一种改良宫颈鳞癌原代培养方法的建立

目的:探讨不同培养条件对宫颈鳞癌原代培养的可行性。方法:取确诊为宫颈鳞癌患者的活检或手术标本,通过对消化时间及重悬液量进行改良原代细胞培养,观察鳞癌细胞生长状况,并比较其与传统消化法的细胞生长率,免疫组化进行细胞鉴定。结果:消化时间为3小时,重悬液量为1ml时细胞生长率最高。改良法24小时细胞生长率为61.54%,传统消化法24小时细胞生长率为7.69%(x2=5.14,P<0.05)。活检标本细胞生长率80%,手术标本3例无一例细胞生长。结论:采用消化时间为3小时,重悬液量为1 ml成功建立了宫颈鳞癌原代培养方法,活检标本较手术标本更易培养成功。     

一种改良宫颈鳞癌原代培养方法的建立

目的：探讨不同培养条件对宫颈鳞癌原代培养的可行性。方法：取确诊为宫颈鳞癌患者的活检或手术标本,通过对消化时间及重悬液量进行改良原代细胞培养,观察鳞癌细胞生长状况,并比较其与传统消化法的细胞生长率,免疫组化进行细胞鉴定。结果：消化时间为3小时,重悬液量为1ml时细胞生长率最高。改良法24小时细胞生长率为61．54％,传统消化法24小时细胞生长率为7．69％（x2=5．14,P〈0．05）。活检标本细胞生长率80％,手术标本3例无一例细胞生长。结论：采用消化时间为3小时,重悬液量为1ml成功建立了宫颈鳞癌原代培养方法,活检标本较手术标本更易培养成功。     

SD大鼠视网膜小胶质细胞原代培养方法的改良

目的对经典的原代视网膜小胶质细胞体外纯化培养方法进行简单的改良以提高细胞产量。方法在视网膜小胶质细胞原代培养过程中以McCarthy等的经典方法为基础,寻找适当的初始种植密度,并在初次振荡分离后继续培养以获得多次产出,使用免疫细胞化学染色方法进行小胶质细胞纯度鉴定。结果视网膜小胶质细胞原代培养最宜初始种植密度为1×106/mL,多次分离纯化获得的视网膜小胶质细胞均达到97%以上的纯度。结论视网膜小胶质细胞原代培养过程中,以适当的初始种植密度和多次振荡分离方法可在保证有效纯度的基础上提高细胞产量。     

新生大鼠肺成纤维细胞的原代培养改良法及细胞鉴定

探讨新生大鼠肺成纤维细胞原代培养的改良方法及细胞鉴定。用胰酶消化组织块结合的方法提取新生大鼠肺成纤维细胞,并纯化细胞,对肺成纤维细胞进行形态学观察,用HE染色及免疫组化染色法对细胞进行鉴定,并用MTT法测定细胞生长曲线。倒置相差显微镜下观察选用改良法获得的细胞,3 d后可见组织块周边有少许细胞,5 d后组织块周围有大量细胞爬出,生长迅速,10 d接近融合。经改良后的方法纯化细胞,细胞活性状态较好的为3~5代,5代以后的细胞增殖能力下降。对第3代肺成纤维细胞进行HE染色,镜下可见形态典型的成纤维细胞,免疫组化结果显示波形蛋白(Vi-mentin)阳性表达,细胞角蛋白(cytokeratin)阴性表达。MTT法检测第3代细胞于3~5 d处于对数生长期。胰酶消化组织块结合法是一种可靠快速的肺成纤维细胞分离纯化的培养方法,使用这种方法可得到具有典型形态特征且活性较好的肺成纤维细胞,初学者容易掌握。     

大鼠原代肝细胞培养方法的建立

目的：探索混合胶原凝胶培养肝细胞的方法,观察培养鼠肝细胞的功能与形态特征,用于评价中药十八反的作用机理。方法：两步法分离鼠肝细胞,与鼠尾胶原溶液混合接种于培养板,观察培养鼠肝细胞的形态学特征和生化指标。采用RT-PCR技术。检测药物对P450亚酶CYP3A1表达的影响,进一步确证该体系的可靠性。结果：双层胶原培养体系可观察到典型的肝细胞形态特征,肝细胞功能检测显示肝细胞合成分泌的尿素、白蛋白,而乳酸脱氢酶漏出量较少。药物对P450亚酶CYP3A1表达的影响呈良好的剂量依赖性,同时双层胶原具有保持肝细胞活性的优点。可作为原代肝细胞培养的条件。结论：混合胶原凝胶培养能保留体内的细胞功能和活性,特别是保留药物代谢酶的活性。     

新生小鼠心肌细胞分离培养的改良及其鉴定

通过改进新生小鼠心肌分离及其原代培养方法,提高心肌细胞的活性和纯度,构建了新生小鼠心肌细胞分离及原代培养实验平台.采用低浓度的胰酶和Ⅱ型胶原酶反复消化心脏组织5～6次,然后差速贴壁30 min分离纯化心肌细胞,得到的心肌细胞存活率和纯度高,细胞搏动率高,持续时间久.     

人大隐静脉干细胞原代培养方法的改良

旨在探讨如何高效获取优质的人大隐静脉(Great saphenous vein)原代干细胞。大隐静脉剪碎后分别采用组织块贴壁法和Ⅱ型胶原酶消化法获取血管壁细胞。倒置显微镜下观察不同时间段两组血管壁细胞形态学变化,台盼蓝染色测定血管壁细胞存活率,流式分选CD34和CD117双阳性干细胞,免疫荧光进一步证实。细胞培养至第三代(P3)时组织块贴壁法提取的细胞出现纤维化老化,而酶消化法提取的细胞仍有集落样生长,细胞存活率分别为(91.7±1.2)%和(97.2±0.7)%(P=0.005)。流式分选结果显示:组织块法和酶消化法获得CD34和CD117双阳性细胞所占比例分别为(0.16±0.05)%和(0.44±0.07)%,差异有统计学意义(P=0.005)。免疫荧光染色显示,分选出的干细胞培养1周后组织块法获得双阳性干细胞的阳性率(89.41±2.06)%,酶消化法为(94.03±1.83)%,P0.05。流式细胞仪检测分选出的干细胞中CD31、VEGF2和SMA阳性率分别为(0.12±0.01)%、(0.19±0.02)%和(0.45±0.01)%,与阴性对照组差异无统计学意义(P0.05),排除成熟内皮细胞和平滑肌细胞存在的可能性。分选出的干细胞进行管腔形成实验进一步证实其具有向内皮分化的潜能。上述结果显示,采用酶消化法可以获得形态更好、数量更多、存活率相对更高的干细胞,可广泛用于临床和基础研究。     

动脉平滑肌细胞原代培养贴块法的改良

对传统的动脉平滑肌细胞（ASMCs）的体外培养贴块法进行改良。用改良的贴块法进行ASMCs的原代培养,用传统的贴块培养法作对照。运用改良贴块法细胞长满瓶壁所需平均生长时间为6天,产量为60-60万/瓶;而在同等条件下对照组的传统贴块细胞长满瓶壁所需生长时间约需15天,产量仅为30万/瓶。并且,改良方法比传统方法具有较高的成功率,且无需选用胰岛素。新方法简单易行,结果稳定可靠。     

大鼠细小肺动脉平滑肌细胞原代培养和鉴定方法的研究

目的：建立一种重复性好、培养周期短及传代次数多的大鼠细小肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）培养方法。方法：在无菌条件下,分离雄性SD大鼠肺细小动脉,剥离外膜和剔除内皮细胞,经胶原酶I消化,培养PASMCs。0.4%台盼蓝染色测定细胞活力;倒置相差显微镜观察;免疫细胞化学法和免疫荧光染色法,进行平滑肌α-肌动蛋白（α-SMactin）鉴定。结果：形态学观察、免疫细胞化学法及免疫荧光染色法鉴定表明培养细胞为PASMCs;细胞存活率在96.5%以上;原代培养后4～7d即可传代,并且生长特点、细胞形态不易发生改变。结论：采用胶原酶I消化法培养PASMCs,方法简单、酶消化时间易控制、培养周期短、重复性好,培养的原代PASMCs具有数量多和生长迅速的特点。     

成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞分离及培养的优化方案

目的:摸索及优选成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的实验方法。方法:将成年SD大鼠心脏剪成小组织块,采用以下四种方案(A:0.08%胰酶+0.1%胶原酶II消化15 min,B:0.2%胶原酶II消化15 min,C:0.2%胶原酶II消化60min,D:0.2%胶原酶II消化90 min)提取成年大鼠心脏原代成纤维细胞,再通过差速贴壁分离方法培养原代成纤维细胞。采用倒置显微镜观察成纤维细胞的基本形态特征,并进行Vimentiin免疫荧光染色对培养的原代细胞进行荧光鉴定;采用台盼兰染色对培养的原代成纤维细胞存活率进行鉴定;采用细胞计数对培养的成纤维细胞生长趋势进行鉴定。结果:四种方法均能培养成纤维细胞,但单酶消化60 min可一次性提取较多细胞,并且细胞状态佳,3 d即可传代。72 h成纤维细胞Vimentin免疫荧光染色阳性率高达97%。台盼兰染色可见其细胞死亡率明显降低,并且细胞计数可见细胞生长状态极佳。结论:单酶消化60 min是提取成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的高效、快速、稳定的实验方法,为心脏疾病的基础及临床研究提供了较为理想的细胞学实验模型。     

水生无脊椎动物细胞培养

目前水生无脊椎动物的细胞培养研究远远落后于哺乳动物和昆虫的培养研究,其培养方法基本仍是套用哺乳动物或昆虫的细胞培养模式。尽管在几十年中进行了一些探索,而且原代培养也取得了一些进展,但到目前为止除了淡水蜗牛胚胎BGE细胞系外,其他动物都还没有成功的建立长时间持续传代的细胞系。现对水生无脊椎动物细胞培养的研究进行综述,并对所面临的主要困难进行了总结,对水生无脊椎动物细胞培养的前景提出了一些看法。     

小鼠主动脉血管平滑肌原代细胞的分离培养及鉴定

目的:血管平滑肌细胞在人类心血管疾病中具有重要的作用,而作为重要的遗传学研究模式生物的小鼠血管平滑肌材料有限,因此建立一种简单高效的小鼠血管平滑肌原代细胞分离培养方法很重要。方法:分离小鼠主动脉中膜层,胶原酶消化法获得原代平滑肌细胞,免疫荧光方法检测细胞的纯度和分化状态;分离平滑肌细胞特异的报告小鼠的平滑肌细胞,LacZ染色鉴定。结果:用该方法分离的原代平滑肌细胞生长迅速,3d后即可达5×106个。免疫荧光显示,细胞传至第3代后纯度在98%以上,细胞传至8代分化状态没有改变。LacZ染色鉴定报告小鼠分离的3代平滑肌细胞98%以上显示特异的蓝染。两种实验证明,应用此方法分离原代平滑肌细胞可以满足平滑肌体外功能实验的需求。结论:与传统的组织块培养法相比,该方法操作简便、经济,可以获得更多高纯度的血管平滑肌细胞。     

神经脊来源许旺细胞的体外培养研究

目的:探讨坐骨神经中神经脊来源的许旺细胞所占的比率。方法:将Wnt1-Cre+/-与Rosa-EGFP+/-小鼠杂交,获取Wnt1/EGFP小鼠,其所有起源于神经脊的细胞都有EGFP蛋白表达。取其坐骨神经,经过消化分离纯化,获得许旺细胞。进行抗GFP免疫荧光染色和流式分析的检测。结果:根据P1代许旺细胞的形态学观察,其纯度约为60%。抗GFP免疫荧光染色显示,并非所有的许旺细胞均呈阳性。P3代许旺细胞的纯度约为99%,流式细胞术分析显示约65%左右的GFP阳性率。结论:小鼠坐骨神经中的许旺细胞在体外培养提纯后,神经脊起源的许旺细胞占总许旺细胞的比例约为65%。     

大鼠脑微血管内皮细胞的分离与原代培养

为了建立大鼠脑微血管内皮细胞体外培养模型,探索纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞分离和原代培养的方法并进行形态学观察。采用2～3周龄的SD大鼠,解剖得到大脑皮质,两次酶消化及牛血清白蛋白或葡聚糖和Percoll梯度离心获得较纯的脑微血管段后,接种于涂布基质的培养皿进行原代培养;培养的细胞采用相差显微镜形态学观察、透射电镜观察及Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测鉴定。结果发现,培养12h即可见细胞从贴壁的脑微血管段周围长出,细胞呈短梭形,区域性单层生长,5～7天内皮细胞融合,内皮细胞纯度达90％以上;内皮细胞的贴壁和生长有赖于所涂布的基质,纤连蛋白／Ⅳ型胶原优于鼠尾胶和明胶;Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测内皮细胞表达阳性,透射电镜观察可见相邻内皮细胞间存在紧密连接结构。提示该方法能成功进行纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养,可用于脑微血管内皮的生理、生化及药理学研究,亦可用于构建大鼠血脑屏障模型。     

Evidence That Secondary Rat Schwann Cells in Culture Maintain Their Differentiated Phenotype

Schwann cells, on receiving the correct signal, will encircle an axon and wrap it with a myelin sheath. To begin examining some of the mechanisms underlying the process of myelination in vitro, we isolated Schwann cells from the sciatic nerves of neonatal rats and generated large cell populations with cholera toxin. The immunological and biochemical properties of these secondary Schwann cells were characterized after five to seven passages in the absence of axonal contact. These cells continued to express antigens found in both myelinating (P0 and 2',3'-cyclic nucleotide phosphohydrolase) and nonmyelinating cells in vivo (A5E3 and glial fibrillary acidic protein) in addition to the markers common to both types of cells (Ran-1, 217c, S-100, and laminin). Biochemical analyses showed that these cells synthesize the very-long-chain fatty acids (22-26 carbon atoms) found in myelin membranes. Moreover, the enzymes required for the synthesis of myelin glycolipids (including sphingosine acyltransferase, UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase, and cerebroside sulfotransferase) were still active, and metabolic labeling studies showed that galactocerebroside and sulfatide were synthesized even though the galactocerebroside pool was insufficient to be detected by immunostaining. Secondary Schwann cells also synthesized four species of myelin basic protein and the major structural glycoprotein in myelin, P0. The pathway necessary for glycosylation of P0 protein remained active, and an analysis of the oligosaccharide chain revealed that approximately 70% was processed to a complex form. In summary, we found that secondary Schwann cells still express most of the immunological markers of differentiated cells and continue to synthesize low levels of myelin components. Therefore, Schwann cells do not dedifferentiate in culture, as previously believed.     

成年大鼠嗅鞘细胞与嗅觉神经成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的 建立一种原代提取嗅鞘细胞与嗅觉神经成纤维细胞混合培养的方法.方法 自2.5月龄SD大鼠嗅球最外两层分离嗅鞘细胞和嗅觉神经成纤维细胞进行混合培养,并不进行纯化,分别于7 d、10 d、14 d行免疫细胞化学鉴定,并计算各个时间点嗅鞘细胞的纯度.结果 体外培养的嗅鞘细胞主要呈两极或多极状,而嗅觉神经成纤维细胞则成扁平的像成纤维细胞的形态,免疫细胞化学结果显示嗅鞘细胞呈p75 NGFR阳性,嗅觉神经成纤维细胞呈fibronectin阳性,两种细胞都呈vimentin阳性,在7 d、10 d、14 d各个时间点嗅鞘细胞分别占混合培养的34.1%、25.6%、8.6%.结论 从成年大鼠嗅球最外两层分离的培养中主要包含嗅鞘细胞和嗅觉神经成纤维细胞,嗅鞘细胞在混合培养中所占的比例随培养时间的延长而逐渐降低.     

犊牛前脂肪细胞的原代培养

为了建立犊牛前脂肪细胞原代培养模式,以便深入地研究奶牛脂肪组织增生的生物学特征。选用犊牛小肠网膜,采用原代消化细胞培养法培养出梭形细胞;同时以皮肤组织的成纤维细胞培养作为对照。结果显示：培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高。经形态学动态变化的观察,生长曲线及油红O脂肪染色抽取法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞,并在体外重现了其增殖的全过程。因此,在犊牛小肠网膜中存在着可分化成熟的、生成脂肪的前脂肪细胞。为进一步研究与肥胖、胰岛素抵抗相关的疾病如奶牛酮病、脂肪肝等打下了基础。     

Primary Cell Cultures for Understanding Rat Epididymal Inflammation

Treatment‐induced epididymal inflammation and granuloma formation is only an occasional problem in preclinical drug development, but it can effectively terminate the development of that candidate molecule. Screening for backup molecules without that toxicity must be performed in animals (generally rats) that requires at least 2 to 3 weeks of in vivo exposure, a great deal of specially synthesized candidate compound, and histologic examination of the target tissues. We instead hypothesized that these treatments induced proinflammatory gene expression, and so used mixed‐cell cultures from the rat epididymal tubule to monitor the induction of proinflammatory cytokines. Cells were exposed for 24 hr and then cytotoxicity was evaluated with the MTS assay and mRNA levels of Interleukin‐6 (IL‐6) and growth‐related oncogene (GRO) were measured. We found that compounds that were more toxic in vivo stimulated a greater induction of IL‐6 and GRO mRNA levels in vitro. By relating effective concentrations in vitro with the predicted C_eff, we could rank compounds by their propensity to induce inflammation in rats in vivo. This method allowed the identification of several compounds with very low inflammatory induction in vitro. When tested in rats, the compounds produced small degrees of inflammation at an acceptable margin (approximately 20×), and have progressed into further development     

乳鼠坐骨神经植块法的雪旺氏细胞培养

目的:改善并建立一种新的大鼠雪旺氏细胞(SCs)的培养方法,为研究外周神经损伤修复模型及其它外周神经相关实验提供高纯度、多数量的SCs。方法:麻醉后显微镜下解剖并分离新生3天内SD大鼠的坐骨神经,采取植块培养的方法,显微镜下尽量剥除坐骨神经纤维外膜,并梳理松解坐骨神经的神经纤维束。梳理后剪碎坐骨神经,每小块种植于培养皿中,使用纯血清培养4小时,再加入正常的DMEM/F12培养基,消化培养2-3代。最后用S-100及GFAP免疫荧光染色进行纯度鉴定。结果:本实验在总结前人实验的基础上,联合创新采用坐骨神经外膜剥除、神经内膜梳理、纯血清培养以及胰酶差速消化等方法,短时间内获得SCs的纯度可达99%以上,可用于进一步对雪旺氏细胞的功能进行研究。结论:这种选用乳鼠坐骨神经植块、血清培养的方法简单易操作,无需额外的生长因子及抑制因子,可在短期内获得大量高纯度的SCs。