凝乳酶原（凝乳酶）二硫键Ｃys206—Cys210的定位突变

在对凝乳酶原二硫键Ｃys206-Cys210进行定位突变过程中发现,在相应的模板序列中有自身形成自由能为－１６．１kcal/mol的茎环结构倾向,妨碍与引物结合,从而难以合成突变的ＤＮＡ,采用快退火可解决此矛盾。５个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达,除Ｃ２０６Ａ外,约占细胞总蛋白的５０％左右,突变的复性结果表明,Ｃys206-Cys210对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的,但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响,在５个突变体中,Ｃ２０６Ａ／Ｃ２１０Ａ的复性率分别为Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２１０Ｓ、Ｃ２１０Ａ、Ｃ２１０Ｓ的４．５倍、２０倍和３０倍,而C206A不能复性。Ｃ２０６Ａ／Ｃ２１０Ａ与Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２１０Ｓ的远紫外ＣＤ光谱与野生型基本相同,其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变,而荧光强度有显著增加由于上述３个蛋白具有相同比活,说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象,而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰。     

凝乳酶原Cys45-Cys50二硫键功能的研究

凝乳酶原突变体Cys45Asp/Cys50Ser包含体溶解所需的温度、时间、pH条件均与野生型一样,而且其氧化再折叠行为与野生型类似,在同样的复性条件下最终都能获得正确折叠可活化的分子.这与缺失Cys250-Cys283二硫键的突变体大不相同,说明Cys45-Cys50二硫键对凝乳酶原正确折叠的贡献小于Cys250-Cys283二硫键,但这对二硫键的缺失使假凝乳酶的热稳定性显著下降,说明此二硫键在稳定酶的空间构象中起重要作用、另外,突变体Cys45Asp/Cys50Ser假凝乳酶的水解蛋白酶活性(P)与凝乳活性(C)均较野生型低,但是其C/P值比野生型高1倍.     

牛凝乳酶的结晶及其二硫键的化学修饰

为了配合凝乳酶的蛋白质工程,围绕酶的纯化,结晶和二硫键的化学修饰进行了研究。实验结果表明采用FPLC Mono Q柱代替DEAE-纤维素柱层析可以提高同工酶A,B及其降解组分C的分离效果并缩短纯化时间。以10mg／ml的纯凝乳酶B为出发材料,在4℃1．4—2．0mol／L氯化钠条件下进行培养可以获得外形近似为正立方体晶体。化学修饰的结果证明,凝乳酶的三对二硫键处于酶分子不同的空间部位。0．72mmol／L DTT在Ph6．3条件下能还原处于分子表面的一对二硫键,经溴化氰降解分肽测定为Ｃys²⁵⁰-Cys²⁸³,还原后引起活力下降25％。在二硫键之间引入汞原子其活力与还原酶,羧甲基化酶的活力大体相同,说明Cys²⁵⁰-Cys²⁸³在维持凝乳酶具有活力的空间构象中起着一定的作用。     

胰蛋白酶分子中二硫键Cys129—Cys232的定位改造研究

对胰蛋白酶所特有的二硫键（１２９,２３２）进行了定位改造,将Ｃｙｓ突变为Ｓｅｒ,以观察其对胰蛋白酶稳定性及活性的影响,采用蛋白工程的方法,构建了三个突变体Ｃ１２９Ｓ,Ｃ２３２Ｓ和Ｃ１２９Ｓ／Ｃ２３２Ｓ,在Ｅ．ｃｏｌｉＸ－９０菌体中进行表达,表达产物用含胰蛋酶特异性底物ＴＡＭＥ的活性胶检测活性,发现Ｃ２３２Ｓ失胰蛋白酶活性,而Ｃ１２９Ｓ和Ｃ１２９Ｓ／Ｃ２３２Ｓ保留了胰蛋白酶活性,在盐酸胍作用了比较双     

二硫键Cys139-Cys206影响人胰蛋白酶的稳定性

胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,可特异切割精氨酸及赖氨酸C端肽键。重组人源阳离子胰蛋白酶(recombinant human cationic trypsin:rht1)的稳定性明显高于重组人源阴离子胰蛋白酶(recombinant human anionic trypsin:rht2)。比较ht1和ht2的氨基酸序列和三维结构,二者的氨基酸序列同源性为95%,rht1比rht2多1对二硫键Cys139-Cys206。为解释该二硫键对其稳定性的作用,构建rht1的Cys139-Cys206二硫键缺失突变体rht1-dC139S-C206S和rht2的增加该对二硫键的突变体rht2-S139C-S206C。进行了重组表达和纯化,并测定rht1、rht2及两个突变体的酶学性质,对比其稳定性。结果发现,与野生型rht1、rht2相比,突变体的酶学动力学参数km和kcat值与最适pH均未有较大差异。但在pH3～12条件下的稳定性,rht1-dC139S-C206S比rht1低46.6%;rht2-S139C-S206C比rht2高30.3%。对比其热稳定性,40℃保温4 h,rht1残余活性为92.4%,而rht1-dC139S-C206S降为60%。60℃保温4 h,rht2-S139C-S206C残余活性为83.3%,而rht2完全失活。表明了该二硫键Cys139-Cys206对人胰蛋白酶稳定性的重要性。进一步进行结构模拟和分析,解释了该对二硫键对稳定性影响的机制。     

牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的表达

以Tac为启动子构建了牛凝乳酶原B基因表达质粒pTaAc,转化大肠杆菌JMl05,对数生长期加入O．1mmo1／L IPTG能明显诱导凝乳酶原的产生。基因表达除受IPTG的影响外,也受温度的调节控制。在30℃培养,IPTG存在时,凝乳酶原产量极低j在42℃无IPTG的条件下,基因也能表达。按电泳扫描计算凝乳酶原蛋白占细胞可溶性总蛋白量的12～19％,按ELISA法测定凝乳酶原产量为80～100mg／L,经变性、复性及酸化有活性的凝乳酶产量为14—20mg/L。     

胰蛋白酶分子中二硫键Cys129－Cys232的定位改造研究

对胰蛋白酶所特有的二硫键［１２９,２３２］进行了定位改造,将Ｃｙｓ突变为Ｓｅｒ,以观察其对胰蛋白酶稳定性及活性的影响。采用蛋白质工程的方法,构建了三个突变体Ｃ１２９Ｓ、Ｃ２３２Ｓ和Ｃ１２９Ｓ／Ｃ２３２Ｓ．在Ｅ．ｃｏｌｉＸ－９０菌体中进行表达,表达产物用含胰蛋白酶特异性底物ＴＡＭＥ的活性胶检测活性,发现Ｃ２３２Ｓ丧失胰蛋白酶活性,而Ｃ１２９Ｓ和Ｃ１２９Ｓ／Ｃ２３２Ｓ保留了胰蛋白酶活性。在盐酸胍作用下比较双突变体和野生型胰蛋白酶活性,发现突变体Ｃ１２９Ｓ／Ｃ２３２Ｓ的稳定性有所降低。结果表明二硫键Ｃｙｓ１２９－Ｃｙｓ２３２对于胰蛋白酶的活性是非必需的,可能在稳定蛋白质的结构上发挥着重要作用。     

双峰驼凝乳酶原基因的生物信息学分析

通过生物信息学的方法对双峰驼凝乳酶原基因及相应的氨基酸序列的同源性、理化性质、保守结构域、亚细胞定位、信号肽、跨膜结构域、亲水性/疏水性、二级结构进行预测分析.结果表明,双峰驼凝乳酶原基因开放阅读框全长1 146 bp,编码381个氨基酸,属于胃蛋白酶A超家族,预测定位于内质网（膜）的稳定亲水性蛋白,具有一个16个氨基酸的信号肽,其不含跨膜结构域.无规卷曲是其二级结构中最大量的结构元件,α螺旋和延抻链分散于整个蛋白质中,活性位点的分析表明,编码蛋白有6类活性位点.分析双峰驼凝乳酶原基因及其编码蛋白质的特征,能够为深入开展双峰驼凝乳酶的表达和凝乳特性研究提供理论依据.