水稻耐低温逆境研究:分子生理机制及育种展望

低温严重影响水稻的地理分布、生长发育及产量。水稻在低温逆境下会产生一系列的生理及代谢变化,如:叶绿素荧光的改变,电解质渗漏增加,活性氧、丙二醛、蔗糖、脂质过氧化物、脯氨酸等代谢物含量升高,植物内源激素ABA和GA的改变等。了解水稻在低温逆境下的生理代谢变化及低温应答分子机理对水稻耐低温性状的遗传改良具有重要的意义。本文系统总结了水稻在低温逆境下的生理代谢变化、已定位和克隆的耐低温基因/QTL,以及水稻应答低温逆境信号转导机制的最新研究进展,以期为水稻的耐低温育种提供参考。     

逆境诱导水稻谷胱甘肽合成酶基因的表达研究

用RACE方法获得了全长的水稻谷胱甘肽合成酶(GS)基因的cDNA,并命名为OsGS(GeneBankaccession No.:AY453405)。该cDNA全长1 892 bp,编码一个由540个氨基酸组成的多肽,预测其氨基端(N端)含有一段定位叶绿体的信号肽。比较水稻基因组定位结果表明OsGS基因位于水稻12号染色体短臂上,转录区全长6 321 bp,由12个外显子和11个内含子组成。通过RT-PCR对OsGS在水稻正常生长条件和逆境条件下的表达进行了研究。结果表明,在正常生长条件下,OsGS在水稻幼苗的根和叶以及抽穗期水稻的根中表达;但不在抽穗期水稻的叶、茎和幼穗中表达,这显示OsGS在水稻中的表达具有发育和组织特异性。利用抽穗期水稻的叶片为材料,经高温、干旱和重金属逆境处理后,OsGS在抽穗期叶片中的转录被诱导表达;而在盐、低温、伤害逆境下则不被诱导。在轻度和中度干旱胁迫4 h后OsGS基因可被诱导表达。外源ABA处理也能够提高OsGS的转录水平,这显示OsGS可能是依赖ABA信号途径的环境胁迫诱导基因。     

盐胁迫下OsDSR2 RNAi转基因水稻的生理特性及转录组学分析

为探究盐胁迫下OsDSR2 RNAi转基因水稻的生理特性和差异基因的表达调控,以中花11(ZH11)植株为对照,对OsDSR2 RNAi转基因水稻幼苗进行生理特性和转录组学分析,结果表明:正常条件下,ZH11和Os DSR2 RNAi转基因水稻中叶绿素含量和根部Na+/K+均显著低于ZH11,其他各项生理指标均没有显著性差异,而盐胁迫处理后,Os DSR2 RNAi转基因水稻中的叶绿素含量、可溶性糖(SS)含量、过氧化氢酶(CAT)活性与ZH11相比没有明显变化,但转基因植株中的细胞膜透性、丙二醛(MDA)含量、Na+/K+显著或极显著低于ZH11,脯氨酸(Pro)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性显著或极显著高于ZH11。Os DSR2 RNAi转基因水稻在盐胁迫前后共产生68个差异表达基因,其中有55个上调表达,13个下调表达。GO分析结果显示,差异表达基因主要富集在胁迫应激反应、分解代谢等生物学过程中。KEGG分析结果表明,差异表达基因主要参与类胡萝卜素生物合成、油菜素内酯生物合成以及表皮素,软木脂和蜡质生物合成代谢通路中,进一步通过RT-q PCR验证了Osb ZIP16、Os LEA3、RAB21等差异表达基因参与水稻的胁迫应答反应。综上,在生理层面上,Os DSR2 RNAi转基因水稻主要通过降低细胞膜透性、MDA含量和Na+/K+,增加Pro含量,提高SOD和POD活性,抑制叶绿素的降解来提高耐盐性;在分子水平上,Os DSR2主要通过脱落酸(ABA)、油菜素内酯(BR)信号通路参与调控Osb ZIP16、Os LEA3、RAB21等逆境相关基因的表达来提高苗期水稻的耐盐性,为进一步阐明Os DSR2参与调控水稻耐盐的详细分子机制奠定基础。     

百子莲脱水素基因ApY2SK2逆境应答模式及启动子调控功能研究

在百子莲胚性细胞中筛选到对超低温保存复合逆境具有积极响应的保护类蛋白脱水素(ApY_2SK_2),为探明ApY_2SK_2基因在复合逆境中的应答模式,该研究采用染色体步移技术克隆并分析了ApY_2SK_2编码基因上游1 200 bp的启动子序列。结果表明:(1)序列分析显示,该启动子含有多个与逆境和激素诱导相关的顺式调控元件;实时荧光定量PCR结果表明,ApY_2SK_2基因的表达具有组织特异性,在百子莲的叶和果中表达量较高,且在多种胁迫处理与ABA激素诱导下,其表达量显著升高。(2)成功构建了5个ApY_2SK_2启动子不同缺失片段驱动GUS基因的融合表达载体,经农杆菌转化、抗性筛选和PCR检测鉴定,获得T_3代纯和转基因拟南芥株系。(3) GUS组织化学染色结果显示,GUS基因在拟南芥幼苗全株、成年苗的叶、花和成熟果实中表达活性较强,但在未成熟果实中无明显表达;烟草瞬时表达结果显示,与对照组相比,在脱水胁迫和ABA处理下的ApY_2SK_2启动子不同缺失片段驱动GUS基因表达具有显著差异。(4)转基因拟南芥GUS活性测定结果显示,ApY_2SK_2启动子MBS元件和ABRE元件可响应干旱与渗透胁迫信号;ApY_2SK_2启动子LTR元件参与低温响应;ApY_2SK_2启动子-1 199～-262 bp区域包含多个串联的ABRE顺式调控元件(-373～-211 bp)对响应ABA信号具有主要调控作用。该研究结果揭示了ApY_2SK_2启动子的组织特异性,且启动子上的关键顺式调控元件对不同的胁迫和激素信号响应具有决定性调控作用。     

玉米钼辅助因子硫酸化酶基因启动子的克隆与功能验证

为克服组成型启动子启动外源基因过量表达引起的诸多问题,同源克隆(Mo-molybdopterin cofactor sulfurase)基因（ABA3）的启动子(ABA3s)序列,并用PlantCARE软件分析其非生物逆境应答元件, 实时定量PCR检测ABA3基因在非生物逆境诱导下的差异表达后。然后,用该启动子构建启动GUS（β-glucuronidase）基因的表达载体, 基因枪法转化玉米愈伤组织。经组织化学染色法检测其表达后, 在高渗、高盐、低温胁迫处理及ABA诱导下检测GUS酶荧光值与荧光素酶(内参)发光值的比值(GUS/LUC), 以此评价ABA3s启动子在非生物逆境胁迫下的启动活性。结果表明, ABA3基因在模拟干旱、低温、高温、高盐胁迫及ABA、乙稀诱导下差异表达, 说明该基因的启动子(ABA3s)具有非生物逆境诱导活性。序列分析表明, ABA3s启动子全长777 bp, 含有ARE、HSE、MBS、TGA、Circadian等多种非生物逆境胁迫应答元件。用ABA3s启动GUS基因构建的表达载体转化的玉米愈伤组织, 响应干旱、低温、高温、高盐胁迫等多种非生物逆境胁迫, 及ABA和乙稀诱导, GUS检测呈阳性。在8%甘露醇高渗条件下, GUS/LUC比值比空白对照高6倍。上述结果表明, ABA3s启动子具有非生物逆境诱导特性, 经进一步验证其功能后, 可用于玉米抗逆转基因研究。     

转CkLEA4基因拟南芥种子萌发期的抗逆性分析

该研究在实验室前期研究的基础上,将受脱水、盐胁迫和ABA诱导的柠条锦鸡儿CkLEA4基因转入野生型拟南芥,并利用实时荧光定量PCR从8株纯合体中筛选出3个表达量不同的株系,比较野生型和转CkLEA4基因过表达拟南芥种子在不同胁迫处理下的萌发率,以探讨CkLEA4基因在植物抵抗逆境胁迫中的功能。结果发现:(1)在不同浓度NaCl、甘露醇及ABA处理下,转CkLEA4基因过表达拟南芥种子的萌发率均高于野生型,随着NaCl、甘露醇及ABA浓度增加,各株系萌发率均降低,但野生型的萌发率下降幅度均高于3个过表达株系,并且在200mmol/L NaCl和400mmol/L甘露醇处理下,过表达株系子叶绿化率均显著高于野生型。(2)在低浓度ABA处理下,CkLEA4过表达植株子叶的绿化率也高于野生型。研究表明,柠条锦鸡儿CkLEA4基因提高了拟南芥种子萌发阶段对盐、ABA及渗透胁迫的耐受性。     

毛白杨PtoLBD12基因启动子的分离鉴定和胁迫应答模式分析

为了探究毛白杨(Populus tomentosa)LBD12基因对逆境胁迫的响应,本研究利用PCR技术从毛白杨中克隆了PtoLBD12基因的启动子序列;采用生物信息学技术对该基因启动子的顺式作用元件进行分析,并对其响应不同胁迫信号的时空表达模式进行分析;最后利用该基因启动子驱动GUS报告基因,构建了毛白杨GUS报告植株;对该转基因植株进行不同胁迫处理,GUS染色分析其启动子活性。结果表明,克隆获得的PtoLBD12基因启动子具有多种顺式作用元件,包括大量的光响应元件、防御和应激响应元件(TC-rich repeats)、脱落酸(ABA)响应元件、茉莉酸甲酯(MeJA)响应元件、生长素(IAA)响应元件和赤霉素(GA)响应元件等。组织表达模式分析结果表明,PtoLBD12基因主要在根和茎中表达,在叶的表达较少。PtoLBD12基因对不同胁迫信号响应模式分析结果发现,毛白杨PtoLBD12基因显著受到高温、低温、ABA和IAA的诱导表达。综上,研究结果表明PtoLBD12与毛白杨响应逆境胁迫密切相关,该基因能够响应多种逆境胁迫信号。本研究为深入阐明PtoLBD12基因调控毛白杨逆境胁迫响...     

植物耐冷性分子机理的研究进展

近年来对植物耐冷性分子机理的研究不断深入。主要体现在以下4个方面：植物的冷敏感性可以通过调节膜脂的不饱和脂肪酸水平得到调控,调节的途径是通过酰脂去饱和酶和甘油-3-磷酸酰基转移酶的作用;利用转基因技术在植物中超表达抗氧化酶基因,如编码SOD、APX、CAT和GR等的基因,可望提高耐冷性;植物低温逆境信号转导的研究表明,ABA不仅是重要的低温逆境信号,而且可调节冷害下基因的表达,Ca^2 是一个主要的第二信使,蛋白激酶途径也参与了植物冷害的信号转导;低温诱导的蛋白或酶类主要有脱水蛋白和热稳定蛋白。     

内源ABA信号水平动态调控的分子机制

从逆境信号感知、ABA合成的触发到ABA水平的动态调控, 是细胞内重要的逆境信号传导途径, 相对于应答ABA的下游信号事件, 该领域研究滞后。研究显示, 根系中ZEP、限速酶NCED、AtRGS1等合成酶基因及ABA2基因响应胁迫反应上调ABA信号水平。而7′-, 8′-, 9′-hydroxylase和糖基转移酶基因受逆境诱导激活, 负调节ABA的积累。同时, 提高的内源ABA信号水平能激活合成酶基因和代谢酶基因的表达。此外, 基因表达和源库动力学分析显示, 叶片ABA动态库的维持依赖根源ABA的持续供应。值得一提的是, miRNA与ABA信号起源及动态水平维持有关。进一步的代谢动力学分析揭示, ABA信号水平受合成酶基因和代谢酶基因表达的协同控制, 多因素共同参与内源ABA信号水平的动态调控。     

内源ABA信号水平动态调控的分子机制

从逆境信号感知、ABA合成的触发到ABA水平的动态调控,是细胞内重要的逆境信号传导途径,相对于应答ABA的下游信号事件,该领域研究滞后。研究显示,根系中ZEP、限速酶NCED、AtRGS1等合成酶基因及ABA2基因响应胁迫反应上调ABA信号水平。而7′-,8′-,9′-hydroxylase和糖基转移酶基因受逆境诱导激活,负调节ABA的积累。同时,提高的内源ABA信号水平能激活合成酶基因和代谢酶基因的表达。此外,基因表达和源库动力学分析显示,叶片ABA动态库的维持依赖根源ABA的持续供应。值得一提的是,miRNA与ABA信号起源及动态水平维持有关。进一步的代谢动力学分析揭示,ABA信号水平受合成酶基因和代谢酶基因表达的协同控制,多因素共同参与内源ABA信号水平的动态调控。     

非生物逆境胁迫下ZmCIPK10基因表达分析

干旱、高盐、低温、高温等非生物逆境严重影响植物的生长发育,研究参与逆境胁迫应答基因具有重要的理论意义和应用价值。从玉米中克隆了一个CIPK蛋白激酶基因,暂时命名为ZmCIPK10。该基因全长2 730 bp,转录长度2 100 bp,编码438个氨基酸。顺式元件分析发现在基因启动子区域存在ABRE、HSE、TC-rich repeats等推测的逆境顺势元件。荧光实时定量PCR结果表明ZmCIPK10在干旱、低温、盐胁迫下表达量上调,在ABA、高温胁迫下表达量下调。研究结果初步证实ZmCIPK10基因响应非生物逆境胁迫,为ZmCIPK10参与植物逆境信号途径及其功能研究提供理论依据。     

过表达SmERF1提高了丹参耐盐性

ERF(ethylene-responsive factor)蛋白是植物中一大类转录因子家族,在植物的生长发育及逆境胁迫中发挥着重要作用.为研究丹参中新的转录因子SmERF1的功能,本研究对其编码序列、表达模式进行分析,并在丹参中进行过表达,检测过表达后转基因植株耐盐性、次生代谢物和激素的变化.研究结果表明,SmERF1含有一个AP2结构域,是典型的ERF转录因子.SmERF1受到MeJA和酵母诱导子(YE)的诱导表达.在盐胁迫下,过表达SmERF1的丹参株系中脯氨酸含量、SOD和POD活性较野生型丹参植株高,MDA含量降低,说明转基因株系的抗盐特性增强.而且过表达SmERF1的丹参株系中ABA含量升高,GA含量降低;过表达SmERF1对丹参酮、丹酚酸等代谢物的合成调控效果不强.综合以上结果,表明SmERF1可能通过调节ABA的合成,提高了丹参耐盐性.     

植物耐冷性分子机理的研究进展

近年来对植物耐冷性分子机理的研究不断深入。主要体现在以下4个方面：植物的冷敏感性可以通过调节膜脂的不饱和脂肪酸水平得到调控,调节的途径是通过酰脂去饱和酶和甘油-3-磷酸酰基转移酶的作用;利用转基因技术在植物中超表达抗氧化酶基因,如编码SOD、 APX、CAT和GR等的基因,可望提高耐冷性;植物低温逆境信号转导的研究表明,ABA不仅是重要的低温逆境信号,而且可调节冷害下基因的表达,Ca2+是一个主要的第二信使,蛋白激酶途径也参与了植物冷害的信号转导;低温诱导的蛋白或酶类主要有脱水蛋白和热稳定蛋白。     

苹果SRS基因家族的鉴定与功能分析北大核心CSCD

SHI-related sequence(SRS)基因家族通过介导激素变化以调控植物成花及生长发育,并且在适应环境胁迫中起重要调控作用。该研究基于苹果(Malus domestica Borkh.)基因组数据,通过生物信息学手段鉴定苹果SRS基因家族成员,并分析SRS基因家族特点与功能及表达情况。结果表明:(1)苹果MdSRS基因家族共包含11个成员,分别命名为MdSRS1-MdSRS11,不均匀地分布在苹果的9条染色体上。(2)MdSRS蛋白包含229~414个不等的氨基酸残基,等电点分布在6.38~9.36之间;亚细胞定位结果表明,MdSRS蛋白大多分布于细胞膜,在细胞核、叶绿体中也有分布。(3)通过引入拟南芥、水稻、番茄及杨树的SRS基因进行系统发育分析表明,将11个MdSRSs分成5个亚族(A-A),在A4中分布最多。(4)顺式作用元件分析表明,11个MdSRSs启动子上游2 000 bp序列分布有激素、环境适应性和逆境诱导等响应元件。(5)荧光定量PCR结果显示,苹果MdSRS基因家族在盐胁迫和干旱胁迫下总体呈下调表达,在ABA胁迫后大多呈上调表达,是具有很大潜力的抗性候选基因,说明SRS家族对ABA调节等非生物胁迫具有调控作用。研究认为,SRS家族的11个成员均参与了调控干旱、盐及ABA胁迫多种逆境的响应,推测在实际苹果生产中对抵御不良环境具有重要作用。     

水稻OsPR10A的表达特征及其在干旱胁迫应答过程中的功能

利用免疫印迹(WB)分析了水稻(Oryza sativa) OsPR10A在其不同生长时期、不同组织部位及多种非生物逆境胁迫下的表达特征, 发现OsPR10A在干旱、盐胁迫以及茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)诱导下表达量明显升高, 表明该蛋白可能在干旱和盐胁迫应答过程中发挥作用。为证明这一推测, 我们构建了OsPR10A超表达载体, 经农杆菌介导转化水稻, 获得超表达OsPR10A的纯合株系。田间表型观察表明, 转基因株系株高变矮、穗长变短、结实率降低。用20% PEG6000在水稻种子萌发过程中进行干旱处理, 结果显示, OsPR10A超表达株系的根长和芽长均显著高于野生型, 证明超表达OsPR10A可增强水稻萌发期耐旱性。该研究有助于增进人们对水稻OsPR10A功能的了解。     

水稻OsPR10A的表达特征及其在干旱胁迫应答过程中的功能

利用免疫印迹(WB)分析了水稻(Oryza sativa) OsPR10A在其不同生长时期、不同组织部位及多种非生物逆境胁迫下的表达特征, 发现OsPR10A在干旱、盐胁迫以及茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)诱导下表达量明显升高, 表明该蛋白可能在干旱和盐胁迫应答过程中发挥作用。为证明这一推测, 我们构建了OsPR10A超表达载体, 经农杆菌介导转化水稻, 获得超表达OsPR10A的纯合株系。田间表型观察表明, 转基因株系株高变矮、穗长变短、结实率降低。用20% PEG6000在水稻种子萌发过程中进行干旱处理, 结果显示, OsPR10A超表达株系的根长和芽长均显著高于野生型, 证明超表达OsPR10A可增强水稻萌发期耐旱性。该研究有助于增进人们对水稻OsPR10A功能的了解。     

PLC/PLD抑制剂对盐胁迫下玉米幼苗根系新的69.5kD热稳定蛋白表达调控的影响

逆境蛋白在植物抵抗逆境胁迫中具有重要作用。广泛存在于植物中的磷脂酶 (PhospholipaseC/D, PLC/PLD) 是一种逆境信号传递物质, 在逆境蛋白的诱导表达中具有重要意义。该文探讨了不同胁迫及PLC/PLD抑制剂处理后一种新发现的 6 9.5kD热稳定蛋白的表达情况, 为进一步研究PLC/PLD在逆境蛋白表达中的作用机理提供依据。以玉米 (Zeamays) ‘鲁单 90 0 2’幼苗为材料, 用 2 70mmol·L-1NaCl胁迫处理, 然后进行SDS _PAGE (Sodiumdo decylsulfate_Polyacrylamidegelelectrophoresis) 电泳, 从受胁迫的玉米幼苗根系中分离出一种新的 6 9.5kD热稳定蛋白, 其表达量随胁迫时间的延长逐渐增加。该蛋白在恢复正常条件后仍然表达, 表明其可能是一种胁迫适应性蛋白 ;2 0 μmol·L-1ABA处理也能引起该蛋白的表达, 但表达量远低于同期的 2 70mmol·L-1NaCl胁迫处理。NaCl+ABA处理后该蛋白表达量低于NaCl处理, 但高于ABA处理。PLC/PLD抑制剂硫酸新霉素 (Neomycinsulfate, NS) 和正丁醇 (n _Butylalcohol, BA) 对NaCl、ABA和NaCl+ABA诱导的 6 9.5kD热稳定蛋白表达均有明显的抑制作用, 且对ABA和NaCl+ABA两个处理蛋白表达的抑制作用均随抑制剂浓度升高或处理时间延长而逐渐增强, 但对NaCl处理蛋白表达的抑制作用则表现出复杂性。结果表明, 不同处理诱导 6 9.5kD热稳定蛋白表达的敏感程度不同, 而磷脂酶在不同处理诱导的信号传递途径中的作用机理有一定的差别。     

从水分胁迫的识别到ABA积累的细胞信号转导

由于植物在生长和发育过程中不可避免地要遭受各种环境胁迫的影响 ,植物只有通过对环境胁迫的快速感知和主动反应才得以生存和发展。植物这种对环境胁迫的快速感知和主动反应体现在环境胁迫下植物可以通过一系列基因的表达调控来实现各种抗逆的生理生化反应。虽然得以鉴定的水分胁迫应答基因越来越多 ,但其中只有极少的基因在抗逆中的基本功能已得到初步认识。从细胞对水分胁迫原初信号的感知到基因表达调控包括了一系列复杂的细胞逆境信息传递过程。脱落酸 (abscisicacid ,ABA)作为重要的细胞逆境信号物质介导了一系列基因表达 ,因此从细胞对水分胁迫原初信号的感知到编码ABA生物合成关键酶基因的表达是一条最为关键的细胞逆境信息传递途径。逆境应答基因功能的鉴定以及对整个细胞信号传递过程中详尽的分子机制的了解无疑是今后最有趣的也是最为重要的研究课题。     

从水分胁迫的识别到ABA积累的细胞信号转导

由于植物在生长和发育过程中不可避免地要遭受各种环境胁迫的影响,植物只有通过对环境胁迫的快速感知和主动反应才得以生存和发展.植物这种对环境胁迫的快速感知和主动反应体现在环境胁迫下植物可以通过一系列基因的表达调控来实现各种抗逆的生理生化反应.虽然得以鉴定的水分胁迫应答基因越来越多,但其中只有极少的基因在抗逆中的基本功能已得到初步认识.从细胞对水分胁迫原初信号的感知到基因表达调控包括了一系列复杂的细胞逆境信息传递过程.脱落酸(abscisic acid, ABA)作为重要的细胞逆境信号物质介导了一系列基因表达,因此从细胞对水分胁迫原初信号的感知到编码ABA生物合成关键酶基因的表达是一条最为关键的细胞逆境信息传递途径.逆境应答基因功能的鉴定以及对整个细胞信号传递过程中详尽的分子机制的了解无疑是今后最有趣的也是最为重要的研究课题.     

丹参抗性基因SmORA1的克隆及诱导表达分析

该研究采用PCR方法从丹参中克隆出一条乙烯应答因子结合蛋白(ERF)转录因子编码基因,命名为SmORA1,GenBank登录号为KT359598。经分析发现该基因全长648bp,不包含内含子,编码206个氨基酸残基。编码蛋白SmORA1含有典型的AP2结合结构域。表达分析结果表明,SmORA1主要在丹参根中表达,且该基因的表达明显受到茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、机械创伤和病原菌等逆境信号的诱导,但低温和脱水情况下SmORA1表达下调。研究表明,SmORA1参与丹参生物胁迫反应,可整合JA、ABA、ET和病原菌等胁迫信号途径。