褶纹冠蚌过氧化物还原酶6基因的克隆及原核表达

过氧化物还原酶6具有谷胱甘肽过氧化物酶和磷脂酶A2的双重活性,在机体抗氧化保护及肺表面活性物质代谢中具有重要的作用。研究克隆和分析了褶纹冠蚌Prx6(CpPrx6)基因的cDNA序列特征。结果表明CpPrx6基因的cDNA全长1617 bp;其中5′端非翻译区为71 bp,3′端非翻译区为889 bp,开放阅读框为657bp,可以编码218个氨基酸。CpPrx6氨基酸序列与其他已知贝类Prx6的同源性为70%—72%。CpPrx6蛋白含有1-Cys型Prx共有的保守催化中心"PVCTTE"和脂肪酶基序"GKSWA",三级结构中包含6个α螺旋、12个β折叠,催化中心位于第5个α螺旋内。CpPrx6基因在褶纹冠蚌血细胞、外套膜、闭壳肌、肝胰腺、鳃等组织中均有表达,其中鳃的表达量最大。嗜水气单胞菌刺激后6h和12h时CpPrx6在肝胰腺中的表达量明显增加(6h,P<0.05;12h,P<0.01),在血细胞和鳃组织中12h的表达量增加,24h时恢复到正常水平。将CpPrx6基因亚克隆到pET-32a(+)质粒中构建了重组质粒,SDS-PAGE分析发现重组质粒在大肠杆菌DE3中获得了表达。     

异育银鲫c型溶菌酶全长cDNA序列的生物信息学分析及其组织表达分析

利用RACE及克隆等方法获得了异育银鲫（Carassius auratus gibelio）c型溶菌酶基因全长cDNA序列．序列分析表明,所克隆的异育银鲫溶菌酶的cDNA全长751 bp,包括溶菌酶基因开放阅读框（ORF）438 bp,5′ 非编码区（UTR）为109 bp和3′ UTR为204 bp．438 bp ORF共编码146个氨基酸,其成熟肽的分子量预测值为14　543.6,理论等电点为8.86．通过ClustalW软件,将异育银鲫和其它多个物种c型溶菌酶的氨基酸序列进行多序列比对发现,所克隆的异育银鲫溶菌酶编码的氨基酸序列中存在c型溶菌酶的活性中心（Glu53和Asp69）,且与活性位点相邻的氨基酸序列高度保守．同时,8个保守的半胱氨酸残基也与其它物种的c型溶菌酶相一致．结合BLASTN分析的结果,可以确认所获得的异育银鲫溶菌酶cDNA序列属于c型溶菌酶．异育银鲫c型溶菌酶和人c型溶菌酶（pdb 1at6_）在蛋白质序列上有50%相似性,其三维（3-D）结构非常类似．通过氨基酸空间位置比较发现,两者具有类似的酶活中心,异育银鲫c型溶菌酶只能形成3个二硫键,比人少1个．荧光定量RT-PCR检测和溶菌酶活性测定显示,异育银鲫头肾和脾脏c型溶菌酶mRNA的表达量约为肝胰脏的2.9 倍和1.7 倍,异育银鲫头肾和脾脏的溶菌酶活性约为肝胰脏的6.2 倍和4倍．     

青花菜雄性不育相关基因BoDHAR的克隆与表达分析

以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段的序列为信息探针,通过在NCBI与TAIR网站数据库中进行同源EST序列搜索,经人工拼接、RT-PCR、PCR克隆与序列分析,获得了青花菜脱氢抗坏血酸还原酶DHARdehydroascorbatereductase基因的cDNA与DNA全长序列,命名为BoDHAR。并利用双链接头介导PCR的染色体步行技术(genomewalking)克隆了其上游644bp的5′端序列。所获的BoDHAR基因全长1486bp,存在两个内含子,DNA编码区序列633bp,编码210个氨基酸;序列分析表明BoDHAR与同源基因AT1G19570.1cDNA序列有82.3%的一致性,推导的氨基酸序列有79.6%的一致性;编码的水溶性蛋白存在多个磷酸化位点;5′端上游区存在明显的转录调控序列。半定量RT-PCR结果表明BoDHAR在可育系花蕾中的表达量明显高于不育系花蕾,在花药中的表达明显高于其它部位。     

异育银鲫GABAB受体1亚基 cDNA部分序列的克隆及组织表达分析

为了确定γ-氨基丁酸B受体（gamma-aminobutyric acid B receptor,GABABR）基因在异育银鲫（Carassius auratus gibelio）不同组织中的表达,本实验分别对异育银鲫不同组织中GABABR1基因进行RT-PCR扩增,并进行了克隆和测序,在与GenBank基因库中已知GABABR1序列进行同源性比对的基础上采用邻接法构建系统发育树,并进一步分析其在异育银鲫不同组织内的表达水平。结果：经克隆获得异育银鲫GABABR1基因CDS区序列383bp,编码127个氨基酸。荧光定量PCR结果显示GABABR1基因在异育银鲫脑、肝、肾、心、肠、鳔、鳃、肌、鳍、脾、卵巢、精巢组织中均有表达,且在不同组织中的表达水平由高到低依次是：脑>尾鳍>精巢>心、肠、鳔> 卵巢、脾、鳃、肌>肝、肾。本研究证实了GABABR1基因在异育银鲫各组织中的表达的广泛性,且有明显的组织特异性。     

银鲫apelin基因的克隆、组织表达谱和摄食关系的初步研究

apelin是一种参与哺乳动物和鱼类摄食调控的重要神经肽。为了更好地研究apelin在银鲫(Carassius auratus gibelio)上的摄食调控作用,本试验采用RACE技术首次获得了银鲫apelin的cDNA全长序列,并通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测了apelin基因在各组织的表达情况以及餐前餐后和禁食对其表达量的影响。结果显示银鲫apelin全长cDNA序列长度为1082 bp,其中5’非编码区(5’-UTR)的长度为114 bp,3’非编码区(3’-UTR)的长度为734 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)的长度为234 bp。银鲫apelin基因的ORF区编码77个氨基酸,前22个氨基酸为信号肽。apelin基因在银鲫21个组织中普遍表达,特别是在下丘脑中表达量最高。在餐前餐后的试验中,银鲫下丘脑apelin基因在餐后表达量显著下降(p<0.05);在禁食试验中,禁食组下丘脑apelin基因的表达量在第5天显著升高(p<0.05),第7天极显著升高(p<0.01),复投喂后,apelin基因的表达量在第9天、第11天、第14天极显著降低(p<0.01)。综上所述,apelin基因可能是银鲫的诱食因子,在其摄食调控起到一定的作用。     

松江鲈(Trachidermus fasciatus)凝血因子Ⅺ的基因克隆与表达分析

克隆松江鲈凝血因子XI基因cDNA序列,分析表达模式。利用RACE技术从松江鲈中克隆获得了凝血因子XI的cDNA全长序列(命名为TfXI),并对其进行生物信息学和表达模式分析。获得TfXI cDNA全长1 287 bp,包括13 bp的5'端非编码区,1 143 bp的开放阅读框以及131 bp的3'端非编码区。开放阅读框编码280个氨基酸的多肽链,预测的蛋白大小为42.9 kD。N端含有由第22-105位氨基酸,112-196位氨基酸、205-279位氨基酸和289-369位氨基酸形成的4个串联排列的典型APPLE结构域。NCBI Blast结果显示TfXI与其他物种凝血因子XI的相似性为30%-63%,进化树分析显示,TfXI符合传统进化规律。Realtime PCR分析表明,经LPS刺激96 h后,松江鲈脾脏TfXI表达量明显提高(P0.01)。     

银鲫精巢特异的Ly-6/uPAR相关蛋白的分子克隆及其特征分析

Ly-6/uPAR基因超家族(Ly-6 SF)成员广泛地存在于后生动物中, 开展该家族相关功能基因研究具有重要的意义。研究从银鲫(Carassius auratus gibelio)中鉴定到一个该家族新成员, cDNA全长为570 bp, 其中开放阅读框长度为300 bp, 编码99个氨基酸, 生物软件预测该蛋白含有一个LU结构域, 不含GPI锚信号序列, N端含有信号肽, 表明其可能为Ly-6基因超家族中分泌型蛋白。组织表达分析显示, 该基因只在银鲫精巢中特异表达, 且又是Ly-6基因超家族中一员, 因此将其命名为银鲫精巢特异的Ly-6/uPAR相关蛋白(Carassius auratus gibelio testis-specific Ly-6/uPAR related protein, 简称CagTslurp)。原位杂交结果显示, 该基因在银鲫精巢的精原细胞, 初级精母细胞以及次级精母细胞中表达, 精子细胞中存在少量的表达, 而在体细胞中不表达。这种精巢特异的表达模式, 暗示CagTslurp在银鲫精子发生中可能发挥了作用。       

星星草脱氢抗坏血酸还原酶（PtDHAR）cDNA的克隆及表达分析

脱氢抗坏血酸还原酶是抗坏血酸代谢循环中的关键酶,在多种植物中与抗胁迫相关。为了获得抗盐碱植物星星草中该基因序列,利用RACE技术,从星星草中克隆出脱氢抗坏血酸还原酶基因（PtDHAR）的cDNA全长序列,其GenBank登录号为HM125046。PtDHAR cDNA核苷酸序列长度为987bp,开放阅读框为639bp,编码213个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列与水稻、小麦等禾本科作物具有很高的同源性。Northern杂交分析表明,该基因在盐碱胁迫下表达量显著升高。     

鲢神经肽Y基因的克隆及其在禁食-恢复投喂条件下的表达特征分析

为深入研究神经肽Y对鲢摄食活动的调节作用,研究利用同源克隆方法获得鲢NPY基因cDNA全长序列,并检测在禁食-恢复投喂条件下,NPY在脑和肝脏中的表达情况. 结果表明: 鲢NPY基因cDNA全长782 bp,包括5'端非翻译区68 bp,3'端非翻译区423 bp,开放阅读框291 bp,编码96个氨基酸; 氨基酸相似性比较和系统进化分析结果显示NPY较为保守; NPY在所检测的13个组织中均有表达,并且在脑垂体中表达量最大; 禁食导致NPY mRNA在脑中的表达量显著上升,恢复投喂6h后下降到基本水平,表明NPY对鲢摄食有促进作用; 在肝脏中,禁食前5天NPY mRNA表达量显著上升,禁食第7天急剧下降,恢复投喂4h后下降到基本水平; NPY mRNA在脑和肝脏中的表达具有组织差异性,其在肝脏中的具体作用机制有待进一步研究. 研究结果为探讨NPY在鲢中的生物学功能和在遗传育种中的作用提供了理论依据。     

锦鲤Hepcidin基因的克隆及其组织特异性表达分析

【目的】克隆锦鲤hepcidin全长cDNA序列(k-hepc),并获得此基因在鱼体内的表达模式。【方法】利用RT-PCR和RACE PCR的方法,从锦鲤肝脏中克隆锦鲤hepcidin的全长cDNA,进行序列测定和分析;锦鲤经肌肉注射维氏气单胞菌0、4、8、12、24和48 h后,分别取其肝、脾、肾、肠、脑、心、肌肉和鳃组织,采用实时荧光定量PCR的方法,以β-actin为内参基因,检测k-hepc基因的表达量。【结果】锦鲤抗菌肽(GenBank登录号KC795559)全长755 bp,编码序列276 bp,编码91个氨基酸,包括信号肽、原肽和成熟肽,成熟肽C端含有8个半胱氨酸,可形成4个分子内二硫键。与已报道的普通鲤鱼hepcidin氨基酸序列的一致性为93%,与其他鱼类hepcidin氨基酸序列的一致性为29%?93%。在本研究所检测的正常锦鲤的组织中,k-hepc均有表达,其中在肝组织中表达量最高,鳃组织中表达量最低。经维氏气单胞菌感染后,k-hepc在肝和心组织中的表达量明显增加,在其余组织中变化不显著。【结论】k-hepc编码的蛋白是Hepcidin家族的成员之一。锦鲤Hepcidin的表达主要受内在调节因素影响。