二乙基亚硝胺诱发的大鼠肝癌癌前病变γ－GT活性定量研究

采用大鼠腹腔一次性注射二乙基亚硝胺（ＤＥＮ）作为启动剂结合部分肝切除的短期诱癌实验模型,应用图像分析法测定肝癌癌前病变内γ－谷氨酸转肽酶（γ－ＧＴ）活性的变化。实验结果发现Ⅰ组（ＤＥＮ＋ＰＢ）γ－ＧＴ活性高于Ⅱ组（ＤＥＮ＋Ｈ２Ｏ）;Ⅰ组第２０周γ－ＧＴ活性高于第１２周,表明苯巴比妥可以诱导γ－ＧＴ活性重现,且随着实验过程延长,γ－ＧＴ活性逐渐增高。本实验说明图像分析法可以结合形态学变化在组织原位测定肝癌癌前病变内的γ－ＧＴ活性,简便、易行,优于生化法,值得进一步推广。     

Sonic hedgehog在二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌发生过程中的表达及意义

观察肝脏组织中Sonic hedgehog(Shh)的表达情况,探讨其在肝癌发生发展过程中的作用.用二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)制备诱发型肝癌模型,利用光镜技术观察诱癌过程中肝组织的形态学改变,采用免疫组织化学二步法和RT-PCR技术检测Shh蛋白和mRNA的表达.根据形态学观察将诱癌过程分为正常对照组、肝损伤组、肝增生-硬化组和肝癌变组.Shh蛋白阳性表达的细胞主要分布在小叶间胆管上皮、肝细胞增生结节、癌周组织和癌结节中,在对照组、肝损伤期、肝增生-硬化期和肝癌变期的阳性表达率分别是6.67%、30.00%、52.94%和78.57%(χ2=17.49,P<0.05).Shh mRNA表达率随着肝癌的发生发展有逐渐增高的趋势(χ2=13.35,P<0.05),对Shh mRNA表达阳性的电泳条带进行图像分析结果显示Shh mRNA表达量随着肝癌的发生发展逐渐增高(F=110.26,P<0.05).Ptch mRNA表达率随着肝癌的发生发展有逐渐增高的趋势(χ2=19.83,P<0.05),对Ptch mRNA表达阳性的电泳条带进行图像分析结果显示Ptch mRNA表达量随着肝癌的发生发展逐渐增高(F=68.28,P<0.05).实验结果提示,Shh在肝癌发生发展过程中出现了异常活动,导致Shh信号通路激活并作用于肝的细胞,参与了诱导肝癌的发生发展.     

二乙基亚硝胺诱发肝癌的大鼠中维生素K依赖性羧化酶的研究

本文证明DENA诱发的大鼠肝癌结节中维生素K依赖性羧化酶活性显著降低,外源多肽羧化酶活性只有正常大鼠肝脏中的62.6％,而内源蛋白质前体羧化酶活性仅为27％。华法令能在正常大鼠肝脏中诱导羧化酶的合成,而这种诱导能力在诱癌晚期的肝癌大鼠肝脏中明显下降。上述结果说明肝癌细胞中维生素K依赖性羧化酶的合成受阻,造成肝癌组织中羧化酶的缺乏。诱癌过程中大鼠肝脏维生素K依赖性羧化酶活性和血浆异常凝血酶原水平形成良好的对应关系。随着肝癌组织的增大,肝癌细胞分泌入血的异常凝血酶原水平显著升高,诱癌第20周时的大鼠血浆中异常凝血酶原含量为正常大鼠的2.5倍。由此认为,肝癌组织由于不能合成足量的维生素K依赖性羧化酶,导致凝血酶原在成熟过程中羧化受阻,分泌入血形成高水平的异常凝血酶原。     

藻毒素MC-LR促二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌模型建立的方法

摘要肝癌动物模型有助于肝癌发病过程中分子机制的研究。二乙基亚硝胺（DEN）是一种众所周之的化学致癌剂,已被广泛用于动物肝癌模型的建立。藻毒素MC-LR是一种由蓝藻产生的环状七肽毒素,其低浓度的慢性毒性具有潜在的促癌作用。该实验以DEN联合不同浓度的藻毒素MC．LR通过腹腔注射共同诱发大鼠肝癌模型。从形态学、病理学角度分别观察大鼠肝脏外观和肝细胞的变化;从蛋白质水平运用免疫印迹法检测谷胱甘肽-S-转移酶（GST-Pi）的表达情况。结果表明,模型组中大鼠肝癌癌变过程大致经过肝细胞损伤期、肝细胞增生-硬化期和肝细胞癌变期三个阶段。其中,DEN联合终浓度为10pg／kg的藻毒素MC－LR处理时促癌效果最佳。该方法可作为一种新型的大鼠肝癌模型建立方法为今后的研究奠定基础。     

二乙基亚硝胺诱发大鼠肝脏癌变过程中醛缩酶同功酶基因表达的改变

二乙基亚硝胺诱发大鼠肝脏癌变时,伴随血清AFP浓度的升高,肝脏组织内醛缩酶活力和醛缩酶同功酶谱发生改变。在诱癌的前8周中,以FIP为底物的醛缩酶活力迅速下降,8周以后保持着较低的活力水平,而以FDP为底物的醛缩酶活力在前16周中变化不显著,在16周后迅速增高。所以对两个底物的活力比,正常成年大鼠肝脏是1.03,原发性肝癌是4.53,移植性肝癌BERH-2第71代是7.52。醋酸纤维薄膜电泳显示正常成年肝脏有醛缩酶B_4,B_3A_1区带,诱癌后B型醛缩酶区带减弱,诱癌4周出现醛缩酶A_4区带,诱癌12周出现A_1C_3区带,部分原发性肝癌中还出现醛缩酶C_4区带。实验结果说明肝癌发生过程中,醛缩酶B基因逐渐受到“封闭”,醛缩酶A基因和醛缩酶C基因依次逐渐“开放”。     

二乙基亚硝胺诱导大鼠肝癌模型的建立及评价

目的:通过间断小剂量二乙基亚硝胺(DEN)腹腔注射的方法,建立大鼠肝癌模型,并进行评价.方法:60只健康雄性SD大鼠随机分为C组(对照组,n=10)和M组(造模组,n=50),其中M组动物给予DEN腹腔注射,按体重20mg/kg给药,每周3次,至12周时停药.C组给予同等剂量和频率的生理盐水腹腔注射.观察两组动物不同时期肝脏大体变化及病理改变.结果:16周时诱癌成功率为76.2%(32/42).病理学结果显示,M组动物肝脏病变过程经历肝细胞损伤坏死期、肝细胞增生硬化期和肝细胞癌变期.结论:通过间断小剂量DEN腹腔注射的方法,成功建立了大鼠肝癌模型,该模型可作为一种理想的研究人类肝癌发生的动物模型.     

亚硝胺诱发大鼠膀胱癌动态过程的超微结构观察

本文以亚硝胺为致癌剂诱发大鼠膀胱癌。用电镜方法对灌药后不同周次的大鼠膀胱粘膜癌变的动态过程进行超微结构研究。观察表明：移行上皮非对称性单位膜的改变和多形性微绒毛形成、梭形小泡消失、微丝和连接复合体减少所致的壳层丧失、胞浆内溶酶体增多及戒指样细胞形成、核周纤维层不规则或消失等是膀胱粘膜上皮早期癌变的重要形态学指标。     

癌变原理研究——Ⅰ.二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌过程及发育过程中肝细胞增殖酶和组织特异酶活性的变化及其相互关系

本实验以二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌为动物模型,结合病理形态学研究了细胞增殖与组织特异代谢关键性酶ACT 及OCT,CPS_1活性的相互改变及其与癌变的关系,同时作了鼠肝发育过程中酶活性变化的比较研究。(1)根据DENA 引癌过程中酶活性CPS_Ⅰ/ACT,OCT/ACT 及ACT/CPS_Ⅰ,ACT/OCT 相对比值的变化,以及病理形态观察结果,DENA 引癌过程大致可分为三个阶段:喂DENA6周以内为单纯性增生期。此时期酶活性相对比值的改变是可逆的,与再生肝相似。第6周以后至16周为癌变期。此时期出现肝细胞异型性增生及癌变病灶。酶活性相对比值的改变是不可逆的。16周到30周为癌变细胞发展成为肝细胞癌期。(2)癌变过程中(喂DENA6周以后),OCT 及CPS_Ⅰ活性持续降低,同时ACT 活性持续增高。肝癌结节中OCT 及CPS_Ⅰ活性约为正常肝的10～20%,ACT 活性约为正常肝的2倍。癌变过程中这两类酶活性的相互改变与发育过程中的情况正好相反。在发育过程中,胚胎肝内OCT 及GPS_Ⅰ活性较成年水平低,而ACT 活性则较高。新生后CPS_Ⅰ及OCT 活性升高,同时ACT 活性降低。(3)肝与肝癌上述酶可能是相同的。因为酶活性的最适pH 和在聚丙烯酰胺凝胶电泳图上的分布都是一致的。肝与肝癌OCT 及ACT 的K_m 相同而V_m 不同,说明癌变过程中酶活性的变化,主要是由于酶蛋白量的改变。此外,肝癌线粒体的蛋白量减少,但OCT 及CPS_Ⅰ的比活性(单位/毫克线粒体蛋白)仍较正常肝线粒体的低。(4)讨论了增生和分化与癌变的关系。初步认为,肝细胞的癌变是反分化(分化逆转)问题,和正常分化一样系由于基因表现的改变,不一定包含基因结构的改变。就与癌变有关的细胞增殖和分化的矛盾而言,细胞增殖及其有关酶活性的增高,可能是癌变发生的基础,而组织特异功能及其关键性酶活性的降低,可能与癌变的关系更为密切。因此癌变的发生,可能是由于在细胞分裂过程中致癌物使肝细胞特异功能基因的调节控制失常,从而引起增生代谢与特异代谢关键性酶活性不可逆的改变,使之失去肝细胞增殖与特异功能的正常平衡,而代之以不受控制的增生,最后形成癌细胞。     

二乙基亚硝胺诱导大鼠肝癌组织CLDN1基因表达及其甲基化

目的探讨二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine,DEN）诱导大鼠肝癌发生中肝癌组织CLDN1基因表达及其启动子甲基化的规律。方法65只雄性Wistar大鼠随机选择40只作为模型组,其余作为正常组。模型组在1-12周饮用含DEN80mg／L的饮水以诱癌（每日8mg／kg）,各组在造模过程的第4周、8周、12周、16周随机5只取肝,第20周剩余大鼠取肝,应用RT-PCR方法检测肝组织CLDN1mRNA的表达,应用MSP法检测肝组织CLDN1启动子甲基化和非甲基化。结果模型大鼠病死率为10％（4／40）,正常组无死亡。至第20周,成瘤率达到100％。RT—PCR显示,与正常组比较,模型组在16周和20周CLDN1 mRNA表达下调（P〈0．05）,其他各周两组差异不显著。MSP结果表明,模型组肝组织CLDN1甲基化率达77．78％,而正常肝组织甲基化率为24％,两者比较差异有显著性（P〈0．01）。结论CLDN1启动子甲基化及CLDN1基因表达下调与大鼠肝癌病变相关,对其机制值得进一步深入研究。     

维甲酸对亚硝胺诱发大鼠肝癌的阻断作用

二乙基亚硝胺（ＤＥＮ）诱发大鼠肝癌过程中,可使肝中增殖指标γ－谷氨酰转肽酶（γ－ＧＴ）,谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）,胞液和膜性酪氨酸蛋白激酶（ｃ－ＴＰＫ,ｍ－ＴＰＫ）有不同程度的逐步升高,直至１６周（除ｃ－ＴＰＫ在第１２周活力最高外）,而分化指标精氨酸酶（ＡＧＮ）则明显降低,如在诱癌开始的同时给予全反式维甲酸（ＲＡ）连续１６周则可延缓γ－ＧＴ、ＧＳＴ和两种ＴＰＫ的升高和ＡＧＮ的降低,这种作用并非ＲＡ本身对酶活力的影响,而是ＲＡ阻断肝癌发展的结果。     

癌变原理研究Ⅱ.甲状腺素对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌过程及发育过程中肝细胞增殖酶及组织特异酶活性的影响

本实验观察到甲状腺素具有调节肝细胞增殖酶ACT及组织特异酶CPS_1,及OCT活性的功能,当甲状腺素引起新生二周鼠肝ACT的相对活性增高时,CPS_1及OCT的相对活性降低,但对新生二周以后至成年(10周)鼠肝酶活性的影响则相反。对年龄较大如30周的动物几无影响。甲状腺素对DENA诱发大鼠肝癌过程中肝内上述酶活性的相互影响,与发育过程的情况颇为相似。根据甲状腺素对DENA引癌过程中酶活性的影响,似可将前一报告中所划分的癌变期进一步分为癌变早期(即肝细胞进行癌变期)——喂 DENA 6—12周,及癌变后期(即癌细胞形成期)——喂DENA 12—19周。在癌变早期,甲状腺素对肝内CPS_1及OCT活性的诱导效应下降:对CPS_1/ACT及OCT/ACT活性相对比值的影响下降,同时对ACT/CPS_1及ACT/OCT活性相对比值的影响上升。在癌变后期,甲状腺素又使CPS_1及OCT的相对活性增高;使CPS_1/ACT及OCT/ACT活性相对比值上升,同时使ACT/CPS_1及ACT/OCT活性相对比值下降。 癌变后期的影响表明甲状腺素似有促使癌变了的细胞向正常分化的功能。     

喂二乙基亚硝胺大鼠肝染色质体外转录的研究

在二乙基亚硝胺(DENA)诱发大鼠肝癌过程中,无论在E.Coli RNA聚合酶或大鼠肝RNA聚合酶Ⅱ作用下,肝染色质的体外转录活性都比正常大鼠的高,并有随肝脏恶化程度而增高的趋势。进一步研究证明在RNA聚合酶Ⅱ作用下,喂DENA大鼠肝染色质的转录起始点数量比正常肝的多;而在E.Coli RNA聚合酶作用下,两种染色质的转录起始点数量未见明显差异,但喂DENA大鼠的肝染色质转录的RNA链较长。癌变过程中,肝染色质组蛋白及非组蛋白含量都无明显改变,而RNA含量则较正常肝略有增高。     

诱发大鼠肝癌早期病变中蛋白激酶和磷脂的变化

<正> 近年来发现蛋白激酶不但参与细胞的代谢调节,还与细胞的增殖和分化密切相关。除酪氨酸蛋白激酶是某些癌基因的表达产物外,钙-磷脂依赖性蛋白激酶(又称蛋白激酶C,PK-C)是促癌剂TPA(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-aeetatc)的受体。作者在前文中曾报导:分化诱导剂视黄酸可使人肝癌细胞株SMMC-7721中蛋白激酶C的活力明显降低;而蛋白激酶A(cAMP依赖性蛋白激酶,PKA)则明显增加。本文研究化学诱发大鼠肝癌早期病变中这两种蛋白激酶的变化,观察有无和视黄酸处理时相反的改变。为了证实诱癌是否成     

大鼠肝癌发生过程中p53的突变和甲胎蛋白的表达

采用免疫组织化学ＡＢＣ和ＰＡＰ法,对二乙基亚硝胺（ＤＥＮ）诱发大鼠肝癌发生过程中突变型ｐ５３蛋白（ｍｐ５３）和甲胎蛋白（ＡＦＰ）在肝细胞中的表达进行了系统观察。结果显示：（１）ＤＥＮ诱发大鼠肝癌发生率为１００％;（２）正常大鼠及诱癌第４周大鼠的肝细胞均不表达ｍｐ５３,至诱癌第８周,可见少量肝细胞表达ｍｐ５３,诱癌晚期的癌结节内大部分肝癌细胞呈ｍｐ５３阳性表达,ｍｐ５３免疫反应阳性产物为胞核内棕褐色颗粒;（３）正常大鼠肝细胞不表达ＡＦＰ,诱癌早期（４～８周）的大鼠肝小叶内可见少量ＡＦＰ阳性肝细胞,多为小肝细胞,呈散在分布,此后ＡＦＰ阳性肝细胞逐渐增多,晚期的癌结节内大部分癌细胞呈ＡＦＰ阳性,ＡＦＰ免疫反应阳性产物为胞浆内棕褐色颗粒。结果提示,ｍｐ５３和ＡＦＰ可作为分析肝癌进展的病理学指标     

DAB诱发大白鼠肝癌过程中细胞质膜上酶变化的观察

本实验以二甲基氨基偶氮苯（ＤＡＢ）诱发大白鼠肝癌的动物模型为材料,观察了在诱癌过程中和肝癌形成后大白鼠肝细胞质膜上几种酶活性的变化,用不连续蔗糖密度梯度离心法制备肝细胞质膜,分光光度法对酶活性进行定量测定。实验结果表明,在诱无病癌过程中,肝细胞质膜上５′－ＡＭＰａｓｅ活性上降,γ－ＧＴａｓｅ活性显著升高。γ－ＧＴａｓｅ活性升高幅度与病理变化正相关,并且在诱癌早期就能表现出来。     

大鼠肝癌(BERH-2)细胞甲胎蛋白信使核糖核酸的分离与提纯

采用双抗体免疫沉淀合成AFP的聚核糖体并合Poly(U)-Sepharose亲和层析的方法分离和提纯了大鼠肝癌BERH-2细胞的AFPmRNA。这种纯的AFPmRNA在2％聚丙烯酰胺—0.5％琼脂糖凝胶中以单一的22S带移动。用双抗体免疫沉淀的方法,鉴定麦胚抽提液中由AFPmRNA直接合成的蛋白。在纯甲胎抗体所沉淀的多肽中,有95％的放射性在凝胶电泳中与载体AFP一起移动。在最佳条件下,AFPmRNA在麦胚系统中翻译产物比AFPpRNA高54倍。用AMV反转录酶合成互补于AFP-mRNA的DNA(AFP~3H-cDNA),用分析AFP-mRNA.AFP~3H-cDNA杂化物的热变性来测定AFPcDNA的真实性。高达89℃的Tm值,表明所反转录的cDNA是AFP-mRNA真实的拷贝。