黑曲霉糖化酶基因启动子功能鉴定

从糖化酶工业生产菌株Aspergillus nigerCICIM F0410基因组DNA中扩增糖化酶基因启动子(PglaA),并将该启动子替换质粒pRS303K上KmR基因启动子,构建成糖化酶基因启动子功能检测质粒pRS-PglaA-KmR。将pRS-PglaA-KmR转入E.coliJM109中,得到重组菌E.coli(pRS-PglaA-KmR)。通过对重组菌的氨基糖苷磷酸转移酶基因活性检测,表明PglaA在E.coli中具有驱动KmR基因表达的活性。采用不同诱导物进行培养发现,葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖或玉米淀粉,可以不同程度增强PglaA的强度。     

niaD基因与uidA基因共转化糖化酶高产菌株Aspergillus niger T21

从Aspergillu niger T21 分离到自发性的氯酸盐抗性株,再经氮源生长试验获得硝酸盐还原酶缺陷的niaD 突变体N44。用含有niaD的质粒pSTA10转化N44,转化频率为5个／μg(转化子/DNA)。转化子的Southem印迹分析表明niaD基因同源整合到N44的染色体DNA中。pSTA10与含葡糖苷酸酶基因(uidA)的质粒pNOM102共转化N44,共转化频率为40％。共转化子的(GUS(葡糖苷酸酶)活力测定结果表明uidA基因已在N44中表达。由此可知,以niaD为选择标记,uidA为报告基因,以N44为受体的转化系统可用于丝状真菌启动子功能检测和已知调控序列的功能分析。     

黑曲霉糖化酶的分离纯化及其性质

采用硫酸铵分级DEAE-纤维素离子交换层析、Sephadez G—150凝胶过滤等方法,从黑曲霉AS 3.4309变异株B-11的发酵液中分离出三种电泳均一的糖化酶(GI、Gill、GII)。其收率分别为0.8％、50％和18．6％。GI、Gill和GII的分子量分别为27000、67000和53000;等电点分别为3.38、3.52和3．59;含糖量分别为8．7％．13．6％和18．3％;最适pH分别为4.4、4．6和4.6;对可溶性淀粉的Km值分别为2．0、0．77和1．18g／L;二级结构中a-螺旋含量分别为18．4％、23．9％和28．9％;最适温度均为70℃。生淀粉可吸附Gill,吸附率达80％。此外还测定了三种同工酶的氨基酸组成及含量。GI、GII和GIII均由一条多肽链组成。     

携多拷贝glaA的重组黑曲霉过量合成糖化酶的研究

以工业生产菌株黑曲霉CICIM F0410基因组DNA为模板,扩增出糖化酶glaA基因,测序并进行表达研究。GlaA基因的核苷酸序列长为2167 bp,包含4个内含子。氨基酸序列比对表明此黑曲霉糖化酶与其他曲霉属来源的糖化酶有很高的同源性。将glaA基因克隆到pBC-Hygro载体中,构建重组质粒pBC-Hygro-glaA并转化A. nigerF0410。携多拷贝glaA的转化子用150μg/mL潮霉素抗性筛选并通过荧光实时定量PCR鉴定。结果表明,在染色体整合2～3倍糖化酶基因对糖化酶的过量合成是适宜的,有助于提高糖化酶活力。对转化子进行摇瓶发酵研究,发酵终止时转化子GB0506的糖化酶活力比出发菌株F0410提高了17.5%。因此,增加黑曲霉染色体糖化酶基因的拷贝数可以显著提高糖化酶活力。     

产糖化酶黑曲霉的固定化研究

采用多孔聚酯材料作为固定化载体,考察并比较了载体吸附固定化黑曲霉菌丝细胞的条件,当菌丝体细胞与载体预培养的条件为pH值5.0、孢子浓度为105个/ml、固液比为1/75时,有利于菌丝体的生长、吸附固定及发酵产酶.在产糖化酶的发酵过程中,与游离菌丝体细胞相比,发酵过程持续产酶时间有一定程度的延长,产糖化酶活力始终高于游离菌丝体.     

蓝光诱导促进黑曲霉产糖化酶的研究

考察了蓝光对黑曲霉产糖化酶的影响并采用扫描电镜观察蓝光下黑曲霉形态发育过程,结果表明,与黑暗对照组相比,蓝光处理使菌丝粗壮,孢囊增大,分生孢子发育提前,黑曲霉糖化酶活力增加,孢子发育和产糖化酶的进程有一定的对应性。黑曲霉在黑暗下生长至36h时,经蓝光诱导糖化酶产量提高更为明显,提示了黑曲霉存在一个对蓝光反应产生最适光感应的发育阶段,对于光调节黑曲霉产糖化酶来说,蓝光诱导的光强由弱到强,比持续蓝光培养或采用较高光强诱导效果更好,表明黑曲霉产糖化酶存在一种光适应机制,能够感应和适应光强度变化,调节其自身代谢。从抑制性扣除杂交实验和蓝光光强变化对差异基因表达的分析来看,糖化酶基因以及呼吸链中部分氧化还原酶基因在蓝光诱导下表达皆有增强,蓝光信号转导影响了核基因编码的线粒体呼吸链相关酶基因表达水平,交替氧化酶可能参与了蓝光信号途径,影响了黑曲霉产糖化酶和孢子发育。研究结果可为在现有水平上应用蓝光调节提高糖化酶产量找到新的技术突破口和提供新思路。     

黑曲霉糖化酶高产株糖化酶cDNA的合成、克隆和序列分析

从黑曲霉糖化酶高产株T21分离总Poly(A)⁺RNA,经反转录合成cDNA,建立cDNA库。以糖化酶基因片段为探针从cDNA库进行筛选,阳性率达1．6％。由限制酶酶切图谱确定30％的阳性克隆携带全长的糖化酶cDNA。序列分析结果表明,菌株T21虽经多次诱变获得,但糖化酶基因编码区序列与文献报道的黑曲霉糖化酶基因编码区序列一致。从菌株T2l构建的cDNA库中含糖化酶cDNA插入片段的克隆的高比率充分证明,菌株T21中稳态糖化酶mRNA含量很高,显然这是突变株T21糖化酶高产的重要原因之一。     

黑曲霉(Aspergillus niger)纤维素酶系中内切β-葡聚糖酶性质的研究

对黑曲霉菌株W 25纤维素酶系中内切β-葡聚糖酶组分(1-2a、1-2b．1-2C、1—2d,I a．I b、Ia)的性质进行了研究。1-2a、1-2b、1-2c、1-2d、l a,1b和1a的最适pH分别为5．5、5．5、5 0、5．5、5．0、5．5和5．5;均在pH2．0～7．0之间稳定;最适温度分别为50、50、55、55、55和60(;保温1小时的半失活温度分别为49、61、63、52、57、47和67C。SDS-凝胶电泳法测得1-2a、1-2b、1-2c、1-2d、I a、Ib和Iia的分子量分别为53 000、48 000、57 000、60 000、44500、48 000和34 000。聚丙烯酰胺等电聚焦法测得其等电点分别为5．5、5．3、5．0、4．8、5．8、5．1和4．1。比较它们对羧甲基纤维素钠(CMC—Na)的糖化力及液化力表明,在作用方式的随机性上I-2b>I-a>I-2a>I-2e>-a>I-2d>Ib。在所测定的化学试剂中,Cu2+、Ag+和Hg2+对酶均确较强的抑制作用。     

黑曲霉变异株UV-11-48的选育及产糖化酶条件的研究

以黑曲霉(Aspergillus niger)变异株UV-11为出发菌株,经亚硝基胍多次诱变,获得一株比亲株产糖化酶活力提高30%左右的变异株UV-11-48。对UV-11-48菌株进行了发酵条件及酶系组成等的研究。固体曲生产性试验,种曲糖化酶活力最高达12240u/g,麸曲酶活力平均8000—9000u/g,最高达11700u/g,在酿酒工业固体曲生产中,取得明显经济效益。     

黑曲霉S4生淀粉糖化酶的分离纯化及其特性

用酒精沉淀、Sephadex G—100凝胶过滤和离子交换柱层析等步骤对黑曲霉(Aspergillusniger)S4的生淀粉糖化酶进行了分离,纯化出三个电泳纯组分(GI、GII和GIII),纯化倍数分别为5.4、6.0和1.9;酶活收率分别为10．2％、10．7％和1．9％。三个组分均为酸性糖蛋白,其糖含量分别为11．68％、8．6％和3．6％;pl值分别为4．0、3．9和3．6;分手量分别为1380 00、62000和57500。 通过对这三个组分的性质和它们对生淀粉作用副Vmax／K。值的测定,探讨了生淀粉糖化酶的作用机理。     

黑曲霉糖化酶基因表达调控的研究：Ⅱ.A.niger T21和3.795glaA基因 …

对糖化酶高产菌株Ａ．ｎｉｇｅｒＴ２１和原始菌株Ａ．ｎｉｇｅｒ３．７９５和ｇｌａＡ５′上游区的序列分析证明,两者在１．５ｋｂ的区域内有９个部位的碱基不同。为考察这些碱基差异是否是引起Ｔ２１ｇｌａＡ基因转录水平提高的原因,构建了以Ｔ２１和３．７９５ａｌａＡ基因转录调控区及Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｔｒｐＣ基因终止子为表达元件的Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｐｈ基因表达载体（ｐＸＨ１２和ｐＧＨ１）,用ｐＸＨ２和ｐＧＨ１分     

黑曲霉T21 glaA 5′上游调控区DNA与蛋白因子的相互作用分析

以糖化酶生产菌株黑曲霉T21(Aspergillus niger T21)的糖化酶基因(glaA)5′cis调控区片段为探针, 采用电泳迁移率变动分析(EMSA)法,从黑曲霉蛋白粗提液中检测到与glaA 5′调控区特异结合的蛋白因子,并把其结合DNA定位在T21 glaA 5′调控区的-374~ -344,-484~-414以及-580~-540 bp 3个区段, 且此3个结合DNA的片段在EMSA实验中呈现交叉竞争, 表明这3个DNA区段可与同一个蛋白因子相结合. 以-374~-344 bp序列为探针的紫外交联实验表明, 该蛋白因子的分子量(或亚基分子量)约为10 ku. 利用DNaseⅠ足印分析确定了此蛋白因子在前两个区段的精细结合部位, 并对其结合序列的特性进行了分析.     

蓝光促进黑曲霉分生孢子发育和产糖化酶的研究

以黑暗为对照 ,研究了不同光质对黑曲霉产糖化酶及生长发育的影响。持续蓝光作用下 ,孢子萌发后菌丝较粗 ,菌丝细胞顶端膨大显著 ,菌丝细胞膜的通透性增加 ,残糖消耗快 ,孢子和孢子穗增大。在 3(4d时 ,蓝光下菌丝产糖化酶活力最高达 6 6 0 (30U mL ,比黑暗高出了 15. 4 % ,生物量增加了 4 9. 4 8% ,菌丝细胞可溶性蛋白含量提高了10 0. 5 6 % ,尤其是在开始产孢子的阶段 ,蓝光下黑曲霉产糖化酶活力、生物量有很大提高。研究表明 ,蓝光明显促进黑曲霉分生孢子发育和产孢阶段包括糖化酶在内的多种淀粉酶活力的迅速增加。     

黑曲霉糖化酶基因启动子区的克隆及其功能测定

利用PCR技术,以黑曲霉糖化酶高产株T21的基因组DNA为模板合成了糖化酶基因5＇端上游850bp的非编码区,并作了序列测定。将该合成片段与细菌潮霉素磷酸转移酶结构基因融合建成表达质粒,转化黑曲霉,获得了高潮霉素抗性转化子,证实该合成片段具有丝状真菌启动子功能。抗性转化子的Southern分析表明,潮霉素磷酸转移酶基因已整合到受体黑曲霉的基因组DNA中。     

黑曲霉糖化酶基因表达调控的研究 Ⅰ.高产及低产菌株糖化酶表达的总体分析和比较

对黑曲霉(Aspergillus niger)高产菌株T21和原始菌株3.795糖化酶的基因表达从菌体生长、酶形成动力学、glaA基因拷贝数、糖化酶mRNA含量及其稳定性等多个方面进行了分析和比较。T21和3.795糖化酶的大量产生均自菌体生长的静止期开始。培养72h后,两者的菌体浓度相同,但T2l产生的糖化酶量为3.795的10～17倍,说明糖化酶产量的差异不是因生物量或酶起始合成期不同引起的,而是由于细胞内酶表达量不同引起的。Northern杂交显示T21总RNA中糖化酶mRNA含量为3.795的4.3～4.4倍.两菌株glaA基因拷贝数及糖化酶mRNA的稳定性分析结果排除了这两个因素的影响,因此T21糖化酶mRNA含量的增加主要是glaA基因转录水平提高的结果。T21与3.795之间糖化酶水平差异(10～17倍)与糖化酶mRNA水平差异(4.3～4.4倍)的不一致性,提示T21和3.795之间除转录水平外可能还存在着翻译水平上的差异(2～4倍)。此外,T21和3.795均存在着对糖化酶基因表达的碳源调控机制,根据两者在淀粉、麦芽糖和葡萄糖培养条件下所产生的mRNA比均为4:3:2,可以认为,这种调控作用发生在转录水平上,并且具有相同的调控方式。     

黑曲霉糖化酶基因表达调控的研究 Ⅰ.高产及低产菌株糖化酶表达的总体分析和比较

对黑曲霉(Aspergillus niger)高产菌株T21和原始菌株3.795糖化酶的基因表达从菌体生长、酶形成动力学、glaA基因拷贝数、糖化酶mRNA含量及其稳定性等多个方面进行了分析和比较。T21和3.795糖化酶的大量产生均自菌体生长的静止期开始。培养72h后,两者的菌体浓度相同,但T2l产生的糖化酶量为3.795的10～17倍,说明糖化酶产量的差异不是因生物量或酶起始合成期不同引起的,而是由于细胞内酶表达量不同引起的。Northern杂交显示T21总RNA中糖化酶mRNA含量为3.795的4.3～4.4倍.两菌株glaA基因拷贝数及糖化酶mRNA的稳定性分析结果排除了这两个因素的影响,因此T21糖化酶mRNA含量的增加主要是glaA基因转录水平提高的结果。T21与3.795之间糖化酶水平差异(10～17倍)与糖化酶mRNA水平差异(4.3～4.4倍)的不一致性,提示T21和3.795之间除转录水平外可能还存在着翻译水平上的差异(2～4倍)。此外,T21和3.795均存在着对糖化酶基因表达的碳源调控机制,根据两者在淀粉、麦芽糖和葡萄糖培养条件下所产生的mRNA比均为4:3:2,可以认为,这种调控作用…     

黑曲霉产糖化酶黑箱模型的构建和应用

利用碳限制恒化实验研究了黑曲霉生长和糖化酶生产之间的相关性,结果表明当比生长速率低于0.068 h–1时,菌体生长与产酶是相关的,当比生长速率大于0.068 h–1时,菌体生长与产酶不相关。根据恒化实验结果获得黑曲霉葡萄糖底物消耗的Monod动力学模型,并结合葡萄糖和氧消耗的Herbert-Pirt方程和产物形成的Luedeking-Piret方程构建黑曲霉产糖化酶的黑箱模型。应用该模型设计指数补料分批发酵实验控制菌体比生长速率在0.05 h–1,使糖化酶的得率最高达到0.127 g糖化酶/g葡萄糖,并成功地使用模型描述了黑曲霉产糖化酶的发酵过程。实验值和模拟值进行比较表现出很好的适用性,表明黑箱模型可以用于指导黑曲霉产糖化酶发酵过程的设计和优化。     

黑曲霉糖化酶cis调控区上两个CCAAT框协同参与基因启动子的转录激活作用

已报道的EMSA和Footprinting试验表明黑曲霉Aspergillus niger T21糖化酶基因glaA启动子区−489~−414 bp及−390~−345 bp (分别简称为DC, PC)是与蛋白粗提液中同一蛋白因子结合, 并均含有CCAAT五核苷酸的序列. 对DC, PC在糖化酶表达调控中的作用进行了分析. 用CGTAA取代CCAAT, 获得突变体DCm, PCm, 两者均丧失体外结合蛋白因子的能力. 突变体的体内分析结果显示, DC和PC中任何一个发生突变或改变DC, PC在原启动子中的相对方向, 则启动子的活性下降到基础表达水平. 将多拷贝串联后的DC引入A. niger T21glaA启动子原位, 则内源糖化酶的表达和由该启动子引导的外源uidA基因的表达均发生下降, 但由构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA引导的uidA的表达不受影响, 而且EMSA结果表明不等DC拷贝的A. niger转化子中DNA结合蛋白的含量没有明显变化, 表明多拷贝DC的引入引起了调控蛋白的滴定效应. 从A. niger T21cDNA中克隆到AngHapC基因, 将AngHapC基因引入上述含多拷贝DC而糖化酶低表达的A. niger菌株, AngHapC基因的表达使糖化酶的表达量得到明显回升. 上述结果表明, DC和PC中CCAAT五核苷酸序列为蛋白因子结合所必需, 而且两者必须同时与调控蛋白结合才能发挥促进转录的作用, AngHapC为与DC区域结合的正调节蛋白.     

黑曲霉变异株SP—56在糖化酶生产工业中的应用

黑曲霉变异株ＳＰ－５６是以变异株Ｐ－１０为出发菌株,经亚硝基胍反复处理后获得的一株糖化酶高产菌株。它对各种原料（碳、氮）适应性较广,不需要玉米浆,原料来源丰富,价格低廉,用ＳＰ－５６生产糖化酶,经实验室小试和１０Ｔ发酵罐投产应用,实际使糖化酶发酵单位达到１４０００Ｕ／ｍ１以上,稳定性好,产酶速度快,工艺简单,一次投料到发酵结束不需添加任何原料。酶系较纯,每年可提高产量３００Ｔ以上,而且糖化酶质量稳定、纯度高、性能好,便于在酶制剂生产厂家推广应用。