乙型脑炎病毒野毒株及其不同株减毒株E蛋白基因序列比较

为了解乙脑减毒活疫苗株SA14 14 2的神经毒力减毒机制 ,用RT PCR方法分别扩增不同减毒程度毒株的E基因 ,克隆、测序 ,继而对各毒株序列进行比较。结果表明SA14 强毒株与SA14 12 1 7株间只有 3个氨基酸发生改变 (E 10 7,E 176 ,E 4 39) ,SA14 12 1 7与SA14 9 7和SA14 5 3株间有另 3个氨基酸发生改变 (E 138,E 2 79,E 315 )。SA14 9 7株与SA14 5 3株只有一个核苷酸NT 4 0 5不同 ,但未引起氨基酸改变。SA14 14 2疫苗株除保留SA14 12 1 7和SA14 9 7所改变的 6个氨基酸外 ,另有 2个氨基酸发生了改变 (E 177,E 2 6 4 ) ,共计在E区共发生 8个氨基酸的替代。SA14 12 1 7株的低神经毒力很不稳定而其余各株的弱毒特征很稳定。因此 ,E 176 (Ile→Val) ,E 4 39(Lys→Arg)和E 10 7(Leu→Phe)可能与神经外和神经内毒力减弱有关。E 138(Gul→Lys) ,E 315 (Ala→Val)和E 2 79(Lys→Met)的突变可能与神经毒力的减弱和稳定性相关     

利用流行性乙型脑炎病毒减毒株脑细胞吸附特征快速筛选减毒株的初步研究

实验证明,流行性乙型脑炎病毒减毒株的脑细胞吸附能力明显低于强毒株。据此,我们发展建立了一种从强毒SA14株中快速、简便地筛选减毒株的新方法。将3周鼠脑细胞37℃吸附SA14株1小时,从未吸附的病毒颗粒中挑出3个减毒株(C4、C5和B1)。将C5株再次吸附筛选,得到C563株。C563株已完全丧失对3周鼠的脑内毒力和皮下毒力,免疫小鼠一针即能诱导良好的抗体反应和保护力,经BHK21细胞盲传5代或乳鼠脑传一代,毒力没有明显回升。     

流行性乙型脑炎病毒减毒株和野毒株在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的表现

乙型脑炎病毒减毒株(2-8株)和野毒株(SA14株)在生物学性质上有明显的不同,特别是嗜神经毒力方面,2-8株已丧失了对小白鼠、马,猴等敏感动物的脑内致病力。为了探讨这些生物学性质变化的物质基础,我们开展了乙脑强、弱毒株聚丙烯酰胺凝胶     

用乙脑病毒减毒株单克隆抗体分析乙脑病毒强毒株和减毒株的抗原差别

用乙型脑炎(乙脑)病毒强毒株免疫制备的单克隆抗体(McAb)分析证明强毒株之间的抗原差别,已有研究报道。本实验用乙脑病毒减毒活疫苗2-8株免疫制备的McAb分析强毒株和减毒株之间的抗原差别。 一、乙脑病毒株 2-8株和5-3株均为减毒活疫苗株。SA14株和A2株均为强毒株,SA14株是2-8株和5-3株的母株,A2株是国内实验室标准株。     

流行性乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2E基因稳定性研究

为研究乙脑病毒减毒株SA14-14-2 E蛋白基因稳定性,将乙脑病毒减毒株SA14-14-2在原代地鼠肾细胞(PHK)上传至18代,应用RT-PCR分别扩增PHK6代、PHK7代、PHK8代、PHK13代、PHK18代E蛋白基因并测序后,与Genebank中乙脑病毒减毒株SA14-14-2(D90195)进行比较分析。PHK6、PHK7、PHK8代病毒与D90195 E蛋白核苷酸和氨基酸序列完全相同。PHK13、PHK18代病毒与D90195E蛋白核苷酸序列同源性分别为99.8%、99.7%,与D90195E蛋白氨基酸序列同源性分别为99.6%、99.4%。各代次病毒E蛋白与减毒相关氨基酸未发生改变,同时所有突变的氨基酸均非SA14原有的,故不是恢复性突变。结果表明乙脑病毒减毒株SA14-14-2的遗传学特性稳定,从分子水平证明乙脑病毒减毒株SA14-14-2及其生产的疫苗具有安全性。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2E基因的稳定性

分别对SA14-14-2(PHK8代)疫苗株及其原野毒株SA14和另2个疫苗传代株[SA14-14-2(PHK17代)和SA14-14-2(鼠脑1代)]的E区基因进行了序列测定.结果表明,乙脑病毒减毒活疫苗SA14-14-2在PHK细胞上连传至17代时,发现2个氨基酸突变(E-331、E-398),但不是回复突变.虽然在毒力最容易返祖的乳鼠脑内传1代后发生E-107个氨基酸回复,但与野毒株毒力相比仍然相差很大,无毒力返祖现象.在疫苗的实际质控工作中,对上述与毒力相关的基因进行监测,可能有助于发现减毒活疫苗的毒力水平,为疫苗安全性提供更可靠的检测手段.     

乙型脑炎病毒毒力基因定位的研究进展

乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)属于黄病毒科(Flaviviridae),简称乙脑病毒.该病毒能引起人类的急性脑炎,致死率在20%左右,另有50%的患者会遗留神经系统方面的后遗症.乙脑病毒流行于亚洲及太平洋地区,有季节性的特点,一般蚊虫滋生的7、8、9月是其发病高峰期.每年在亚洲的乙脑病例有50 000例左右,其中致死的有上万人之多,是亚洲公共卫生的一个大问题[1],因而对乙型脑炎病毒功能与结构的研究,尤其是对影响其毒力的功能域的定位,多年以来都是研究的热点.     

我国流行性乙型脑炎病毒毒力和抗原性的研究

流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的毒力,多与毒株的大小空斑数的比例有关;同株内大斑小斑的特征各异。60年代和80年代的乙脑毒株,其毒力无明显差异。单克隆抗体(McAb)51～8对15株乙脑病毒的中和指数(log10)为:6.05～6.25者3株,5.08～5.67者5株,4.0～4.67者4株,1.95～3.83者3株。这种差别与毒株的分离年份和地区无关。多克隆抗体(PcAb)的中和指数(log10):5.0～5.33者11株,4.0～4.73者4株。可见McAb能较好地反映乙脑毒株的抗原性差别。文中讨论了毒力检查和McAb抗原分析的流行病学和免疫学意义。     

豆鼠对流行性乙型脑炎病毒和圣路易脑炎病毒感受性的比较研究

圣路易脑炎与流行性乙型脑炎(以下简称乙型脑炎),在临床、传播媒介、流行季节和病毒性质上都很类似。在免疫血清学上虽有一定区别,但对实验室常用的动物中,主要只有小白鼠有高度的易感性,而在易感程度、感受途径和症状上,两者都没有显著区别。在免疫血清学方面,不仅操作比较麻烦,并且二者的抗原构造也有相似的部分,出现某种程度的交叉反应。因此,我们认为进一步寻找对这两型病毒在易感性上有区别的动物种,对病毒生物学性质的研究以及实际应用都是必要的。     

乙型脑炎病毒sA14-14-2株NS1基因片段的克隆、测序与表达

以流行性乙型脑炎病毒减弱毒株SA14－14－2的基因组RNA为模板,采用RT－PCR技术扩增其NS1基因的cDNA,将其克隆到pMD18-T载体中,得到克隆质粒pMD18-T-NS1.pMD18-T-NS1经EcoRI和SalI酶切后,回收NS1片段克隆到原核表达载体pET-28a( )EcoRI/SalI位点,构建了重组原核表达质粒pET-28a（＋）－NS1。转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导诱导获得高效表达。产物经SDS－PAGE电泳结果显示,表达产物分子量约为45kD。Western blotting分析表明产物具有抗原活性。     

流行性乙型脑炎病毒E基因的克隆、表达及初步应用

参照GenBank中的日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14株序列设计了一对特异性引物,用PCR方法从SA14-14扩增E基因全长,然后克隆到pMD18-T载体中,转化宿主菌DH5a,提取阳性克隆质粒进行双酶切鉴定,将目的片段定向克隆到pET32a( )中,转化入BL21(DE3),经IPTG诱导可表达分子量约73ka的蛋白,Western blotting试验呈阳性,表明E基因得到表达。以纯化的表达产物为核心抗原,猪抗JEV血清为一抗,HRP标记羊抗猪IgG抗体为二抗建立间接ELISA方法,并初步检测了一些血清样品,结果提示表达的蛋白具有很好的应用开发价值。     

乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白主要抗原片段的高效表达

在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,将其亚克隆入酵母表达载体pPICZα-A,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物.由于糖基化不同,所表达产物有两种,其相对分子质量分别为44kDa和50kDa,表达量较高,约为290mg/L,经Western印迹验证,有较好的抗原性.在ELISA试验中,我们直接以PBS透析后的酵母上清包被,能够很明显地区分出乙脑阴阳性血清,与RT-PCR检测的相符率达95%,为制备JEV的诊断抗原和基因工程疫苗提供了依据.     

乙型脑炎病毒SA14—14—2株E蛋白主要抗原片段的高效表达

在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,将其亚克隆入酵母表达载体pPICZα-A,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物.由于糖基化不同,所表达产物有两种,其相对分子质量分别为44kDa和50kDa,表达量较高,约为290mg/L,经Western印迹验证,有较好的抗原性.在ELISA试验中,我们直接以PBS透析后的酵母上清包被,能够很明显地区分出乙脑阴阳性血清,与RT-PCR检测的相符率达95%,为制备JEV的诊断抗原和基因工程疫苗提供了依据.     

一株强神经毒力乙脑病毒株的生物学及其分子特征

研究一株神经毒力很强的乙型脑炎病毒株SA4株的生物学特性并进行基因组全序列分析,并找到其毒力强的分子基础。将SA4脑内接种昆明小鼠后每日观察发病和死亡鼠数并每日收取鼠脑,用空斑法检测接种后不同时间点的脑内病毒增殖滴度,同时以另一株乙脑病毒SA14按照相同方法进行平行实验作为对照。SA4株的全基因组测序序列结果与乙脑SA14株及世界各地共21株乙脑病毒的全基因组序列进行比较。结果显示,脑内接种SA4株的小鼠发病和死亡时间均比SA14株早1d,在相同时间点上SA4株的病毒滴度高0.5～1.0lgPFU/mL。SA4株与世界各地毒株基因同源性比对,核苷酸同源性为84.6%～99.0%,氨基酸同源性为95.2%～99.7%。与SA14相比,氨基酸序列存在17个位点的差异,分布于不同的区段,其中E区最多,为5个。证明SA4是一株在脑内具有较快繁殖力的神经毒力很强的毒株,其序列上17个氨基酸位点的替换很可能是其强神经毒力的分子基础。     

烟草花叶病毒及其弱毒疫苗-N14基因组cDNA克隆的构建与侵染性分析

植物病毒弱毒疫苗在防治植物病毒病害中发挥着重要的作用,但对于其致弱的根本原因和机理仍不十分清楚。弱病毒能够在植物体内生存和繁殖,却不严重危害植物的生长、开花和种子生产,而对外来病毒具有杀灭和防治作用,这种共生和保护宿主的现象是大多数植物弱病毒所具有的共同...     

日本脑炎病毒E基因与流感病毒HA基因的串联表达及应用

根据GenBank公布的日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV) SA14 14 2株的核酸序列和人流感病毒的血凝素基因(ha)序列, 设计一对特异性引物, 用 PCR方法扩增编码 JEV囊膜蛋白主要抗原域基因, 其中含ha基因主要核苷酸序列。将PCR产物定向克隆入原核表达载体 pET 32a( ), 构建原核表达载体 pET EHA。阳性质粒转化BL21(DE3)宿主菌, 经 IPTG诱导获得表达, 重组蛋白以包涵体的形式存在。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。利用纯化的表达产物与流感病毒血凝素单抗及乳胶建立了诊断日本脑炎病毒抗体水平的乳胶凝集试验。结果表明乳胶凝集方法具有简便快速、敏感性高、特异性强、价格低廉、可现场检测等优点, 是一种适合基层兽医单位用于日本脑炎病毒抗体水平检测的新方法。