缺失Kunitz胰蛋白酶抑制剂和脂肪氧化酶2.3的大豆新品种——中黄16的选育

大豆新品种中黄16（原名中作96－952）,是中国农业科学院作物育种栽培研究所利用缺失Kunitz胰蛋白酶抑制剂的高产、优质,抗花叶病毒病（SMV）的高代材料ti15176作母本,美国引进优良品种Century近等基因系,脂肪氧化酶缺失的优质材料Century-2.3作父本进行有性杂交,采用未变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）技术及等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF－PAGE）技术,对杂种代胰蛋白酶抑制剂（Ti)、脂肪氧化酶（Lox)进行缺失检测及多年辅助选择育成,该品种于1999－2000年参加北京市夏播大豆区域试验,2001年参加北京市夏播大豆生产试验,2002年4月通过北京市品种审定委员会审定。其出特点是高产,稳产,优质（蛋脂双高、蛋白质含量高且蛋白质品质优异－－缺失Ti和Lox2.3),抗花叶病毒病,综合性状优异,是国内第一个缺失Kunitz胰蛋白酶抑制剂且缺失脂肪氧化酶2．3的三缺（Lox2.3,ti）优质大豆新品种。     

大豆脂肪氧化酶同工酶全缺失种质的创新

大豆脂肪氧化酶(Lipoxygenase,Lox)是豆腥味因子。利用脂肪氧化酶双缺失的优质大豆新品系96P17(Lox-2.3)作母本,93704(Lox-1．3)作父本进行有性杂交,采用等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF—PAGE)技术,对杂种后代脂肪氧化酶3种同T酶进行缺失检测及多年辅助选择,创造大豆脂肪氧化酶3种同工酶全缺失(Lox-1．2．3)的大豆优质新种质,为大豆品质育种及食品加工提供优异的种质材料。     

无腥味大豆种质创新与利用

大豆是植物油和植物蛋白的主要来源,但大豆蛋白中含有3种结构不同的脂肪氧化酶同功酶,是产生豆腥味的根源,使大豆利用及加工受到限制。从1994年开始我们进行大豆脂氧酶缺失基因的转育与种质创新研究,目前获得了一批综合农艺性状优良的低腥味材料,其中绥无腥豆1号已于2002年3月通过黑龙江省农作物品种审定委员会审定,并开始应用于生产和加工领域。     

萌发绿豆种子中的一种大豆胰蛋白酶抑制剂钝化酶

通过 30 %～ 6 0 % (NH4 ) 2 SO4 分级沉淀、DEAE_SepharoseCL_6B离子交换层析、SephacrylS_2 0 0凝胶过滤层析和WatersAP_1离子交换层析 ,从萌发的绿豆 (Vignarabiata (L .)Wilczek)种子中分离纯化出一种可降解大豆胰蛋白酶抑制剂 (STI)的蛋白酶。SDS_PAGE测定该酶的分子量为 2 9.8kD。该酶催化降解STI的Km 值为 76 9.2BAEE/mL ,Vmax为 115 .3BAEE·mL-1·min-1。该酶在 5 0℃、pH 8.0、相对酶活力 5 0 0 0BAEE/mL和 4h的反应时间时可将脱脂大豆粉中的STI活性钝化 90 .91%。该酶在温度低于 5 0℃及pH 6 .5～ 8.5时能保持其活性。     

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的分离及其在抗虫植物基因工程中的 …

大豆Ｋｕｎｉｚ型胰蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有抗虫特性。从未成熟的大豆子叶中提取总ＲＮＡ,然后转录成单链ｃＤＮＡ,以此为模板,用ＰＣＲ方法扩增出大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂基因,并克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ的ＳｍａⅠ位点上。序列分析表明：克隆片段大小为６６３ｂｐ,包含了基因完整的编码序列。     

无腥味大豆种质创新与利用

大豆是植物油和植物蛋白的主要来源,但大豆蛋白中含有3种结构不同的脂肪氧化酶同功酶,是产生豆腥味的根源,使大豆利用及加工受到限制。从1994年开始我们进行大豆脂氧酶缺失基因的转育与种质创新研究,目前获得了一批综合农艺性状优良的低腥味材料,其中绥无腥豆1号已于2002年3月通过黑龙江省农作物品种审定委员会审定,并开始应用于生产和加工领域。     

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的分离及其在抗虫植物基因工程中的应用

大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有抗虫特性。从未成熟的大豆（ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＬ．）子叶中提取总ＲＮＡ,然后反转录成单链ｃＤＮＡ,以此为模板,用ＰＣＲ方法扩增出大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂基因,并克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）的ＳｍａⅠ位点上。序列分析表明：克隆片段大小为６６３ｂｐ,包含了基因完整的编码序列。编码多肽由２１７个氨基酸组成,其中包括Ｎ端２５个氨基酸组成的信号肽序列,１８１个氨基酸组成的成熟蛋白序列和Ｃ端１１个氨基酸组成的液泡定位信号序列。构建了此基因的一系列植物表达载体,用于烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）、水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）、棉花（ＧｏｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍＬ．）等作物的转化。利用棉铃虫（ＨｅｌｉｏｔｈｉｓａｒｍｉｇｅｒａＨｕｂｎｅｒ）对经ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ杂交验证获得的转基因烟草进行了抗虫测试,结果表明,转基因烟草和对照烟草相比,具有明显的抗虫能力。     

大豆胰蛋白酶抑制剂对棉铃虫幼虫消化生理和生长发育的影响

本研究根据棉铃虫Helicotverpa ormigera(Hubner)幼虫中肠蛋白酶在离体条件下对蛋白酶抑制剂的反应,选择具有较强抑制作用的大豆胰蛋白酶抑制剂,以0.21-4.2%(干重)的浓度配入幼虫人工饲料,测定了幼虫短期和长期取食这些饲料引起的中肠类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和总蛋白酶活力的变化和生长抑制效应。短期取食抑制剂的幼虫,中肠弱碱性类胰蛋白酶活力显著增高,在4.2%。浓度下比对照高出21%;强碱性类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和总蛋白酶活力显著降低,生长发育受到明显抑制。长期取食低浓度(0.84%)抑制剂的幼虫,弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活力显著增高,强碱性类胰蛋白酶活力显著降低。总蛋白酶活力变化不显著;长期取食高浓度(4.2%)抑制剂的幼虫,强碱性类胰蛋白酶和总蛋白酶活力显著降低,其它酶活力变化不显著。抑制剂随浓度的增高对幼虫生长的抑制作用加强,但浓度高于0.84%后,抑制强度的变化减小。据此作者认为,蛋白酶抑制剂对昆虫抗营养效应在于它对蛋白酶的激活和抑制作用,从而导致各种蛋白酶间的协调性破坏,昆虫消化过程受阻,影响生长发育。     

2002年我国大豆(Glycine max)品种及种质资源的蛋白质和脂肪含量分析

对2002年全国14个主要大豆种植省(区)的大豆品种及其种质资源的蛋白质、脂肪含量进行了分析。结果表明,种质资源的蛋白质、脂肪平均含量均高于生产用品种。其中种质资源脂肪含量的变化幅度较大,显示了在未来的育种中更强的高脂肪含量的选择优势。国内种质资源蛋白质平均含量高于国外种质资源。国外种质资源脂肪含量总体上高于国内种质资源。黄淮海生态区品种蛋白质平均含量高于北方生态区品种。新育成黄淮海区域试验品种蛋白质平均含量高于目前黄淮海生态区生产用品种。同品种异地种植,其脂肪含量有明显变化。     

大豆脂肪氧化同工酶(Lox1)单克隆抗体的制备

利用薄层等电聚焦电泳检测缺失大豆脂氧酶近等基因系-Su系列,将标记不同缺失类型种子经脱脂、干燥、浸提、离心后制成样品,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和电泳洗脱仪回收获得蛋白。间接ELISA测定Lox1免疫血清效价为1∶1600,免疫BALB/C小鼠的脾细胞和达到对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞融合培养,筛选杂交瘤细胞的阳性克隆,应用有限稀释法和交叉分析,获得3株能稳定传代且分泌Lox1单克隆抗体的、与其他Lox类型没有交叉反应的杂交瘤细胞,各株单抗的效价均在1∶64以上。大豆脂肪氧化同工酶Lox1单克隆抗体用于检测脂氧酶的缺失类型,可为辅助育种提供投资少、见效快的鉴定方法,可为研制大豆脂肪氧化同工酶检测试剂盒提供实验基础。     

A Proteinase from Mung Bean Sprouts That Inactivaties Soybean Trypsin Inhibitor (in English)

By 30%-60% (NH4)2SO4 fractional precipitation, anion-exchange chromatography on DEAE-Sepharose CL-6B, gel filtration on Sephacryl S-200 and anion-exchange chromatography on Waters AP-1 column (ProteinPM-Pak DEAE 15HR), a proteinase which can inactivate soybean trypsin inhibitor (STI) was purified from mung bean (Vigna rabiata (L.) Wilczek) sprouts. Its molecular weight was estimated to be 29.8 kD by SDS-PAGE, and its Km and Vmax for STI were 769.2N-α-benzoyl-L-arginine ethyl ester BAEE/mL and 115.3 BAEE·mL-1·min-1 respectively. This proteinase was stable at temperatures lower than 50℃ and pH 6.5-8.5, and 90.91% STI activity of defatted soybean powder was inactivated by this preparation, with proteolytic activity 5 000 BAEE/mL at 50℃ and pH 8.0 in 4 h.     

萌发绿豆中水解大豆胰蛋白酶抑制子蛋白酶的纯化及固定化

大豆是豆类植物中最早发现存在蛋白酶抑制子的 ,由于其存在影响了豆类的利用价值 ,因此研究人员一直在寻找着解决办法。采用加热处理方法不能彻底钝化豆类蛋白的蛋白酶抑制子活性 ,且豆类蛋白的含硫氨基酸主要存在于各类蛋白酶抑制子中 ,从豆类蛋白中除去抑制子蛋白将大大降低其营养效价。本研究的目的是试图寻找一种可在常温下降解豆类胰蛋白酶抑制子的蛋白酶 ,从而钝化豆类的胰蛋白酶抑制活性。在前期工作中 ,我们发现枯草杆菌蛋白酶 (Ｓｕｂ ｔｉｌｉｓｉｎ)可在在常温下降解花生及大豆胰蛋白酶抑制剂[1] ,近期我们的研究表明 ,Ａｌｃａ…     

黑豆种子中一种耐热型胰蛋白酶抑制剂的分离及性质表征

应用硫酸铵分级沉降、弱阳交换色谱CM-Sephadex C-50、凝胶过滤 色谱Sephacryl S-200HR、强阳离子高效液相色谱POROS HS-20,从黑豆种 子中分离纯化一种耐热型蛋白酶抑制剂,命名为TSTI.该蛋白的Ｎ末端序列 为DEYSKPCCDLCMCTRRCPPQ,与豆科植物Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂具有 高度同源性,推测其属于Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂.SDS－PAGE和IEF 测出TSTI分子量和等电点分别为23.9 kD 和6.2.TSTI对胰蛋白酶有很强的 抑制作用,当二者摩尔比达到1时,胰蛋白酶活力被完全抑制.此外,该蛋 白酶抑制剂具有很强的热稳定性和pH稳定性,在高达100 ℃温度及pH2-12 范围内处理,其活性均不会受到太大影响.TSTI对植物致病菌苹果轮纹病菌 、瓜果腐霉病菌、白菜黑斑病菌、甜瓜枯萎病菌和葡萄灰霉病菌具有抑制 作用.     

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂新类型Tid的全序列分析

大豆ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂（ＳＢＴｉＡ２）是一种大量存在于大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）中的种子贮藏蛋白．虽然对它的生化特性及结构已有较多的研究,但它在体内的主要功能仍不很清楚．国际上所发现的３个由显性等位基因Ｔｉａ、Ｔｉｂ、Ｔｉｃ编码的大豆ｋｕｎｉｔｚ胰蛋白酶抑制剂的氨基酸顺序已被明确测定,相互间有一到多个氨基酸残基的不同［１］．Ｔｉｄ是从我国１５０００余份大豆资源中筛选到的唯一一份ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂位点的新类型,遗传分析证明它是另一个ＳＢＴｉＡ２的显性等位基因［２,３］．严…     

荞麦胰蛋白酶抑制剂的原核表达及纯化

根据文献报道的荞麦胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列及本研究室先前已获得的部分基因序列设计引物,经过RT-PCR扩增,获得荞麦胰蛋白酶抑制剂编码区基因全序列.将该基因克隆到原核表达载体pQE-31中,并转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达获得可溶性目的蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的25%.该目的蛋白经Ni2 -NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE分析显示,在大约9kD处出现明显的目的条带,与预计蛋白分子量大小一致.Western blot鉴定证实,目的蛋白N端带有6个组氨酸标签.活性测定表明,目的蛋白具有专一性的胰蛋白酶抑制剂活性,抑制活性约为77U/mg纯化蛋白.本实验为进一步研究荞麦胰蛋白酶抑制剂结构与功能的关系奠定了基础.     

半夏胰蛋白酶抑制剂的纯化与部分性质研究

应用以胰蛋白酶为配体的亲和层析法,从生半夏蛋白粗提液的40％（NH。）：SO4（M／V）沉淀中分离纯化出一种胰蛋白酶抑制剂（Rhizoma pinelliae trypsin inhibitor,RVn）,经SDS．PAGE检测呈现单一条带,分子量为14kD左右,其N-端6个氨基酸残基顺序为DPVVDG。研究表明,其对胰蛋白酶的质量抑制比为l：4．72左右,对人低分化胃腺癌细胞系（BGC-823）的细胞增殖具有抑制作用,IC50值为121．53μg／mL。