肌苷产生菌枯草杆菌7171-6-1菌株的选育

本文报告由枯草杆菌(Bacillus subtilis) No．101野生型为出发菌株,经过硫酸二乙酯(Dicthyl Sulfate,DES)、8-氮杂鸟嘌呤(8-Azagnaninc,8-AG)处理获得了一株腺嘌呤、硫胺素双重营养缺陷型突变株7171-6-1,在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中,经60—72小时、30—32℃发酵,肌苷产量达11．65克／升。     

PUMA在结肠癌细胞中的表达及诱导细胞凋亡中的作用

目的:通过5-Fu诱导携带有野生型p53基因的HCT116和携带有突变性p53基因的HT-29两种结肠癌细胞系,比较两株细胞在各时间点凋亡水平和PUMA mRNA表达情况的差异,探讨PUMA对细胞凋亡的作用及诱导其表达的基本途径。方法:用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测不同结肠癌细胞株HT-29、HCT116在抗肿瘤药物5-Fu作用下不同时间点结肠癌细胞株内PUMA mRNA表达水平的差异,用吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)荧光染色检测各时间点细胞的凋亡水平,分析其与PUMAmRNA表达水平之间的关系。结果:携带有野生型P53基因的结肠癌细胞株HCT116在5-Fu作用下6h即可出现PUMA mRNA的表达,随着药物作用时间的延长其表达强度增加,并且与细胞凋亡水平呈正相关;含有突变型P53基因的结肠癌细胞株HT-29在5-Fu作用下无PUMA的表达。结论:通过5-Fu诱导细胞凋亡出现的PUMA表达需要野生型P53基因,突变型P53基因无法诱导PUMA的表达。PUMA与结肠癌细胞凋亡水平呈正相关,是一种促凋亡蛋白。     

紫外诱变筛选海洋红酵母S8的尿嘧啶缺陷型菌株

本课题组从海南天然海域筛选到一株高产类胡萝卜素的海洋红酵母菌株S8,该菌株对鱼无毒害,并与鱼共生,欲将其应用于盐诱导表达外源蛋白的海洋红酵母工程菌的构建。本研究利用紫外诱变筛选的方法处理S8菌株,通过统计其UV致死率、5-氟乳清酸致死率等筛选S8的尿嘧啶营养缺陷型突变株。研究结果表明,供试菌株通过紫外线诱变、5-氟乳清酸致死和回复突变率的实验筛选,共获得16株稳定的尿嘧啶缺陷型突变株,突变菌株在基本培养基中培养了8d仍不能生长。选择了其中的一株ST5进行了产胡萝卜素能力的测定,结果表明,在同样的培养条件下,野生型S8菌株细胞生物产量可达87.55g/L,类胡萝卜素含量可达520μg/g,突变株ST5的细胞生物产量为85.45g/L,类胡萝卜素含量为512μg/g;ST5的产胡萝卜素能力方面与野生型S8无明显差异。因此,尿嘧啶缺陷型菌株ST5可为下一步海洋红酵母工程菌的构建提供受体菌。     

酵母菌小菌落突变株酒精发酵的研究——Ⅰ.菌种的选育及其生理特性

酵母菌小菌落呼吸缺陷型突变株(Petite mutant)的研究国外已有许多报道。Bacila等证明ρ~-突变株在5L发酵罐中酒精发酵产量比野生型ρ~+约提高10%左右。我们用诱变剂对酒精工业上使用的酵母菌进行处理,得到呼吸缺陷型突变株,这些菌与氯     

地衣芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆和特性

克隆了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)谷氨酸脱氢酶基因(gdhA), 并研究其表达和功能. 发现野生型IRC-3 GDH-菌株和突变型IRC-8 GDH+菌株的gdhA基因都能互补大肠杆菌谷氨酸缺陷型菌Q100 GDH-的缺陷性状, 但突变型IRC-8 GDH+菌株的gdhA基因不能互补野生型IRC-3 GDH-菌株的谷氨酸缺陷性状. 经测序发现两者的核苷酸序列完全一致. gdhA基因在野生型IRC-3和突变型IRC-8中都能正常表达, 在野生型IRC-3细胞中未发现有抑制GDH活性的物质存在. 推测由于GDH翻译后调节的差异导致GDH表型的不同. 根据序列分析, 地衣芽孢杆菌GDH属于六聚体GDH中的家族Ⅰ, 而枯草芽孢杆菌GDH则属于家族Ⅱ, 两者间亲缘关系相距甚远.     

用人DNA介导的基因转移修复中国仓鼠细胞的HPRT缺陷

 中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)经N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱变和6-巯基鸟嘌呤(6-TG)选择,得到稳定的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)缺陷细胞株,酶活性仅为野生型的6.5％。用磷酸钙共沉淀法和电脉冲法向HPRT-细胞转移人宫颈癌细胞(HeLaS_3)基因组DNA,纠正了CHO细胞的HPRT缺陷。酶活性提高了6.9倍,达到野生型的45％。用Alu序列探针进行分子杂交,证实经过基因转移并连续传代15次以上的受体细胞中含人DNA序列。表明人的有关基因已稳定地整合到CHO细胞的染色体中。     

非编码小RNA(sraB)调控肠炎型沙门菌的抗蛋清抑菌作用

【目的】肠炎型沙门菌是一种食源性人畜共患病病原菌,可在禽蛋中存活并传播。sRNA为新近发现的基因表达调控分子,本实验以sRNA(sraB)为对象,探索sRNA与肠炎型沙门菌在禽蛋中存活的相关性,及研究其在细菌抵抗蛋清抑菌作用中的调控功能。【方法】参考已报道的沙门菌全基因组及sraB序列,设计并扩增sraB突变用基因片段,运用Red重组系统(red recombination system)对肠炎沙门菌野生株(SE2472)sraB基因进行定点敲除,构建出sraB敲除株(SE2472ΔsraB)。分析比较sraB敲除对沙门菌在蛋清中存活的影响;另构建表达sraB的回复表达质粒pHDB3-sraB,将其转入sraB敲除株构建回复株SE2472ΔsraB-comp,以回复表达sraB,分析sraB表达对沙门菌敲除株的回复作用;并分别以野生株、敲除株及回复株研究sraB在抵抗蛋清中几种抑菌因子(如溶菌酶和卵转铁蛋白)作用中可能的调控作用。【结果】敲除株在蛋清中存活率为野生型的61%-70%,回复株相比野生型的存活率比敲除株提高10%-33%;在转铁蛋白抑菌实验中,孵育8h和24h,敲除株的存活率分别为野生型存活率的38%和23%,孵育8h回复株相比野生型的存活率比敲除株提高15%,但孵育24h回复株的存活率未见提高;在溶菌酶抑菌实验中,孵育8h和24h后,敲除株存活率分别为野生型的41%和27%,回复株相比野生型的存活率分别比敲除株提高35%和23%。【结论】通过比较sraB敲除与否,研究肠炎型沙门菌在禽蛋中的存活及对抑菌因子的抵抗作用,结果表明sraB在肠炎沙门菌抵抗蛋清抑菌作用中起着重要调控功能。     

急慢性感染中B淋巴细胞应答规律比较研究的病毒工具构建

在急性或慢性等不同感染情况下B淋巴细胞应答规律各异。本研究旨在构建重组Armstrong株和重组Clone13株淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV),以诱导针对WE株糖蛋白(glycoprotein, GP)特异的B细胞受体(B cell receptor, BCR)转基因细胞KL25HL B细胞应答,从而为比较急慢性感染过程中宿主B细胞的免疫应答差异建立实验模型。首先,通过共转染细胞,使之转录LCMV基因组片段并表达病毒蛋白,成功拯救出重组LCMV-Armstrong(recombinant LCMV-Armstrong, rARM)和重组LCMV-Clone13(recombinant LCMV-Clone13,rCL13)。测序分析表明,这2种重组病毒的GP序列被成功替换为LCMV-WE株的GP序列,并证实它们在感染细胞后具备蚀斑形成能力。随后,本研究使用rARM及rCL13感染野生型C56BL/6J小鼠。结果表明,这2种重组病毒保留了野生LCMV-Armstrong(wild type LCMV-Armst...     

丙型肝炎病毒核心基因置换对病毒复制和感染影响的初步研究

本文旨在探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心(core)蛋白在病毒复制和感染中的作用,采取基因置换的方法,用HCV1b型J4株的核心基因平行置换2a型J6JFH1株的核心区,构建了FL-J6JFH/J4core嵌合复制子。体外制备RNA转录体,以脂质体介导转染Huh7.5.1肝癌细胞。转染后第5天,用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测细胞内HCVRNA水平。第8天,以丙型肝炎患者血清为一抗,免疫荧光法(IFA)检测转染细胞内HCV蛋白表达。同时收集转染后第8天的细胞上清液,感染naveHuh7.5.1肝癌细胞,72h后IFA检测HCV蛋白表达。结果显示,FL-J6JFH/J4core转染组第5天细胞内RNA水平与野生型FL-J6JFH1接近,无显著差异(n=4,P0.05)。免疫荧光检测显示,FL-J6JFH/J4core转染细胞后第8天及其上清液感染的naveHuh7.5.1细胞的HCV阳性细胞数都低于野生型。本研究结果初步表明,HCV各株间核心基因的替换会影响HCV的蛋白翻译和感染性病毒颗粒的产生与释放。     

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究

为便于枯草芽孢杆菌工业化生产应用,对Spizizen创立的枯草芽孢杆菌DNA转化方法进行改进.用GMI和GMII溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a、营养缺陷型突变株DBl342和非营养缺陷型突变株WB800,用改进的方法制备感受态细胞,用7.5kb质粒pSBPTQ进行转化,并研究RNA、酵母粉、水解酪蛋白、培养方法对枯草芽孢杆菌质粒转化的影响.结果表明,该方法适用于不同基因型枯草芽孢杆菌的质粒转化,营养缺陷型突变株DBl342的转化率为750 CFU/μg/DNA,非营养缺陷型突变株WB800转化率为1 070 CFU/xg DNA,野生型菌株BS501a转化率为270 CFU/μg/DNA.根据影响转化效率的因素,推测在该方法中,枯草芽孢杆菌质粒转化原理:一定生物量的枯草芽孢杆菌在外界营养条件和钙、镁离子作用下,细胞壁和细胞膜形成缺陷,使外源DNA转入枯草芽孢杆菌细胞内.