重组CHO细胞HBsAg 纯化工艺的优化

目的：优化重组CHO细胞HBsAg纯化工艺。方法：由乙肝病毒S基因转化的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养收液,经初步提纯、密度梯度离心、凝胶过滤层析可得到HBsAg纯品。结果：通过凝胶过滤层析收取HBsAg活性峰,控制HBsAg活性峰的收量,并把HBsAg活性峰的下降段再收集起来重新层析,改进后可使HBsAg的总回收率达到60％以上,而且牛血清蛋白残余量达到10mg/ml以下,HBsAg纯度97％以上。结论：重组CHO细胞HBsAg纯化工艺改进后,使HBsAg在产量及质量上均有明显提高。     

huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白的复性及纯化研究

利用Q Sepharose H.P.离子交换柱层析在8mol/L尿素变性条件下对huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184）融合蛋白进行初步纯化,然后再利用Sephacryl S-200分子筛柱层析复性及纯化后获得目的蛋白,其纯度达到95％以上。该纯化方案成功地解决了稀释复性或透析复性产物在进行Q Sepharose H.P.离子交换柱层析时目的蛋白不稳定而沉积于柱上的问题,获得了较好的复性效果,复性率达到80％以上。使用该纯化方案,1天内便可基本完成重组蛋白的复性及纯化过程,而且也便于扩大。     

层析法去除重组人血清白蛋白干扰素a2b融合蛋白的内毒素

用柱层析方法在生产重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白过程中去除产品中的内毒素。所用柱层析组合为Blue-sepharose亲和柱层析、SOURCE 15 ISO疏水柱层析、Q Sepharose F.F.离子交换柱层析、Sephadex G25 Coarse凝胶过滤柱。采用鲎试剂法检测柱层析各阶段得到蛋白中的内毒素含量; 并用RP-HPLC方法测定柱层析各阶段得到蛋白的纯度与浓度, 求出每毫克蛋白的内毒素含量。结果为每步柱层析过程式均有去除内毒素的作用, 最终所得蛋白的内毒素含量降为1 EU/mg, 去除率达到99.9%。因而生产重组人血清白蛋白干扰素a2b融合蛋白所用分离纯化柱层析技术在纯化蛋白的同时能有效的去除产品中内毒素, 所得产品内毒素的含量远低于药典对注射剂的内毒素含量要求。     

层析法去除重组人血清白蛋白干扰素a2b融合蛋白的内毒素

用柱层析方法在生产重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白过程中去除产品中的内毒素。所用柱层析组合为Blue-sepharose亲和柱层析、SOURCE 15 ISO疏水柱层析、Q Sepharose F.F.离子交换柱层析、Sephadex G25 Coarse凝胶过滤柱。采用鲎试剂法检测柱层析各阶段得到蛋白中的内毒素含量; 并用RP-HPLC方法测定柱层析各阶段得到蛋白的纯度与浓度, 求出每毫克蛋白的内毒素含量。结果为每步柱层析过程式均有去除内毒素的作用, 最终所得蛋白的内毒素含量降为1 EU/mg, 去除率达到99.9%。因而生产重组人血清白蛋白干扰素a2b融合蛋白所用分离纯化柱层析技术在纯化蛋白的同时能有效的去除产品中内毒素, 所得产品内毒素的含量远低于药典对注射剂的内毒素含量要求。     

层析法去除重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白的内毒素

用柱层析方法在生产重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白过程中去除产品中的内毒素.所用柱层析组合为Blue-sepharose亲和柱层析、SOURCE 15 ISO疏水柱层析、Q Sepharose F.F.离子交换柱层析、Sephadex G25 Coarse凝胶过滤柱.采用鲎试剂法检测柱层析各阶段得到蛋白中的内毒素含量;并用RP-HPLC方法测定柱层析各阶段得到蛋白的纯度与浓度,求出每毫克蛋白的内毒素含量.结果为每步柱层析过程式均有去除内毒素的作用,最终所得蛋白的内毒素含量降为1 EU/mg,去除率达到99.9%.因而生产重组人血清白蛋白干扰素α2b融合蛋白所用分离纯化柱层析技术在纯化蛋白的同时能有效的去除产品中内毒素,所得产品内毒素的含量远低于药典对注射剂的内毒素含量要求.     

两步柱色谱法纯化 CHO 表达的重组人β神经生长因子（β-rhNGF）

基因重组技术生产蛋白药物较传统提取生产方式具有诸多优点。本文运用一步离子交换色谱层析（Sepharose Fast Flow）和反相(C4)色谱层析串联纯化了CHO 工程细胞株分泌表达的重组人β 神经生长因子（β-rhNGF）,纯化产物经SDS-PAGE及反相HPLC 分析纯度均达到 95% 以上,生物学活性经 PC12 细胞和鸡胚背根神经节测定均与 Sigma 标准品无差异。产物经两步纯化后的收率达70% 以上,为建立该产品切实可行的工业化纯化工艺提供了依据。     

huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白的复性及纯化研究

利用Q Sepharose H.P.离子交换柱层析在8mol/L尿素变性条件下对huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白进行初步纯化,然后再利用Sephacryl S-200分子筛柱层析复性及纯化后获得目的蛋白,其纯度达到95%以上。该纯化方案成功地解决了稀释复性或透析复性产物在进行Q Sepharose H.P.离子交换柱层析时目的蛋白不稳定而沉积于柱上的问题,获得了较好的复性效果,复性率达到80%以上。使用该纯化方案,1天内便可基本完成重组蛋白的复性及纯化过程,而且也便于扩大。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂(rht-PA)及其突变体的纯化

稳定高效表达重组人组织型纤溶酶原激活剂 (rht PA)的CHO细胞株和表达组合突变体的细胞株进行了 3L转瓶培养 .将培养上清分别进行了Lys Sepharose 4B亲和层析和Zn2 + Sepharose 4B层析两步纯化 ,rht PA纯度提高了 5 34倍 ,比活达 2 5× 10 5IU mg ,产率为 73% ;突变体纯度提高了1119倍 ,比活达 5 9× 10 5IU mg ,产率为 6 9% .纯化产物SDS PAGE分析显示 ,rht PA和突变体基本都呈单一条带 ,扫描分析均达到 98%以上纯度 .rht PA和突变体在纯化系统中的行为作对照分析发现 ,突变体的构建思想在Lys Sepharose 4B亲和层析过程中有充分体现 .这两步层析组合是很好的纯化t PA及其突变体的方法 ,尤其是Lys Sepharose 4B纯化突变体效果更好     

重组人蛋白激酶CK 2α亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶 CK2 α亚基 c DNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,IPTG诱导后获特异高效表达 ,表达蛋白占菌体总蛋白的 30 % ,但大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物依次进行 DE- 5 2、P1 1磷酸纤维素和肝素 - Sepharose柱层析分离 ,最后从 30 9mg可溶性蛋白质中得到 6.1 mg纯化蛋白 . SDS- PAGE显示纯化的蛋白质为一分子量 4 2 k D的单一蛋白带 .Western- blot的结果证明 :纯化的表达产物与抗人 CK2α抗体可发生特异性免疫反应 . CK2α和β亚基等摩尔分子混合可组成有完全活性的全酶 .重组的 CK2全酶的性质和功能与该酶的已知特性一致 .这些结果证明重组蛋白是人蛋白激酶 CK2 α亚基     

二甲基亚砜作用下重组CHO细胞胞内乙型肝炎表面抗原的定位

在培养环境中添加二甲基亚砜 (DMSO) 能分别提高重组 CHO 细胞乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的产量和比生产速率70%和3.2倍以上, 但同时发现胞内HBsAg 的积累量是对照组的7.2倍。为了分析胞内HBsAg 积累的区域,采用电镜技术分析后发现,经DMSO处理后的CHO细胞胞内出现了很多的扩张区域,这些扩张区域分布整个胞浆,有的扩张区域已经侵蚀到细胞核上,而对照组未发现明显的扩张区域。进一步利用免疫电镜技术分析后发现,经DMSO处理后的细胞胞内大量积累的HBsAg主要分布在这些扩张区域中,同时发现在细胞核膜上也有分布,这可能是由于扩张区域侵蚀细胞核造成的。以上工作有助于揭示在DMSO作用下重组CHO细胞胞内HBsAg大量积累的机制。