具有调节宿主免疫系统的能力．本实验展示了3-oxo-C₁₂-HSL可以诱导鼠源巨噬细胞(RAW264.7)的凋亡和吞噬作用．把合成的3-oxo-C₁₂-HSL加入RAW264.7细胞培养基中,发现细胞生活力以一种依赖于3-oxo-C₁₂-HSL的浓度(6.25 to 100 μmol/L)和培养时间(2 to 24 h)的方式逐渐丢失．同样,我们观察到3-oxo-C₁₂-HSL的细胞毒活性,用3-oxo-C₁₂-HSL处理的细胞出现细胞形态上的改变,这一改变表明3-oxo-C₁₂-HSL处理的细胞加速凋亡,这一点同时也被其他多个标准(caspases3、8和9,线粒体膜电位,磷脂酰丝氨酸的表达)所证实．中性红吞饮实验证明,3-oxo-C₁₂-HSL会显著地减小RAW264.7细胞的吞噬能力(P < 0.05)．同时,高浓度的3-oxo-C₁₂-HSL会降低RAW264.7细胞对铜绿假单胞菌的吞噬作用(P < 0.001)．这些数据表明3-oxo-C₁₂-HSL能特异性地促进细胞凋亡的诱导和RAW264.7细胞吞噬能力的减小．这可能和3-oxo-C₁₂-HSL诱导的细胞毒性有关．最终我们的实验数据证明,群体感应信号分子3-oxo-C₁₂-HSL在铜绿假单胞菌感染的致病机理中扮演着重要的角色．     

In vitro dose dependent inverse effect of nantenine on synaptosomal membrane K-p-NPPase activity

The effect of nantenine, an aporphine alkaloid, on ATPase K+-dependent dephosphorylation was evaluated using p-nitrophenylphosphate (p-NPP) as substrate. Basal K+-p-NPPase activity was significantly increased with 3 x 10(-4) M, remained unchanged with 3 x 10(-6) M, 3 x 10(-5) M but was reduced with 7.5 x 10(-4) M and 1 x 10(-3) M nantenine, whereas Mg2+-p-NPPase activity was not modified. Kinetic studies showed that K+-p-NPPase inhibition by nantenine is competitive to KCl but non-competitive to substrate p-NPP, whereas K+-p-NPPase stimulation by nantenine is non-competitive to KCl but competitive to p-NPP. These data suggest that there may be two acceptor sites for nantenine in p-NPPase, one eliciting stimulation and the other inhibition of K+-dependent p-NPP hydrolysis. Considering the biphasic action of nantenine on seizures and the correlation between decreased ATPase activity and seizure development, alkaloid anticonvulsant effect observed at low nantenine doses is attributable to the stimulation of phosphatase activity whereas the convulsant effect at high alkaloid doses seems related to Na+, K+-ATPase inhibition.     

pZ189质粒DNA体外复制系统的建立

报道了含SV40复制起点的质粒DNA在真核细胞抽提物中进行复制的DNA体外复制系统的建立. 在外源性蛋白质SV40大T抗原(SV40 Tag)的参与下,穿梭质粒pZ189能在猴肾vero细胞胞浆抽提物中,利用其中参与体内DNA复制所需的蛋白质成分,有效地进行体外DNA复制. 从而为研究真核细胞DNA复制系统的结构与功能提供了简单、有效的模型.     

西藏虎头兰高效植株再生体系的研究

为建立西藏虎头兰(Cymbidium tracyanum)的高效快速繁殖体系,该研究以野生西藏虎头兰种子为外植体,通过分析不同基本培养基和植物激素配比对原球茎诱导、增殖和分化的影响,以及光照时间和培养温度对试管苗生长的影响,筛选出适宜西藏虎头兰植株高效再生的条件。结果表明:适宜西藏虎头兰生长的基本培养基为1/2 MS;种子萌发和原球茎诱导的最适培养基为1/2 MS+1.0 mg·L~(-1)6-BA+0. 5 mg·L~(-1)NAA,培养50 d后,有95.00%的种子发育成原球茎;原球茎增殖的最适培养基为1/2 MS+2.0 mg·L~(-1)NAA,培养30 d,增殖倍数为4.25;原球茎的最适分化培养基为1/2 MS+2.0 mg·L~(-1)NAA+60 g·L~(-1)土豆泥+0.5g·L~(-1)活性炭,培养10 d,不定芽发生率为98.33%,培养40 d,幼苗生根率为94.67%;试管苗在温度20℃、光照时间12 h·d~(-1)、光照强度2 000 lx的条件下培养,苗长势好,叶片生理性焦尖发生率仅为3.33%;以腐殖土作为栽培基质,试管苗的移栽成活率为97.78%。该研究结果为保护西藏虎头兰野生资源和工厂化育苗提供了科学依据和技术支持。     

大肠杆菌碱性磷酸酶的体外定向进化研究

大肠杆菌碱性磷酸酶（E.coli alkaline phosphatase, EAP, EC 3.1.3.1）是一个非特异性二聚体磷酸单酯酶. 采用易错聚合酶链反应(error prone PCR)的方法,在原有高活力突变株的基础上,对EAP远离活性中心催化三联体的区域进行定向进化,经两轮error prone PCR,获得催化活力较亲本D101S突变株提高3倍、较野生型酶提高35倍的进化酶4-186,并对该酶的催化动力学特征进行了分析. 进化酶基因的DNA测序表明4-186含两个有义氨基酸置换：K167R和S374C,二者既不位于底物结合位点,也不位于酶的金属离子结合位点.     

连香树水提物和乙醇提取物的体外抗氧化研究

为了探究连香树水提物和乙醇提取物的主要成分和抗氧化作用,该研究采用水提和醇提两种方法提取连香树叶片中的代谢物并测定其主要成分,通过体外抗氧化实验,即清除羟自由基(·OH)、DPPH自由基(DPPH·)、超氧阴离子(O_2~-·)和还原铁离子(Fe~(3+))的能力等四个指标来评价其抗氧化作用。结果表明:连香树水提物和乙醇提取物中均含有山萘酚。此外,水提物中还含有苜蓿素和异槲皮苷等黄酮类物质;乙醇提取物中还含有柚皮素和槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷等黄酮类物质。水提物和乙醇提取物均有清除羟自由基、DPPH自由基、超氧阴离子及还原三价铁离子的能力。抗氧化的作用随提取物浓度的增大而增强,其中清除超氧阴离子(IC50值分别为0.092、0.002 mg·mL~(-1))的能力强于阳性对照Vc(IC_(50)值为0.241 mg·mL~(-1))且铁离子还原力的IC_(50)值(水提物为0.014 mg·mL~(-1),乙醇提取物为0.001 mg·mL~(-1))相对较小,说明其总抗氧化活性较强。由此可见,连香树水提物和乙醇提取物均具有良好的抗氧化作用,可作为一种潜在的天然抗氧化剂。