茶树HMG-CoA还原酶基因全长cDNA克隆及序列分析

香气是茶叶的重要品质之一,萜类物质不仅香气好,而且沸点普遍较高,是构成茶叶香气的重要物质基础,决定着茶叶的香气品质,也可作为茶叶香型划分的依据。在植物中,倍半萜、多萜醇等通过胞质中的甲瓦龙酸(MVA)途径合成。HMG-Co A还原酶(HMGR)催化HMG-Co A(3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A)生成甲瓦龙酸,是依赖MVA萜类合成途径的关键限速反应。为了有助于理解茶树萜类合成的分子遗传机制,通过RACE-PCR方法从茶树中克隆了一个编码HMG-Co A还原酶的c DNA全长序列(命名为Cs HMGR1),该序列由1 979 bp组成,包含一个1 722 bp的完整开放阅读框,编码573个氨基酸。其推定的编码蛋白与橡胶树、旱莲木、人参、荔枝、西洋参、丹参、罗汉果及龙眼的同源蛋白具有80%~82%的序列一致性。利用Cs HMGR1和其它物种HMGR同源蛋白的催化区域构建系统发育树,表明其属于真核生物I类HMGR家族。结构分析表明,Cs HMGR1含有两个跨膜区,推测其与其它真核生物同源蛋白类似地定位于内质网上;含有两个HMG-Co A结合位点、两个NADPH结合位点、四个保守的催化活性残基及一个磷酸化位点,说明磷酸化/去磷酸化很可能也是其活性调节的重要方式。表达分析表明,Cs HMGR1在"大叶龙"叶芽、母株叶芽及花芽都有较强的表达。其表达调控及生理活性对茶叶品质可能有重要影响,并在其功能解析的基础上,有可能作为茶叶品质鉴定及育种的一个依据。     

彩叶草羟基丙酮酸还原酶基因CbHPR的克隆及分析

为研究C3植物彩叶草的光呼吸作用,根据获得的HPR EST片段,采用RACE和文库结合的方法,克隆了HPR蛋白的全长cDNA,命名为CbHPR(GenBank accession No.EF125078).序列分析结果表明,该cDNA全长为1 393 bp,包含一个1 161 bp的ORF框,编码386个氨基酸;其5′-UTR区含有2个终止子TGA,3′-UTR区具有推测的加尾信号AATAAA;CbHPR蛋白C端具定位于微体的转运信号S-K-L,具有1个保守的2-Hacid_dh_C domain结构域(D-异构体-羟基酸脱氢酶-NAD结合结构域)、5个S磷酸化位点、4个T磷酸化位点和6个Y磷酸化位点.PSORT定位分析显示,CbHPR定位于叶的过氧化物酶体中.多序列比较和进化树分析表明,CbHPR与其他植物HPR一致性高达87%～90%,与拟南芥AtHPR具有相似的功能.CbHPR基因的克隆与分析,为进一步研究该基因在彩叶草的光呼吸作用中的表达调控奠定了基础.     

褶纹冠蚌过氧化物还原酶6基因的克隆及原核表达

过氧化物还原酶6具有谷胱甘肽过氧化物酶和磷脂酶A2的双重活性,在机体抗氧化保护及肺表面活性物质代谢中具有重要的作用。研究克隆和分析了褶纹冠蚌Prx6(CpPrx6)基因的cDNA序列特征。结果表明CpPrx6基因的cDNA全长1617 bp;其中5′端非翻译区为71 bp,3′端非翻译区为889 bp,开放阅读框为657bp,可以编码218个氨基酸。CpPrx6氨基酸序列与其他已知贝类Prx6的同源性为70%—72%。CpPrx6蛋白含有1-Cys型Prx共有的保守催化中心"PVCTTE"和脂肪酶基序"GKSWA",三级结构中包含6个α螺旋、12个β折叠,催化中心位于第5个α螺旋内。CpPrx6基因在褶纹冠蚌血细胞、外套膜、闭壳肌、肝胰腺、鳃等组织中均有表达,其中鳃的表达量最大。嗜水气单胞菌刺激后6h和12h时CpPrx6在肝胰腺中的表达量明显增加(6h,P<0.05;12h,P<0.01),在血细胞和鳃组织中12h的表达量增加,24h时恢复到正常水平。将CpPrx6基因亚克隆到pET-32a(+)质粒中构建了重组质粒,SDS-PAGE分析发现重组质粒在大肠杆菌DE3中获得了表达。     

异育银鲫BMP15基因片段的克隆及序列分析

根据斑马鱼骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein,BMP15)基因的保守区序列设计引物,采用RT-PCR法扩增出异育银鲫BMP15基因的部分序列,该片段长811 bp,编码270个氨基酸。经过BLAST比对,该氨基酸序列与斑马鱼、欧洲海鲈及人等动物BMP15基因的同源性分别为80%、38%及29%。本试验结果为进一步研究该基因的结构与功能提供了资料。     

甘蔗类异黄酮还原酶(IRL)基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术从甘蔗中克隆So IRL基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,利用荧光定量PCR技术研究So IRL基因在甘蔗不同组织和不同胁迫条件下的表达特性。结果表明,克隆获得甘蔗So IRL,Gen Bank登录号为KF808324。该c DNA全长1 169 bp,含有1个927 bp的完整开放阅读框(ORF),编码309个氨基酸。系统进化树分析显示,甘蔗So IRL与玉米的IRL蛋白亲缘关系较近。q RT-PCR分析表明So IRL在甘蔗根、茎、叶中均有表达;在RSD病菌及低温(4℃)、聚乙二醇(PEG)、Na Cl和脱落酸(ABA)4种非生物胁迫下均被诱导表达,但表达模式不同。说明该基因可能参与甘蔗应答RSD过程,并可能在非生物胁迫中也发挥了作用。     

偶氮染料脱色菌株AZR偶氮还原酶基因的克隆及其序列分析

利用16S rRNA鉴定偶氮染料脱色菌株AZR属于葡萄球菌属(Staphylococcus)中的科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii), 根据GeneBank上登录的葡萄球菌属的3个偶氮还原酶基因序列设计扩增引物, 从菌株AZR的基因组中扩增出偶氮还原酶基因, 其大小为567 bp, 编码188个氨基酸。GenBank搜索表明其为新基因, 递交GenBank数据库, 获得登录号为EU849488。通过互联网数据库及生物信息学分析工具进行初步分析表明, 该基因编码的蛋白属于黄素蛋白家族,     

米曲霉木糖还原酶基因的克隆及序列分析

木糖还原酶（XR, EC 1.1.1.21）是真菌微生物代谢木糖的关键酶之一。本文以米曲霉基因组DNA为模板,克隆木糖还原酶基因（xr,GenBank登录号：FJ957890.1）,并对XR的序列、系统进化树、理化性质及蛋白结构等进行生物信息学分析。结果表明： xr基因序列长1449 bp,其中开放阅读框长960 bp,编码319个氨基酸,蛋白质分子质量35.9 kDa,等电点为5.78;米曲霉XR与其他菌种XR有较高的同一性,含有醛酮还原酶家族的两个指纹结构和一个参与辅酶结合活性位点指纹结构,以及醛酮还原酶家族典型的（β/α）8 TIM桶结构,说明米曲霉XR属于醛酮还原酶家族。     

棉铃虫过氧化物酶基因HaPOD的克隆和表达分析

【目的】克隆棉铃虫Helicoverpa armigera过氧化物酶基因(HaPOD)并进行序列分析,研究HaPOD基因的时空表达模式以及在极端温度、双氧水处理和HaNPV感染后的基因表达变化模式。【方法】基于转录组测序获得HaPOD基因序列,通过几种生物信息学软件对该基因的核苷酸和氨基酸序列进行分析。采用实时荧光定量PCR技术检测HaPOD基因在棉铃虫体内的时空表达模式及4种逆境处理后的表达变化情况。【结果】序列分析显示该基因开放阅读框长1 332 bp,编码443个氨基酸,含有一个细胞粘附蛋白序列,氨基酸序列与甜菜夜蛾Spodoptera exigua同源物序列一致性为85%,亲缘关系最近。HaPOD基因在5龄以前表达量相对较低,5龄后表达量开始升高,蛹第5天最高。在幼虫头和成虫翅中表达量相对较高。在高温、双氧水和HaNPV感染处理后,该基因表达量显著升高,而在低温处理后表达量显著下调。【结论】本研究克隆得到了棉铃虫HaPOD基因序列并对其进行了分析,其表达量在高温、双氧水和HaNPV感染处理后上调而低温处理后下调,这些结果为进一步研究过氧化物酶在维持氧化还原平衡和抵抗氧化损伤方面的功能奠定基础。     

发状念珠藻醛酮还原酶基因NfAKR的克隆与表达

以发状念珠藻细胞为试材,采用PCR技术克隆了醛酮还原酶基因的开放阅读框(ORF)序列,命名为NfAKR。对基因序列特征进行了生物信息学分析,根据其编码氨基酸序列预测了NfAKR蛋白的三维结构,同时探讨了PEG-6000胁迫下NfAKR的表达特性。结果表明:NfAKR基因的编码序列长912bp,编码304个氨基酸,预测其编码蛋白的相对分子量为33.51kD,理论等电点为4.94,具有醛酮还原酶超家族保守结构域。NfAKR蛋白主要由10个α-螺旋和11β-折叠组成,中间形成一个疏水穴,作为酶的催化活性中心。NfAKR与点形念珠藻处在同一进化枝上,具有较近的亲缘关系。qRT-PCR分析显示,PEG-6000胁迫下NfAKR基因上调表达,当PEG-6000浓度为8%时,其相对表达量为5.66并达到峰值。依据NfAKR基因响应干旱胁迫上调表达的特性,推测醛酮还原酶可能参与发状念珠藻抵御干旱胁迫过程。     

星星草脱氢抗坏血酸还原酶（PtDHAR）cDNA的克隆及表达分析

脱氢抗坏血酸还原酶是抗坏血酸代谢循环中的关键酶,在多种植物中与抗胁迫相关。为了获得抗盐碱植物星星草中该基因序列,利用RACE技术,从星星草中克隆出脱氢抗坏血酸还原酶基因（PtDHAR）的cDNA全长序列,其GenBank登录号为HM125046。PtDHAR cDNA核苷酸序列长度为987bp,开放阅读框为639bp,编码213个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列与水稻、小麦等禾本科作物具有很高的同源性。Northern杂交分析表明,该基因在盐碱胁迫下表达量显著升高。     

银鲫apelin基因的克隆、组织表达谱和摄食关系的初步研究

apelin是一种参与哺乳动物和鱼类摄食调控的重要神经肽。为了更好地研究apelin在银鲫(Carassius auratus gibelio)上的摄食调控作用,本试验采用RACE技术首次获得了银鲫apelin的cDNA全长序列,并通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测了apelin基因在各组织的表达情况以及餐前餐后和禁食对其表达量的影响。结果显示银鲫apelin全长cDNA序列长度为1082 bp,其中5’非编码区(5’-UTR)的长度为114 bp,3’非编码区(3’-UTR)的长度为734 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)的长度为234 bp。银鲫apelin基因的ORF区编码77个氨基酸,前22个氨基酸为信号肽。apelin基因在银鲫21个组织中普遍表达,特别是在下丘脑中表达量最高。在餐前餐后的试验中,银鲫下丘脑apelin基因在餐后表达量显著下降(p<0.05);在禁食试验中,禁食组下丘脑apelin基因的表达量在第5天显著升高(p<0.05),第7天极显著升高(p<0.01),复投喂后,apelin基因的表达量在第9天、第11天、第14天极显著降低(p<0.01)。综上所述,apelin基因可能是银鲫的诱食因子,在其摄食调控起到一定的作用。     

异育银鲫c型溶菌酶全长cDNA序列的生物信息学分析及其组织表达分析

利用RACE及克隆等方法获得了异育银鲫（Carassius auratus gibelio）c型溶菌酶基因全长cDNA序列．序列分析表明,所克隆的异育银鲫溶菌酶的cDNA全长751 bp,包括溶菌酶基因开放阅读框（ORF）438 bp,5′ 非编码区（UTR）为109 bp和3′ UTR为204 bp．438 bp ORF共编码146个氨基酸,其成熟肽的分子量预测值为14　543.6,理论等电点为8.86．通过ClustalW软件,将异育银鲫和其它多个物种c型溶菌酶的氨基酸序列进行多序列比对发现,所克隆的异育银鲫溶菌酶编码的氨基酸序列中存在c型溶菌酶的活性中心（Glu53和Asp69）,且与活性位点相邻的氨基酸序列高度保守．同时,8个保守的半胱氨酸残基也与其它物种的c型溶菌酶相一致．结合BLASTN分析的结果,可以确认所获得的异育银鲫溶菌酶cDNA序列属于c型溶菌酶．异育银鲫c型溶菌酶和人c型溶菌酶（pdb 1at6_）在蛋白质序列上有50%相似性,其三维（3-D）结构非常类似．通过氨基酸空间位置比较发现,两者具有类似的酶活中心,异育银鲫c型溶菌酶只能形成3个二硫键,比人少1个．荧光定量RT-PCR检测和溶菌酶活性测定显示,异育银鲫头肾和脾脏c型溶菌酶mRNA的表达量约为肝胰脏的2.9 倍和1.7 倍,异育银鲫头肾和脾脏的溶菌酶活性约为肝胰脏的6.2 倍和4倍．     

Karyotypic diversity in polyploid gibel carp,Carassius auratus gibelio Bloch

Polyploid gibel carp, Carassius auratus gibelio, is an excellent model system for evolutionary genetics owing to its specific genetic background and reproductive modes. Comparative karyotype studies were performed in three cultured clones, one artificially manipulated group, and one mated group between two clones. Both the clones A and P had 156 chromosomes in their karyotypes, with 36 metacentric, 54 submetacentric, 36 subtelocentric, 24 acrocentric, and six small chromosomes. The karyotype of clone D contained 162 chromosomes, with 42 metacentric, 54 submetacentric, 36 subtelocentric, 24 acrocentric, and six small chromosomes. All the three clones had six small chromosomes in common. Group G, being originated from the clone D by artificial manipulation, showed supernumerary microchromosomes or chromosomal fragments, in addition to the normal chromosome complement that was identical to the clone D. The offspring from mating between clones D and A had 159 chromosomes. Comparing with the clone A, the DA offspring showed three extra metacentric chromosomes. In addition, variable RAPD fingerprint patterns and unusual SCAR marker inheritance were, respectively, detected among individuals of artificial group G and in the mated DA offspring. Both the chromosome and molecular findings suggest that genome reshuffling might have occurred by manipulation or mating of the clones.     

金鱼Prox1基因cDNA的克隆及其在眼睛发育中的表达分析

脊椎动物的Prox1基因,与果蝇的转录因子prospero同源。为了探讨Prox1基因在金鱼眼睛发生过程中的表达图式,我们从金鱼眼睛SMART库中克隆了Prox1cDNA。它全长共2851bp,编码739个氨基酸。组织分布研究表明,Prox1主要分布于眼、脑、心、肝、脾和肾中。整体原位杂交显示,Prox1mRNA首先是在晶体期的晶体原基中有转录,心跳期则在未成熟晶体的细胞中和视网膜的幼芽区可以检测到。晶体纤维形成后,它主要定位于视纤维层和内网织细胞层。免疫组化显示,心跳期Prox1蛋白的定位与mRNA相同,晶体纤维形成以后,Prox1蛋白主要定位在晶体上皮细胞内侧的晶体纤维上一个环状区域,与Prox1mRNA的定位不同。这说明,Prox1基因在晶体发生过程中有重要作用,且在晶体的不同发育时期起的作用可能有所不同。另外,Prox1在晶体发育过程中有一个从内向外的变化过程。     

The ploidy and reproductive mechanism of crucian carp, Carassius auratus gibelio

With the method of Feulgen staining, through cytophotometric measurements, the DNA contents of sex-reversed male (genotypic female) crucian carp (2n = 150 ±) had average values of 2.75 and 1.36 A.U., respectively, in erythrocytes and spermatozoa. The ratio of the erythrocyte and spermatozoon DNA contents of the 'male' crucian carp is 2.01:1 (2C: 1C) and is the same as in the normal male, 2.02:1. The crucian carp has a DNA value of 4.1 pg, which is 68% of that in humans. The results of the study suggest that both sex-reversal males and normal males have the ability to complete the meiotic division during their gametogenesis, and that the population has diploidized over a long term of evolution.     

西伯利亚鲟和鲫鱼脑型一氧化氮合酶cDNA片段克隆及序列分析

实验根据脑型一氧化氮合酶氨基酸高度保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增并克隆了西伯利亚鲟(Acipenser baeri)和鲫鱼(Carassius auratus)的脑型一氧化氮合酶cDNA片段。西伯利亚鲟cD-NA片段为356 bp,鲫鱼cDNA片段为377 bp。氨基酸序列同源分析发现,西伯利亚鲟与斑马鱼(Brachydaniorerio)的脑型一氧化氮合酶同源性为70%,鲫鱼与斑马鱼的同源性为97.6%。     

三倍体和二倍体银鲫的精子发生

应用透射电子显微镜观察了行雌核发育生殖的三倍体(体细胞具有150±染色体)和二倍体 (2n=100)银鲫(Carassius auratus gibelio Bloch)的精子发生过程.两种倍性的雄性的精子发生过程中,染色体数和细胞核的体积均呈3∶2的关系;而精巢的结构、细胞的形态和细胞器的构成均无明显的区别.其精子发生经历了精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞几个阶段,精子细胞再经过精子形成过程成为精子;三倍体银鲫的精子发生与二倍体一样能正常完成减数分裂,形成形态和功能正常的雄性配子.正常的精子发生过程证明,体细胞具有150±条染色体的黑龙江银鲫是已经初步完成二倍化的三倍体,雄性个体在生殖群体中起着重要的作用;推测黑龙江银鲫的二倍体实际可能是四倍体,则三倍体的黑龙江银鲫为偶倍性的六倍体,因此其减数分裂可以正常进行,同时又经历了一定程度的二倍化,所以雄性可育,且参与繁殖后代 [动物学报 54(3):467-474,2008].     

虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)Vasa基因的克隆与表达

Vasa基因是DEAD-box家族成员中的一种ATP依赖的RNA解旋酶编码基因,在生殖系分化过程中发挥重要作用。采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从虾夷马粪海胆精巢中克隆得到Vasa基因3′端cDNA序列。该3′末端cDNA长1057bp,与太平洋牡蛎、紫球海胆、非洲爪蟾、小鼠及虹鳟经同源进行比对,其中与紫球海胆的同源率最高达到95%,并确定其为DEAD-box家族的Vasa亚家族成员。利用实时定量RT-PCR检测Vasa mRNA在虾夷马粪海胆组织和胚胎发育期的表达情况,研究结果表明Vasa基因在生殖腺表达量最高,雌、雄个体生殖腺中转录水平上的表达差异明显,雄性高于雌性,差异显著(P<0.05),在肠、体腔液、肌肉、围口膜、管足中表达量低,其中体腔液表达量最低。胚胎发育期检测发现Vasa基因在16细胞期时表达量最高,16细胞期后表达量呈下降趋势,囊胚期表达量最低。试验结果为虾夷马粪海胆生殖系统起源、分化研究提供科学依据。对于虾夷马粪海胆生殖系分化途径来讲,Vasa可作为一种有利的研究工具,追溯其生殖系的起源和分化。     

银鲫肌酸激酶M3-CK cDNA的克隆及其表达特征

用抑制性差减杂交结合SMART cDNA合成和RACE—PCR技术克隆到雌核发育银鲫(Carassius auratus gibelio)肌酸激酶M3-CK基因的全长cDNA。银鲫M3-CK cDNA全长1551bp，编码380个氨基酸，与普通鲤鱼(cyprinus carpio)M3-CK的氨基酸序列同源性高达95％。种系分析表明，银鲫M3-CK与其它脊椎动物的肌肉型肌酸激酶聚为较近的一支，与鲤鱼的M3-CK聚在一起，与脑特异型肌酸激酶及线粒体型肌酸激酶分歧较大。虚拟Northern杂交显示银鲫M3-CK基因在胚胎发育中差异表达。RT—PCR表明，银鲫M3-CK基因在成熟卵母细胞和胚胎发育早期可检测到少量的转录产物，在胚胎发育期间从肌肉效应期开始转录，并一直持续表达。组织RT—PCR表明，银鲫M3-CK基因只在心脏和肌肉表达。