视黄醇结合蛋白的分离纯化

在变性条件下,应用Sephacryl-100凝胶过滤和Source-30Q阴离子交换两步分离,实现了分离纯化性质不稳定、易于降解的视黄醇结合蛋白(RBP)之目的。最后经过分步缓慢复性,获得具有生物活性的RBP,为其单克隆抗体制备及最终应用于临床营养评价和相关疾病的诊断创造了条件。     

快速分离纯化质膜蛋白的方法

ARapidMethodforIsoationandPurificationofMembraneProteinPEIZhen-Ming;TANGZhang-Cheng(ShanghaiInstituteofPlantPhysiology,TheChineseAcademyofSciences,Shanghai200032）质膜上存在质子泵、离子通道、载体、蛋白激酶、激素受体、其它一些受体等，因为这些蛋白与植物的信     

生物素标记钙调素用于植物钙调素结合蛋白的检测

用生物素标记了花椰菜ＣａＭ。生物素标记的ＣａＭ具有与天然ＣａＭ相似的Ｃａ＾２＋依赖电泳特性,可激活ＣａＭ依赖性磷酸二酯酶,能够检测出５０ｎｇ的磷酸二酯酶。利用它建立了检测植物ＣａＭ结合蛋白的生物素－覆盖法并证实酶标亲和素可与胡萝卜愈伤组织内６４ｋＤ蛋白质非特异结合,因此将此法运用于植物材料时必要设置酶标亲和素处理的对照。用生物素－覆盖法检测胡萝卜愈伤组织形态过程中的ＣａＭ结合蛋白时可检出２,４－Ｄ     

鱼肝中蛋白磷酸酶的分离纯化

鱼肝中蛋白磷酸酶的分离纯化徐立红,张甬元,陈国胜,徐盈（中国科学院水生生物研究所,武汉４３００７２）原田健一（日本名城大学药学部）关键词鱼,蛋白磷酸酶,纯化,抑制ＩＳＯＬＡＴＩＯＮＡＮＤＰＵＲＩＦＩＣＴＩＯＮＯＦＦＩＳＨＰＲＯＴＥＩＮＰＨＯＳＰＨＡＴ...     

生物素标记钙调素用于植物钙调素结合蛋白的检测

用生物素标了己了花椰菜ＣａＭ。生物素标记的ＣａＭ具有与天然ＣａＭ相似的Ｃａ２＋依赖电泳特性,可激活ＣａＭ依赖性磷酸二酯酶,能够检测出５０ｎｇ的磷酸二酯酶。利用它建立了检测植物ＣａＭ结合蛋白的生物素－覆盖法（Ｂｉｏｔｉｎ－ｏｖｅｒｌａｙ）并证实酶标亲和素可与胡萝卜愈伤组织内６４ｋＤ蛋白质非特异结合,因此将此法运用于植物材料时必需设置酶标亲和素处理的对照。用生物素－覆盖法检测胡萝卜愈伤组织形成过程中的ＣａＭ结合蛋白时可检出２,４－Ｄ诱导的ＣａＭ结合蛋白。     

用生物素-中性抗生物素蛋白结合导致的位阻来控制连接生物素的缓激肽生物活性(英)

缓激肽是一含有9个氨基酸残基的多肽,其残基序列为Arg¹-Pro²-Pro³-Gly⁴-Phe⁵-Ser⁶-Pro⁷-Phe⁸-Arg⁹-OH,在激肽释放酶的作用下, 从其大的前体多肽——激肽原而形成的.许多发病机理,如发炎、疼痛、哮喘等都与缓激肽有关. 它能与PC12细胞表面的受体作用,引起细胞器内的钙离子释放,在共焦显微镜下,通过观察钙指示剂Fluo-3荧光增加来监测缓激肽的生物活性.在这项研究中,利用固相肽合成方法合成了连接生物素的缓激肽,Biotin-Arg¹-Pro²-Pro³-Gly⁴-Phe⁵-Ser⁶-Pro⁷-Phe⁸-Arg⁹-OH,通过对其生物活性的研究发现：a.它能保持象天然的缓激肽那样的生物活性;b.由于中性抗生物素蛋白与连接的生物素的结合引起的空间位阻阻碍它与细胞表面受体的相互作用,从而抑制了它的生物活性;c.在有自由的生物素存在的条件下,自由生物素与连接生物素与中性抗生物素蛋白的竞争结合,能够使得与中性抗生物素蛋白结合的连接生物素的缓激肽从抗生物素蛋白上脱离,因而恢复其生物活性.因此,可利用生物素和抗生物素蛋白来控制连接生物素的缓激肽的生物活性.这对于研究生物体系中生物活性的结构相关性具有重要的意义.     

亲和素结合蛋白性质的研究

前曾发现在日本血吸虫虫卵中,存在一种新的能与亲和素专一性结合的蛋白质,称为亲和素结合蛋白（ＡＢＰ）。在分离纯化ＡＢＰ的基础上,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０分别测定了ＡＢＰ的分子量,并做了糖蛋白染色及等电,大测定。实验结果表明ＡＢＰ是一个分子量为６５ｋＤ的碱性糖蛋白,由数个相同的分子量为１２．７ｋＤ的亚单位组成。ＳＤＳ、β－巯基乙醇处理的ＡＢＰ仍能与亲和素结合,提示ＡＢＰ的亚单位能与亲和素结合。氨基酸修饰剂ＮＡＩ、ＤＴＮＢ、ＮＥＭ及ＮＢＳ对ＡＢＰ与亲和素的结合有不同程度的影响,而ＨＮＢＢ、ＴＮＢＳ及ＩＡＡ对ＡＢＰ与亲和素的结合无影响,提示ＡＢＰ分子中氨基酸残基Ｔｙｒ、Ｃｙｒ是ＡＢＰ与亲和素结合所必需的,可能参与结合位点的形成。另外,测得ＡＢＰ与亲和素结合的结合常数为１．４×１０~（－７）ｍｏｌ／Ｌ。     

重组SARS冠状病毒刺突蛋白的表达和分离纯化

SARS冠状病毒的感染能引发人的严重急性呼吸综合征。根据对其他种类冠状病毒的研究结果 ,刺突(spike)蛋白 (S蛋白 )是病毒的主要表面抗原 ,重组S蛋白可用于临床诊治 ,疫苗制备和结构生物学研究。SARS病毒S蛋白基因被分段和完整地克隆到不同的细菌表达载体进行了表达。通过宿主菌的选择和条件的优化 ,其中75 1～ 192 5bp、2 0 0 5～ 3410bp、1～ 192 5bp、32～ 36 5 9bp片段及全长 1～ 376 8bpDNA都在大肠杆菌中实现了高效表达 ,表达量分别占菌体蛋白质的 35 %、34%、2 4 %、17%和 5 % ,并经亲和层析得到了部分纯化。纯化后的蛋白质将用于诊断试剂和结构生物学研究。     

Characterization of auxin-binding protein 1 from tobacco: content, localization and auxin-binding activity

There is evidence that auxin-binding protein 1 (ABP1) is an auxin receptor on the plasma membrane. Maize (Zea mays L.) possesses a high level of auxin-binding activity due to ABP1, but no other plant source has been shown to possess such an activity. We have analyzed the ABP1 content of tobacco (Nicotiana tabacum L.) to examine whether or not the ABP1 content of maize is exceptionally high among plants. The ABP1 content of tobacco leaves was shown by quantitative immunoblot analysis to be between 0.7 and 1.2 μg ABP1 per gram of fresh leaf. This value is comparable to the reported value in maize shoots, indicating that ABP1 is present at a similar level in both monocot and dicot plants. The ABP1 content of tobacco leaves was increased up to 20-fold by expression of a recombinant ABP1 gene, and decreased to half of the original value by expression of the antisense gene. Although ABP1 was found mainly in the endoplasmic reticulum fraction, a secreted protein showing a molecular size and epitopes similar to intracellular ABP1 was also detected in the culture medium of tobacco leaf disks. The secretion of this protein was dependent on the expression level of the ABP1 gene. Received: 24 February 1999 / Accepted: 25 March 1999     

粪肠球菌Ace重组蛋白的表达、纯化及黏附活性研究

构建含粪肠球菌表面蛋白Ace保守序列A的重组载体,在大肠埃希菌M15中进行诱导表达、纯化表达产物,研究其黏附活性。以粪肠球菌标准株JH2-2为模板进行PCR扩增ace基因保守序列A,构建重组质粒pQE30/Ace,转化至表达宿主菌M15中进行诱导表达,利用SDS-PAGE和Western blot进行分析和鉴定表达结果,Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,同时用纯化的Ace重组蛋白免疫新西兰兔,用所得相应的抗血清分别进行黏附和黏附抑制实验。结果可见,构建的重组质粒经酶切鉴定和测序鉴定证明其中插入片段为ace基因保守序列A,测序结果与Genbank上登录序列完全一致;SDS-PAGE分析显示,重组工程菌表达了一相对分子质量(Mr)约为37 ku的目的蛋白条带,Western blot检测其能与6×His单克隆抗体发生特异性反应。粪肠球菌JH2-2能够黏附于胶原蛋白Ⅰ表面;抗Ace多克隆抗体可抑制46℃培养的JH2-2对胶原蛋白Ⅰ的黏附,这种抑制作用与其稀释度呈负相关。构建的原核表达载体PQE30/Ace在E.coli M15中成功地表达,纯化的重组Ace蛋白具有胶原黏附活性。     

烟草薄层培养生长素结合蛋白ABP1的定位和ABP1在细胞分化中的变化

以烟草（Nicotiana tabacum L.)盛花期花梗薄层为材料,研究营养芽分化的不同时期生长素结合蛋白（ABP1)在组织与细胞中的分布变化,免疫荧光标记结果表明,烟草花梗中ABP1主要分布于表皮及亚表皮1－2层细胞内。不同分化期ABP1在烟草花梗薄层原生质体中的表达不同,细胞分化旺盛期ABP1的表达最强,分化后期ABP1的表达有所减弱;Western blotting结果表明,ABP1多克隆抗血清与烟草花梗薄层细胞及分化过程中26kD蛋白有免疫交叉反应。     

重组SARS冠状病毒M蛋白的表达、纯化及鉴定

SARS冠状病毒是人的严重急性呼吸综合征的病原体。根据对其他种类冠状病毒的研究结果 ,膜蛋白 (M蛋白 )是病毒主要的结构蛋白 ,重组M蛋白可被用来作为抗原检测对应冠状病毒的感染和制备疫苗。SARS病毒M蛋白基因克隆到原核表达载体pMAL cRI中 ,利用N端和C端分别融合麦芽糖结合蛋白 (maltosebindingprotein和MxeGyrAinteinCBD的策略 ,在大肠杆菌中初步表达了重组M蛋白 ,并通过Western印迹和质谱对蛋白质进行了鉴定。重组蛋白质经亲和层析得到了部分纯化 ,纯化后的蛋白质将用于功能研究与诊断试剂盒的研制。     

GFP-SA融合蛋白的表达纯化及其锚定修饰肿瘤细胞的研究

目的　GFP（绿色荧光蛋白）-SA（链亲和素）双功能融合蛋白的制备及其鉴定研究,以展示我们建立的技术平台,即用含链亲和素的双功能融合蛋白对生物素化的细胞表面进行高效的锚定修饰。方法　构建原核表达载体pET24d/GFP-SA转化大肠杆菌BL21(DE3)。用IPTG诱导重组蛋白的表达,用镍金属螯合（Ni-NTA）层析柱进行纯化。用制备的GFP-SA双功能融合蛋白,对B16肿瘤细胞已生物素化的细胞表面进行修饰,经荧光显微镜和流式细胞仪进行修饰效率分析。此外,用MTT法检测细胞表面修饰对肿瘤细胞活力及其生长情况的影响。结果　GFP-SA重组融合蛋白在大肠杆菌实现了高效表达（约占细菌总蛋白的20%）,通过纯化和复性制备的GFP-SA双功能融合蛋白具有双重活性,即：链亲和素介导的、对生物素高效特异的结合活性,和GFP发射绿色荧光的活性,并能高效修饰表面已生物素化的肿瘤细胞。此外,GFP-SA双功能融合蛋白的细胞表面修饰对细胞的活力及其生长无显著影响。结论　GFP-SA融合蛋白能高效修饰表面已生物素化的肿瘤细胞,可用作肿瘤疫苗研究的示踪蛋白及实验对照体系。     

小麦内切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的分离纯化研究

小麦内切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的分离纯化研究郑远旗,杨宗剑,李建吾,周立,吴文莲（四川大学生物系,成都６１００６４）余露（中国科学院成都生物研究所,成都６１００４１）关键词内切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白;内切多聚半乳糖醛酸酶;纯化;小麦内切多聚半乳糖...     

ELP_(30)-tag蛋白纯化能力的原核表达研究

目的:探究一种小分子量类弹性蛋白标签(elastin-like protein tag,ELP tag)——ELP_(30)-tag在原核表达系统中的蛋白纯化能力。方法:人工合成ELP_(30)-tag基因并将其构建于pET-28a(+)载体,结合2种内含肽(intein1和intein2)基因和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)基因,构建4个含有不同元件序列的原核表达载体:pET-ELP_(30)、pET-ELP_(30)-eGFP、pET-ELP_(30)-intein1-eGFP和pET-eGFP-intein2-ELP_(30);将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,并通过可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)纯化重组蛋白ELP_(30)、ELP_(30)-eGFP、ELP_(30)-intein1-eGFP和eGFP-intein2-ELP_(30),随后通过调节溶液pH值或添加二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT)分别诱导intein1和intein2断裂,最后再经ITC分离获得纯eGFP。结果:利用设计的ELP_(30)-tag成功纯化获得了重组蛋白ELP_(30)、ELP_(30)-eGFP和eGFP-intein2-ELP_(30);重组蛋白ELP_(30)-intein1-eGFP和eGFP-intein2-ELP_(30)中的内含肽可经诱导发生断裂而释放eGFP,但未能分离获得纯eGFP。由此为小分子量ELP-tag的运用和优化设计奠定了一定基础。