番茄叶霉病菌ISSR-PCR体系的建立

以番茄叶霉病菌(Passalora fulva)基因组DNA为模板,采用单因素试验和正交设计试验对该菌ISSR-PCR体系中的一些重要参数(Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶、缓冲液、循环次数)和引物进行筛选和优化,并对退火温度进行了梯度优化,建立了番茄叶霉病菌ISSR-PCR的最佳反应体系(20μL):Mg2+1.5 mmol/L,dNTPs 0.4 mmol/L,引物1.5μmol/L,模板DNA45 ng,TaqDNA聚合酶1.0 U,1倍的PCR缓冲液,循环40次,退火温度50℃。     

光裸星虫ISSR-PCR反应体系的单因素优化试验

以光裸星虫为试验材料,通过单因素方法对影响其ISSR-PCR扩增效果的因子(模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶、甲酰胺和二甲基亚砜)浓度进行研究。确立适合光裸星虫ISSR-PCR的反应体系:25μL体积含1×PCR buff-er、模板DNA用量为10-50 ng、TaqDNA聚合酶为0.75-1.75 U、Mg2+浓度为1.5-2.5 mmol/L、dNTP浓度为0.20 mmol/L,引物浓度为0.8-1.2μmol/L,甲酰胺和二甲基亚砜的添加并不能优化光裸星虫ISSR-PCR反应结果。利用所建立的体系对广西北海群体的20个光裸星虫个体基因组DNA进行ISSR-PCR扫描,结果表明,优化后的体系均能扩增出清晰、多态性高的条带。     

蚬壳花椒ISSR-PCR反应体系的建立及优化

通过单因素试验及正交设计方法对影响蚬壳花椒ISSR-PCR扩增的主要因素(模板DNA、Mg2+的浓度、引物、dNTPs,TaqDNA聚合酶的用量以及退火温度)进行优化,以建立蚬壳花椒ISSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:最佳反应体系(20μL)为模板DNA 60ng、MgCl2 2.5mmol/L、dNTPs 0.15mmol/L、引物0.6μmol/L、TaqDNA聚合酶2.4U。在此基础上,从100条引物中筛选出18条扩增稳定、多态性好的ISSR引物并经过10份蚬壳花椒种质检验,证明该体系具有扩增条带清晰、稳定、重复性好等优点。该反应体系的建立为蚬壳花椒种质资源分类、遗传多样性分析提供了更客观可靠的方法。     

芋ISSR-PCR扩增反应体系的建立

目的:获得清晰可靠、重复性较好的ISSR-PCR扩增反应体系,应用于芋种质资源进行遗传多样性的研究中.方法:以芋的幼叶提取基因组DNA为材料,采用正交试验设计L16(45),从模板DNA浓度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度及TaqDNA聚合酶的用量5因素4水平出发,构建芋最佳反应体系.结果:芋ISSR-PCR的最佳反应体系为:在25μl的反应体系中,40ng DNA模板、0.4μmol/L引物浓度、2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、1 U Taq DNA聚合酶.结论:利用芋种质资源对最佳反应体系的验证,结果显示该反应体系具有扩增稳定性.     

朝鲜碱茅ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为进一步开展朝鲜碱茅种质资源遗传多样性的研究,以野生朝鲜碱茅(Puccinellia chinampoensis)为材料,通过单因子试验对ISSR-PCR反应进行优化。确立最佳的PCR反应体系:在20μL反应体系中,含有模板DNA 40 ng,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.8μmol/L,TaqDNA聚合酶1 U,MgCl22.5 mmol/L和10×PCR Buffer(Mg2+free)2μL。此外,还筛选到10条扩增稳定、条带丰富的候选引物,并确定了各自的最佳退火温度。     

鲤TRAP分子标记反应体系的建立与优化

针对鲤(Cyprinus carpio)这一主要水产养殖品种设计了靶位区域扩增多态性(target region amplified polymorphism,TRAP)分子标记的反应体系,对影响TRAP反应体系的各参数,包括Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA和引物浓度进行了优化,建立了适合鲤的、稳定、可重复的TRAP-PCR反应体系。在15μlPCR反应体系中,Mg2+浓度为1.5mmol/L、dNTPs浓度为0.35mmol/L、两个随机引物浓度均为3pmol/L、固定引物浓度为10pmol/L、含DNA模板60ng、TaqDNA聚合酶1.0U。鲤的TRAP反应程序为:94℃4min,1个循环;94℃45s,35℃45s,72℃1min,5个循环;94℃45s,53℃45s,72℃1min,35个循环;72℃10min,1个循环。这一优化体系的建立为今后进行鲤群体遗传多样性、种质鉴定、遗传连锁图谱及亲缘关系分析等方面的研究提供了新的分子标记。     

均匀设计在枇杷ISSR-PCR反应体系优化中的应用

本实验通过U25(54)均匀设计实验研究,对枇杷ISSR-PCR分子标记体系中模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物5个组分的浓度进行优化.获得25 μL反应体系中各成分的适宜浓度或用量分别是:模板DNA为10ng、dNTPs为0.5 mmol/L、Taq DNA聚合酶为1 U、Mg2+为2.5 mmol/L,引物为0.4 μmol/L.与单因素梯度优化体系相比,操作简便,简化了实验步骤,获得的实验结果可靠,从100条ISSR引物中筛选出27条扩增良好的引物,并获得了这些引物的最佳退火温度,经琼脂糖凝胶电泳获得了清晰的图谱.这一优化体系的建立为进一步利用ISSR标记技术进行枇杷种质鉴定及遗传多样性分析提供了一个标准化程序.     

大薯ISSR-PCR反应体系的优化

以大薯为材料,通过试验优化了ISSR-PCR反应体系中的主要成分用量及浓度、退火温度对大薯ISSR扩增结果的影响。试验表明:在20μL的反应体系中,Mg2+的浓度为1.875 mmol/L,dNTPs浓度为0.500 mmol/L,引物的浓度为1.0μmol/L,TaqDNA聚合酶的用量为1U,模板DNA的用量为60 ng,在48℃的退火温度下45个循环,能得到清晰、多态性高的ISSR带谱。     

紫云英ISSR引物的筛选及PCR反应体系的优化

以紫云英为研究材料,用哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物和11种株系紫云英品种的DNA为模板进行PCR扩增,筛选出33条扩增条带较好的ISSR引物,对其中的ISSR引物进行梯度PCR,筛选出最佳的退火温度。再采用正交试验和单因素试验相结合的方法对紫云英ISSR-PCR反应体系的5种因素(模板、Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP及引物)进行优化浓度。确立了适合紫云英的ISSR分析的反应体系。在25μl反应体系中,其反应浓度为:DNA模版50.00ng,Mg2+2.00mol/L,Taq聚合酶1.0 U,dNTP 0.25mmol/L,引物0.20μmol/L,2.5μl 10×buffer。本试验为以后利用ISSR技术进行紫云英遗传多样性分析和物种保护奠定了技术基础。     

散斑壳属ISSR-PCR反应条件的优化

以散斑壳属 (Lophodermium) T29、T50、T62、R111菌株为研究材料,对该属ISSR-PCR反应体系中的模板DNA浓度、引物浓度、Mg2 浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度以及退火温度等条件进行优化,寻找出适合此类真菌ISSR-PCR反应的最佳反应体系为15 μL反应体系中,模板DNA浓度为 4～8 ng/μL、引物浓度 0.4～0.5 μmol/L、Mg2 浓度 2.0～2.5 mmol/L、dNTPs浓度 0.15～0.30 mmol/L、Taq DNA聚合酶量1.5～2.5 U,退火温度为 52 ℃.