酵母质粒的益处及潜在困难

在基因工程技术公司和华盛顿大学于西雅图公布他们在干扰素研究方面的成就前,关于在酵母中,而不在细菌中表达哺乳动物基因的可能性几乎没有什么新消息。部份原因是缺乏有关酵母的基本的分子生物学知识。当发现酵母不能应付分裂基因时,它的提倡者在早期遭受了一次重大的挫折。大多数哺乳动物的基因密码序列被非编码的序列遮     

利用同源重组对酵母人工染色体左右臂进行多基因修饰

构建携带哺乳动物细胞筛选基因和酵母人工染色体(YAC)同源序列的载体,利用酵母中能够发生高频率同源重组的特点对YAC分别进行左、右臂修饰,依次将NEO、EGFP及PURO基因定点整合到YAC左右臂上。用营养缺陷筛选的方法排除酵母发生突变或随机整合等情况后,用PCR及Southern杂交方法证实各筛选基因定点整合于YAC两臂上,从而获得携带3个哺乳动物细胞筛选基因的YAC克隆。并且由此建立了通过同源重组将哺乳动物标记基因定点引入YAC左右臂的多基因修饰平台。     

载有磷酸甘油激酶基因启动子的新表达载体的构建以及在发酵性丝孢酵母中启动外源基因的表达研究

利用简并PCR技术从一株丝孢酵母(Trichosporon sp.)中克隆到磷酸甘油激酶基因的部分序列,然后利用染色体步移的方法克隆到了已知片段的上游序列约950bp。通过启动子序列分析软件分析,发现序列中含有启动子所需的必须元件如TATA BOX和CAAT BOX等,因此确定克隆到的基因片段含有启动子序列。将潮霉素基因置于该启动子下构建了丝孢酵母整合型表达载体pTFPH,并转化发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans),转化后的酵母能够在含有潮霉素的抗性选择性平板长出,而未进行转化的对照菌株则不能生长。以上试验证明:丝孢酵母的磷酸甘油激酶基因启动子具有启动异源基因在发酵性丝孢酵母中表达的功能,这个结果为油脂酵母工程菌的构建和开发新的酵母表达宿主奠定了基础。     

利用结构优化的TALE-TF高效诱导MEF细胞内源基因Oct4的表达（英文）

转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)已用于基因组编辑,而TALE转录激活因子(TALE-TFs)可用于内源基因的调控。通过修饰的TALE蛋白与内源基因的启动子特异性结合来激活或抑制基因的表达。但是,对于截短了N端的TALE是否会影响TALENs的效率还不确定。本文设计了不同长度N端的TALENs哺乳动物及酵母表达载体,对应哺乳动物绿色荧光报告载体及酵母报告载体。分别在哺乳动物细胞和酵母细胞上对不同长度N端TALENs的活性进行了检测。检测结果发现,含120个氨基酸N端的TALEN在酵母AH109细胞中的活性最高,N端长度为153个氨基酸的TALENs在293T细胞中表现最高的活性,但N端长度为153、140和160个氨基酸的TALENs的活性差异不显著(P0.05)。随后,将结构优化了的TALE-TF用于小鼠胎儿成纤维细胞中激活Oct4基因。相对阴性对照组,TALE-TF将Oct4基因表达量上调了418倍。本研究结果表明,在哺乳动物细胞和酵母细胞中,具有最高活性TALENs的N端长度是不同的。本研究用结构优化的TALE-TF诱导内源基因高水平的表达,为从体细胞中获得iP S细胞提供了研究策略。     

利用结构优化的TALE-TF高效诱导MEF细胞内源基因Oct4的表达（英文）北大核心CSCD

转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)已用于基因组编辑,而TALE转录激活因子(TALE-TFs)可用于内源基因的调控。通过修饰的TALE蛋白与内源基因的启动子特异性结合来激活或抑制基因的表达。但是,对于截短了N端的TALE是否会影响TALENs的效率还不确定。本文设计了不同长度N端的TALENs哺乳动物及酵母表达载体,对应哺乳动物绿色荧光报告载体及酵母报告载体。分别在哺乳动物细胞和酵母细胞上对不同长度N端TALENs的活性进行了检测。检测结果发现,含120个氨基酸N端的TALEN在酵母AH109细胞中的活性最高,N端长度为153个氨基酸的TALENs在293T细胞中表现最高的活性,但N端长度为153、140和160个氨基酸的TALENs的活性差异不显著(P>0.05)。随后,将结构优化了的TALE-TF用于小鼠胎儿成纤维细胞中激活Oct4基因。相对阴性对照组,TALE-TF将Oct4基因表达量上调了418倍。本研究结果表明,在哺乳动物细胞和酵母细胞中,具有最高活性TALENs的N端长度是不同的。本研究用结构优化的TALE-TF诱导内源基因高水平的表达,为从体细胞中获得iP S细胞提供了研究策略。     

黑曲霉htmA基因的分离鉴定及其功能分析

本研究通过分析比较黑曲霉基因组与人、哺乳动物和酿酒酵母基因组序列同源性,首次分离鉴定了黑曲霉htmA基因,该基因长3459bp,编码1083个氨基酸。已知真核生物的htmA基因编码一种类α-甘露糖苷酶I的非必须蛋白HTMA,在内质网中参与降解非正确折叠的糖蛋白,htmA基因的破坏会延迟非正确折叠糖蛋白的降解。为分析htmA基因在黑曲霉中的功能,运用同源重组技术敲除黑曲霉基因组中的htmA基因,获得htmA基因缺失突变菌株,并进行了缺失株外源漆酶分泌能力的检测。结果表明黑曲霉htmA基因的破坏延缓了外源漆酶的降解,由此推测黑曲霉htmA基因编码蛋白HTMA具有与酵母、哺乳动物HTM1P/EDEM类似的功能作用。     

酵母基因编辑技术:从单基因操作到基因组重建

DNA双链发生断裂(Double strand break,DSB)时,细胞通常会采用同源重组(Homologous recombination,HR)这一主要修复方式。基于这一原理,人们开发出多种技术引入双链断裂从而实现对基因组DNA序列的靶向编辑。真核生物基因敲除或编辑最早通过在外源片段中引入双链断裂和同源臂在酵母中获得成功。30多年来,酵母遗传操作走过了一条从单基因单位点到多基因多位点,乃至最新的基因组合成与重建之路。本文沿着引入DNA双链断裂技术的发展与演变这一主线,对一系列基因编辑及基因组编辑技术的发展进行了简要回顾和综述,旨在理清基因编辑技术的发展脉络,也为高等哺乳动物的基因编辑技术体系的建立和完善提供参考。     

美国、欧盟和中国生物技术药物的比较

按照相同表达系统表达的相同氨基酸序列的产品视为同种产品,而不同表达系统表达的相同氨基酸序列的产品视为不同产品的原则,归纳总结了美国、欧盟和中国已批准上市的生物技术药物。美国FDA批准的以基因工程产品、抗体工程产品和细胞工程产品为主要代表的生物技术药物共79种(18种为大肠杆菌表达,8种为酵母表达,53种为哺乳动物细胞培养生产),其中基因重组蛋白质药物为64种。欧盟批准了49种基因重组酶、激素或细胞因子,11种基因重组治疗性抗体和5种基因重组疫苗。在欧美60％-70％的产品由哺乳动物细胞表达。中国批准了27种生物技术药物。比较了美国、欧盟和中国生物制药的特点。     

丝状真菌的细胞凋亡

凋亡是一种程序性细胞死亡类型,为多细胞生物发育和维持生命所必需的,也普遍存在于细菌等原核生物和酵母、丝状真菌等真核生物中。丝状真菌既具有酵母和哺乳动物共有的凋亡同源蛋白,也具有酵母所不具备的哺乳动物凋亡同源蛋白,所以其凋亡机制较酵母更为复杂,而又较哺乳动物简单。凋亡在丝状真菌的发育、繁殖、衰老等过程中具有重要的作用。近年,丝状真菌作为新的凋亡研究的模式生物被广泛研究,而且进展迅速。综述丝状真菌的凋亡现象和检测方法,丝状真菌中凋亡的生物学功能,丝状真菌凋亡的诱导条件,以及丝状真菌凋亡相关基因的功能研究进展。     

产甘油假丝酵母TRP1基因的克隆与功能分析

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes) WL2002-5 是我国发酵甘油生产菌种, 具有高产甘油和耐高渗透压的优良性能。本文采用遗传互补的方法从产甘油假丝酵母基因文库中克隆了TRP1基因(CgTRP1)。序列分析显示, 该基因编码区全长735 bp, 编码的磷酸核糖氨基苯甲酸同分异构酶(CgPRAI)氨基酸序列与其他酵母来源的PRAI蛋白同源性在32.9%~49.2%之间。功能互补实验显示, CgTRP1基因在高拷贝情况下可以互补酿酒酵母trp1基因功能但在低拷贝情况下只能部分互补酿酒酵母trp1基因功能, 是一条功能明确、结构完整的酵母新基因。在CgTRP1 基因下游发现另一蛋白编码基因, 编码的氨基酸序列与酵母无机焦磷酸酶有很高的相似性。     

Sirt基因家族及其对细胞寿命的调节

在酵母、线虫和果蝇中,Sir2基因家族是寿命调节的关键因子。哺乳动物的Sirt基因家族在进化上与Sir2基因高度同源,共有7个成员。Sir2基因调节酵母寿命的机理已比较清楚。而哺乳动物Sirt基因,特别是Sirt1基因与细胞衰老的关系正在成为新的研究热点。最近的研究表明,在热量限制或氧化逆境条件下,SIRT1蛋白主要是通过以下3个途径影响细胞寿命:一是SIRT1蛋白抑制PPAR-γ减少细胞的脂质过氧化的损伤;二是SIRT1蛋白通过调控p53的活性影响细胞寿命;三是SIRT1蛋白通过调控FOXO的信号通路,启动细胞的抗氧化途径。进一步研究Sirt基因家族对揭示哺乳动物寿命之谜具有重要的科学意义。     

毕氏酵母胱硫醚合成酶基因的克隆和序列分析

胱硫醚合酶（cystathione beta-synthase,CBS）是半胱氨酸代谢中一个重要的酶。以PCR技术为主,克隆了毕氏酵母来源的CBS基因。首先基于不同来源的CBS基因的序列比对,设计了一对CBS的性简并引物,用它扩增出毕氏酵母CBS基因的一个保守片段。根据这段DNA的序列,设计了5′RACE和3′RACE的引物,分别克隆了该基因的3′区和5′区。由此装配出完整的毕氏酵母的CBS基因序列。该基因编码了一种501个氨基酸残基的蛋白质。核苷酸序列和氨基酸序列的排比显示该基因与酿酒酵母来源的CBS基因有较高的相似性。破坏该基因,造成毕氏酵母的半胱氨酸生长依赖性。该序列已存入GenBank／EBM／DDBJ数据库,其登录号为No.AF367364。     

IGS基因及RAPD标记分析在加特隐球酵母基因分类中的应用

根据ITS1-5.8S-ITS2区域的特异核酸序列变化,加特隐球酵母Cryptococcus gattii(≡新型隐球酵母加特变种Cryptococcu neoformans var.gattii)可分为6种基因型。本研究通过检测加特隐球酵母的IGS基因,发现其IGS序列有着更丰富的变异和信息位点。通过结合加特隐球酵母RAPD(随机扩增的多态性DNA)图谱比较研究,与IGS和ITS的序列分析结果大体一致,说明新近发现的加特隐球酵母ITS8型确实有别于以前报道过的其他加特隐球酵母ITS基因型。研究证明IGS1及IGS2基因片段分析可以作为加特隐球酵母基因分类鉴定中有效的辅助鉴别的分子生物学方法,联合多种基因分类鉴定的方法可以更有效地揭示新型隐球酵母加特变种种内不同基因亚型间的遗传进化关系。     

牛凝乳酶原基因克隆及序列的进化分析

利用RT-PCR克隆获得牛凝乳酶原基因的cDNA序列, 测序后与GenBank中凝乳酶原基因进行序列比对和生物信息学分析。序列比对统计分析显示, 该基因为牛凝乳酶原B基因, 与已知牛和其他哺乳动物的凝乳酶原基因具有很高的同源性,18种哺乳动物凝乳酶原基因密码子一、二、三位点的碱基偏倚度分别为：6.227、1.042和1.456。这表明该基因具有整体保守性和突变位点偏倚性两个特征, 可以作为哺乳动物系统进化的研究对象。采用多种方法构建的该基因系统进化树一致表明, 偶蹄动物与灵长动物的亲缘关系比偶蹄动物与啮齿动物的亲缘关系更近, 比偶蹄动物与食肉动物的亲缘关系更远, 并且18种哺乳动物的亲缘关系与动物种系进化关系一致, 为哺乳动物系统进化关系研究提供了分子水平的佐证和依据。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因在毕赤酵母中克隆与分析

目的:克隆丙型肝炎病毒核心蛋白基因及其上游DNA序列,为此基因的表达研究作准备。方法:用反转录和PCR方法从HCV的总RNA中扩增得到核心蛋白基因及其上游DNA序列,连接到pMD18-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组质粒,测序证明正确后,再将目的基因在毕赤酵母中进行克隆,鉴定。结果:重组质粒转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论:应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HCV核心蛋白基因。     

含不同长度前C序列的乙型肝炎病毒核心抗原基因在重组痘苗病毒中的表达

核酸序列分析表明,乙型肝炎(乙肝)病毒核心抗原基因(C基因)编码区内存在两个ATG。目前认为第二个ATG为乙肝病毒C抗原的起始密码子,两个ATG之间的序列称为前C序列,共87bp。Uy、Rutter、Roossinck及景新等的研究表明,含前C序列时,C基因在大肠杆菌中的表达是形成具有HBeAg活性的P25~e膜蛋白,在哺乳动物细胞中的表达则是形成分泌性的HBeAg;不含前C序列时,在大肠杆菌和哺乳动物细胞中均形成P21~e     

猪瘟病毒流行毒株E2基因密码子优化及在酵母中的高效表达

密码子的偏嗜性是影响基因异源表达的重要参数之一,优化密码子序列能够提高外源基因的表达水平。野生型猪瘟病毒E2基因在毕赤酵母中的表达量较低,为了提高E2基因在毕赤酵母中的表达水平,利用PCR基础上的定点突变技术将E2基因上的毕赤酵母低利用密码子突变为其高利用率的简并密码子。结果表明,替换野生型E2基因上24个酵母低利用密码子后,E2基因在酵母中表达水平有较显著提高,表明通过密码子优化提高E2基因在毕赤酵母中的表达这一策略是成功的。     

细胞周期调控的一个重要元素-CDC48

细胞周期调控研究已成为当前生物学领域的一大热门课题,对哺乳动物和酵母细胞周期调控的研究已经非常深入且日臻成熟;植物细胞周期调控研究起步相对较晚但近些年来在该领域也取得了很大的进展。CDC48是真核生物中普遍存在的一个重要的细胞周期调节基因,其蛋白产物CDC48也是研究较为成熟的一个周期蛋白,国外生物学者对该基因已经开展多年研究,而国内尚未见任何报道。主要论述近几年来有关真核生物酵母、哺乳动物和植物CDC48的研究现状及发展趋势。     

Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白的毕赤酵母表达系统构建

蛋白的糖基化对蛋白的活性、高级结构及功能都有重要的影响。酵母表达的糖蛋白不同于哺乳动物表达的杂合型或复杂型糖蛋白,而是高甘露糖型或过度甘露糖化糖蛋白。在前期成功敲除毕赤酵母α-1,6-甘露糖转移酶(Och1p)基因、阻断毕赤酵母过度糖基化,获得毕赤酵母过度糖基化缺陷菌株GJK01 (ura3、och1) 的基础上,通过表达不同物种来源的α-1,2-甘露糖苷酶I (MDSI) 的活性区与酵母自身定位信号的融合蛋白,并通过DSA-FACE (基于DNA测序仪的荧光辅助糖电泳) 分析筛选报告蛋白HSA/GM-CSF (人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白) 的糖基结构,发现当编码酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶 (MnsI) 基因的内质网定位信号与带有完整C-端催化区的拟南芥MDSI基因融合表达时,毕赤酵母工程菌株能够合成Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白。这为在酵母体内合成类似于哺乳动物杂合型或复杂型糖基化修饰的糖蛋白奠定了基础。     

哺乳动物非经典分泌信号肽介导重组EGFP蛋白向毕赤酵母细胞壁转运

为探索哺乳动物非经典分泌信号肽在毕赤酵母表达系统中引导重组蛋白分泌的作用,本研究将一段来源于小鼠同源异型框蛋白(En2)的分泌信号序列(SS)融合至EGFP蛋白的N端,在毕赤酵母中表达。实验结果显示SS信号肽能通过一种不同于经典的内质网-高尔基体分泌通路的方式将EGFP蛋白分泌至细胞膜表面,与α交配因子前导肽相比,显著降低了细胞的内质网压力。本研究提示哺乳动物非经典分泌信号肽可作为递送重组蛋白至酵母膜表面的一项工具。