谢氏宽漠王β-actin基因cDNA克隆、序列分析及表达量检测

β-actin是actin家族的一员,在维持细胞结构、运动和分裂等细胞生理活动方面发挥着重要作用,是基因定量实验中最常用的内参之一。本实验采用同源克隆和RACE技术扩增得到谢氏宽漠王Mantichorula semenowi β-actin基因。序列分析结果表明,该基因cDNA全长1 372 bp,开放阅读框长1 131 bp,编码376个氨基酸,5′和3′末端非翻译区域(UTR)分别为66 bp和175 bp;该序列与其他动物β-actin基因核苷酸序列具有96%～99%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示热激后不同恢复时间其表达量无明显变化,且与未经热激处理的对照相比无显著差异。表明β-actin是研究受外界环境胁迫作用下昆虫体内不同基因表达水平的可靠内参基因。     

粘虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫(Mythimna separata(Walker))cDNA为模板,对甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因进行克隆获得全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对GAPDH全长cDNA序列及推测得到的GAPDH蛋白序列进行分析.结果表明,获得的粘虫GAPDH基因cDNA序列长度为1 317 bp,其中包括80 bp的5′非编码区、238 bp的3′非编码区和999 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),编码一个332个氨基酸蛋白,具有GAPDH蛋白家族的两个功能结构域.该GAPDH蛋白理论相对分子质量为35.498 6 kDa,等电点为7.63,富含6种类型的特定功能位点.该蛋白序列与其他动物GAPDH蛋白序列具有77.4%～92.9%高度同源性.GAPDH基因表达量检测结果显示GAPDH在粘虫6种不同组织间表达量无显著差异(P0.05),表明GAPDH可作为研究粘虫功能基因表达量分析的可靠内参基因.该基因的cDNA序列已经递交GenBank并获得登录号为HM055756.     

棉铃虫β-actin基因的克隆、表达及多克隆抗体制备北大核心CSCD

克隆获得了棉铃虫β-actin基因,生物信息学分析表明,基因序列长1 131 bp,编码376个氨基酸,理论分子量为41.77 k D,理论等电点5.16。氨基酸序列与其他物种肌动蛋白比较有98%-99%的一致性,与鳞翅目的家蚕具有99%的一致性。分析棉铃虫β-actin和小家鼠β-actin的抗原决定簇位点,发现两者抗原表位有70.63%的一致性。同时原核表达、纯化了棉铃虫β-actin蛋白,Western-blot结果表明表达正确。将纯化后的蛋白免疫ICR小鼠4次后,小鼠抗血清效价最高可达388 800,并且能与天然棉铃虫蛋白特异性结合。     

凡纳滨对虾β-actin基因的克隆与表达

目的:克隆凡纳滨对虾肌动蛋白基因并在原核表达系统中表达.方法:根据GenBank上凡纳滨对虾β-actin基因序列设计引物,采用RT-PCR方法,从凡纳滨对虾肌肉组织中克隆出β-肌动蛋白基因cDNA部分序列,克隆序列连接到pBAD/gⅢA质粒,转化人大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,进行温度诱导表达重组蛋白.结果:克隆序列长度为1300bp,测序结果与Gene-Bank序列同源性达99.91%;获得重组体诱导表达产物经SDS-PAGE分析,在约48kD处有表达的蛋白带,表达产物经Western Blotting鉴定为阳性.结论:获得β-actin基因在大肠杆菌中稳定表达产物.     

虾夷扇贝β-actin基因的克隆和序列分析

为进一步研究虾夷扇贝功能基因的表达调控。利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了健康虾夷扇贝外套膜和肾脏两种组织的cDNA文库。对随机选取的4009个克隆进行5′端测序,比对,筛选出1条β肌动蛋白同源序列,对此EST序列两端进行扩增、测序,得到肌动蛋白基因cDNA全长序列。肌动蛋白基因cDNA全长1536bp(不包括polyA),5′端非编码区84bp,3′端非翻译区321bp,阅读框1131bp,编码377个氨基酸。在基因组DNA中,该基因被一个内含子分为两段,内含子位于第41和第42个氨基酸之间,长度为1498bp。系统发育分析显示该肌动蛋白属于β类型。本研究得到的虾夷扇贝β-肌动蛋白基因可以被用于作为定量某种虾夷扇贝mRNA的标准,这为继续研究虾夷扇贝其它功能基因,及其分子生物的进一步研究、促进其他相关分子发育和系统进化研究奠定了基础。     

粘虫类钙粘蛋白基因的克隆、序列分析及时空表达

昆虫中肠膜类钙粘蛋白（cadherin-like protein, CLP）是苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis (Bt)毒素的重要受体之一, 与Bt毒素的杀虫作用机制以及昆虫对Bt毒素的抗性等密切相关。本研究应用RT-PCR和RACE技术, 克隆了迁飞性重要害虫粘虫Mythimna separata类钙粘蛋白基因全长cDNA序列（命名为Msclp, GenBank登录号为JF951432）, 全长5 642 bp, 编码1 757个氨基酸, 推导的氨基酸序列具有昆虫类钙粘蛋白的特征结构, 包括1个信号肽、 1个前蛋白区、 12个钙粘蛋白重复、 1个近膜区、 1个跨膜区和1个胞质区。预测的分子量和等电点分别为196.786 kD和4.5。该蛋白与同科的烟夜蛾Helicoverpa assulta、 烟芽夜蛾Heliothis virescens、 棉铃虫Helicoverpa armigera及甜菜夜蛾Spodoptera exigua的类钙粘蛋白亲缘关系最近, 氨基酸序列一致性分别为61.77%, 61.66%, 61.26%和58.14%。荧光定量RT-PCR分析表明, 该类钙粘蛋白基因在不同龄期的粘虫幼虫中表达量差异极显著(P<0.01), 其中4龄幼虫相对表达量最高, 但与3龄、 6龄幼虫并没有显著性差异; 1和2龄幼虫表达量最低; 表达部位主要在粘虫中肠, 在中肠以外的虫体其他部位表达量极低。这些结果对于揭示转Bt作物对非靶标、 迁飞性粘虫的杀虫作用机制以及评价其潜在的对Bt毒素抗性机制等奠定了基础。     

黄鳝β-actin基因的克隆及其在鱼类中的系统发生分析

β-actin是actin家族的一员,在维持细胞结构,细胞内运动,细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用。克隆的黄鳝β-actin基因的cDNA全长1860bp,编码375个氨基酸,在脊椎动物中不同物种的β-actin基因之间的序列同源性超过了98％。RT-PCR表明克隆的黄鳝β-actin基因在睾丸、卵巢、心、肝、脾、脑等组织中广谱表达。基于目前已知的全部鱼类β-actin cds,构建了进化树。星形辐射的树型结构一致支持将鱼类β-actin基因划分为4类。到目前为止,所有的鱼都没有发现拥有全部4个β-actin基因。这暗示伴随着鱼类的辐射式进化历程,可能发生了种系特异性的β-actin的丢失。     

粘虫核糖体蛋白S7 cDNA的克隆和表达分析

运用RT-PCR和RACE技术克隆了粘虫Mythimna separata(Walker)核糖体蛋白S7基因(RPS7)的全长cDNA序列(GenBank登录号:JN582331),并对其进行生物信息学分析。结果表明,粘虫RPS7全长cDNA序列为762 bp,包括5'非编码区32 bp和3'非编码区67 bp。其开放阅读框(573 bp)编码190氨基酸肽链,具有核糖蛋白S7e蛋白家族典型特征。该肽链理论分子量为21.924 ku,等电点为9.82,富含4种类型的特定功能位点。该蛋白序列与其他动物RPS蛋白序列具有96.8%～98.2%高度同源性。应用荧光实时定量技术建立了粘虫脑部胚后发育RPS7表达模式。RPS7表达量随胚后发育脑部重建呈现出动态变化,这一结果显示RPS7是在转录水平上呈现发育性调节。     

粘虫核糖体蛋白S7cDNA的克隆和表达分析

运用RT—PCR和RACE技术克隆了粘虫Mythimnaseparata（Walker）核糖体蛋白s7基因（RPS7）的全长eDNA序列（GenBank登录号：JN582331）,并对其进行生物信息学分析。结果表明,粘虫RPS7全长eDNA序列为762bp,包括5’非编码区32bp和3’非编码区67bp。其开放阅读框（573bp）编码190氨基酸肽链,具有核糖蛋白S7e蛋白家族典型特征。该肽链理论分子量为21．924ku,等电点为9．82,富含4种类型的特定功能位点。该蛋白序列与其他动物RPS蛋白序列具有96．8％-98．2％高度同源性。应用荧光实时定量技术建立了粘虫脑部胚后发育RPS7表达模式。RPS7表达量随胚后发育脑部重建呈现出动态变化,这一结果显示RPS7是在转录水平上呈现发育性调节。     

羊驼催乳素基因cDNA克隆及序列分析

实验通过克隆分析羊驼催乳素基因的部分序列,对羊驼催乳素基因的结构和功能进行初步探索和揭示。从GeneBank中已报到的脊椎动物催乳素基因保守区设计一对引物,采用Trizol法提取羊驼胎盘总RNA,利用RT-PCR技术扩增出长度约为510 bp的片断。测序后在NCB I工作平台中进行BLASTn同源性比较,得出结论:羊驼催乳素基因与已登录的哺乳动物催乳素基因同源性均超过85%,最高达97%。借助DNAstar分子生物学分析软件绘制了相关动物的遗传进化图,并对羊驼的种属地位进行了进一步验证。。     

二化螟β1微管蛋白基因cDNA序列的克隆与序列分析

微管是真核生物体内分布最为广泛的一类蛋白,是由a-和β-两种不同的微管蛋白组成的异源二聚体.微管参与许多细胞功能,如细胞形态发生、细胞生长和分裂等.以二化螟3龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),扩增得到该虫的β微管蛋白基因的cDNA序列一条.cDNA序列含1 862个碱基,开放读码框1 344个碱基,编码氨基酸447个,分子量约为50.2kD,等电点4.82.氨基酸序列中1～4个氨基酸MREI为β微管蛋白转录后调控信号,是微管蛋白特异片段;氨基酸序列的140～146GGGTGSG位存在一个微管蛋白标志信号片段.序列比对表明,克隆的β微管蛋白基因与其他昆虫的β微管蛋白基因在核苷酸和氨基酸水平上都是高度同源的,与家蚕Bombyx moriβ1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到99.1%,与烟草天蛾β1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到98.7%,与果蝇Drosophila melanogasterβ1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到96.9%.该基因cDNA序列已经登录Genbank并获得登录号为EU429675.     

准噶尔雅罗鱼β-肌动蛋白基因启动子克隆及序列分析

利用PCR方法克隆了准噶尔雅罗鱼(Leuciscus merzbacheri)的β-actin基因启动子片段SZ21,大小是2398bp。对克隆的启动子序列进行了转录调控元件的生物信息学预测分析,同时,基于启动子中包含的开放阅读框和内含子序列,探讨了准噶尔雅罗鱼与鲤鱼(Cyprinus carpio)、草鱼(Ctenopharyngodon idella)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)、团头鲂(Megalobrama amblycephala)、泥鳅(Misgurnus mizolepis)间的系统进化关系。结果显示,该启动子序列的3个核心启动子转录元件:CAAT-box、CArGmotif和TATA-box分别在转录起始位点(+1)上游的-89、-59、-26处,序列中还含有MEF2、SATB、CHRF、INRE、MTEN、E-box、RU49、ZBPF、CREB、Enhance region、CEBP位点等多种转录调控元件。在剪接体内含子中,剪接位点遵循GT…AG法则。启动子SZ21序列含有3个内含子和155个氨基酸。内含子1、内含子2、内含子3的系统发育分析表明,团头鲂与草鱼和青鱼的亲缘关系要比与准噶尔雅罗鱼的更近一些,这与传统分类中的亲缘关系显示不一致,其原因尚需探讨。     

黑曲霉bgl基因的cDNA克隆及序列分析

通过一步法提取黑曲霉AS3．796的总RNA,利用依据其他黑曲霉β-葡萄糖苷酶（bgl）基因序列设计的一对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增得到了该菌bgl基因cDNA片段。将目的片段与pGEM-T载体连接并转入大肠杆菌。序列测定结果表明该cDNA片段大小为2583bp,其基因序列与已公布的其它黑曲霉bgl基因的同源性最高可达99％。蛋白质分析结果表明该β-葡萄糖苷酶属于糖苷水解酶家族3成员。     

北极狐GHR基因cDNA的克隆及序列分析

本文根据狗(AF133835)的GHR基因cDNA编码全序列设计了三对引物,利用RT-PCR方法克隆出北极狐GHR基因编码区全长cDNA序列(GenBank accession No.EU304325)。结果表明,北极狐GHR的ORF为1917bp,编码638个氨基酸的前体蛋白,由18个氨基酸的信号肽和620个氨基酸的成熟肽组成。通过同源性比较发现北极狐与狗的同源性最高,达到98%。另外,利用邻接法(NJ法)构建的分子系统进化树聚类结果表明,北极狐与狗先聚为一类,该聚类结果与传统的物种进化关系基本一致。另外,通过氨基酸对位序列比较发现,北极狐GHR在氨基酸序列上存在明显的特异性,如45和451位分别为A和E,而其它物种均分别为T(大鼠为K)和A(牛羊为V,鼠为T)。     

白纹伊蚊β-actin基因实时荧光定量RT-PCR方法的建立

目的建立白纹伊蚊β-actin基因实时荧光定量RT-PCR法.方法 根据GenBank上白纹伊蚊β-actin基因的序列(GenBank accession number: DQ657949),利用Primer Express 3.0软件设计并合成一对引物,采用SYBR Green I作为染料建立实时荧光定量RT-PCR 法.以Ct值为纵坐标,以稀释倍数的对数为横坐标,建立标准曲线,并进行溶解曲线分析.结果标准曲线Ct 值检测范围为15～30,扩增效率为97.9%,相关系数为0.996,溶解曲线分析结果显示产物为特异的单峰,其Tm 值为86.4℃.结论 成功建立白纹伊蚊β-actin 基因实时荧光定量RT-PCR 法,为β-actin 基因作为内参基因进行白纹伊蚊功能基因表达差异研究奠定基础.     

八字地老虎和粘虫蜕皮激素接受子3(HR3)基因cDNA序列的克隆与序列分析

蜕皮激素接受子3(hormone receptor 3,HR3),是一种蜕皮调节转录因子,调控蜕皮过程中相关基因的表达,是蜕皮级联反应中的关键因子。本文以八字地老虎Agrotisc-nigrumL.和粘虫Mythimna separata Walker预蛹期幼虫为材料,分别提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),分别扩增得到2种昆虫蜕皮激素接受子3(HR3)的5′非编码区和完整开放读码框在内的cDNA序列,其中八字地老虎的HR3 cDNA序列含有1729个碱基,包括一个1533个碱基的开放阅读框,编码一个含510个氨基酸的蛋白,分子量约为57.5ku。粘虫的HR3cDNA序列含有1743个碱基,包括一个1536个碱基的开放阅读框,编码一个含511个氨基酸的蛋白,分子量约为57.9ku。这2种昆虫HR3 cDNA序列推导的氨基酸序列均具有昆虫核受体超家族特征性结构域,与其他昆虫,尤其是鳞翅目昆虫的蜕皮激素接受子3的氨基酸序列高度同源。获得的基因cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号,八字地老虎HR3登录号为GU188853,粘虫HR3登录号为GU188854。     

小地老虎β-微管蛋白基因cDNA序列的克隆、序列分析和表达检测

β-微管蛋白在昆虫生长发育、信号传导、抗药性等方面具有重要作用.本研究以小地老虎Agrotis ypsilon(Rottemberg)3龄幼虫为材料,利用RT-PCR、cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆得到小地老虎β-微管蛋白基因的cDNA序列,命名为AgTubB(GenBank登录号:JN029962),并检测...     

大鼠脑谷氨酸脱羧酶基因的cDNA克隆及序列分析

胰岛β－细胞自身抗原蛋白之一是脑中谷氨酸脱羧酶（Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ,ＧＡＤ,ＥＣ４．１．１．１５）同源物,以双链ｃＤＮＡ为模权,用ＰＣＲ方法快速克隆了Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑ＧＡＤ基因的ｃＤＮＡ将此包括编码５９３个氨基酸的全长ＤＮＡ片段重组入ｐＵＣ质粒并用双脱的氧末端终止法测定了全部序列,证明其全长为１７７９ｂｐ,经比较发现Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑与Ｒｕｓｓｅｌｌ报导的大鼠脑Ｇ     

绵羊EGFR基因的克隆、表达及序列分析

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是酪氨酸激酶受体家族成员之一,不仅参与细胞增殖、生长和凋亡等多种生命活动,也可调节哺乳动物的乳腺发育及泌乳维持,但对绵羊EGFR基因的序列特征及组织表达情况鲜有报道.本试验以高泌乳量的小尾寒羊(泌乳高峰期和空怀期)及低泌乳量的甘肃高山细毛羊(泌乳高峰期)母羊为研究对象,利用RT-PCR、克隆及测序技术获得绵羊EGFR基因完整的CDS区,分析了 EGFR蛋白的结构特征及理化性质,利用RT-qPCR技术研究了基因的组织表达情况.结果表明,绵羊EGFR基因CDS区全长为3 627 bp,编码1 208个氨基酸.绵羊EGFR的氨基酸序列在各物种间较保守,与黄牛EGFR的氨基酸序列同源性最高.EGFR为跨膜蛋白,包含111个磷酸化位点,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主.网络互作分析表明EGFR蛋白与肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、表皮调节素(EREG)、双调蛋白(AREG)及生长因子受体结合蛋白2(GRB2)结合发挥作用.EGFR主要参与MAPK,PI3K/AKT,JAK/STAT及Wnt信号通路,从而参与了动物的乳腺发育及泌乳功能的调节.RT-qPCR结果表明,绵羊EGFR基因的表达具有组织特异性、时空特异性和品种特异性.该基因在所研究的8个组织中均表达,但在肾脏、卵巢、肝脏、乳腺和肺脏组织中的表达量较高;在小尾寒羊的乳腺组织中,该基因在空怀期的表达量显著高于泌乳高峰期的(P＜0.05);在泌乳高峰期的乳腺组织中,该基因在小尾寒羊中的表达量高于甘肃高山细毛羊的.本试验为深入研究绵羊EGFR基因的泌乳生物学功能提供了基础数据.     

百合ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆及序列分析

以亚洲百合Polyanna(Liliumspp.)花瓣为材料,根据已报道的百合ACC氧化酶基因片段设计1对末端扩增特异引物,采用RACE方法,获得百合ACC氧化酶基因的全长cDNA(GenBank登录号为EU296623).该cDNA全长1 152 bp,具有一个954 bp的开放阅读框,编码318个氨基酸.Blast搜索结果显示,百合ACC氧化酶基因核苷酸序列与其它植物已报道的ACC氧化酶基因具有71%~82%的相似性,氨基酸序列有70%~87%的相似性,聚类分析表明,与单子叶植物百合科郁金香首先聚类,其次与双子叶植物聚类,最后与单子叶禾本科和兰科植物聚类.