利用农杆菌介导的瞬时表达系统研究CYC类TCP蛋白的亚细胞定位

CYCLOIDEA（CYC）类TCP基因在豆科与玄参科植物中都参与了两侧对称花型的发育,但它们的具体功能有明显的差异。通过在豌豆花瓣中建立农杆菌EHA105介导的瞬时表达系统,观察到豆科植物百脉根和玄参科植物金鱼草的CYC类TCP蛋白亚细胞定位有明显区别。     

拟南芥血红蛋白3的亚细胞定位

拟南芥的血红蛋白3（AtGLB 3）属于截短的血红蛋白。与拟南芥血红蛋白1相比,拟南芥血红蛋白3具有不同的起源、不同的生化特性和结构;但其功能还不清楚。蛋白质的定位与蛋白质的功能息息相关。为深入研究该基因功能,构建了拟南芥血红蛋白3基因与绿色荧光蛋白融合的植物表达载体pUCGFP/AtGLB3。利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,通过检测融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布来确定拟南芥血红蛋白3在细胞中的定位。荧光显微镜检测结果表明,AtGLB3基因表达产物主要定位在细胞膜上。     

拟南芥血红蛋白1的亚细胞定位

为研究拟南芥的血红蛋白1(AtGLB1)基因的亚细胞定位,该实验构建了拟南芥血红蛋白1基因与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体pUCGFP/ AtGLB1.利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,通过检测融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布来确定拟南芥血红蛋白1在细胞中的定位.荧光显微镜检测结果表明,AtGLB1基因表达产物主要定位在细胞核中,少量定位在细胞质中.     

农杆菌介导的MpASR蛋白在洋葱表皮细胞的定位研究

通过比较不同侵染液浓度、侵染时间、取材部位、预处理等条件下的转化效果,优化了农杆菌介导的洋葱鳞茎内表皮细胞转化系统,并且成功检测到大蕉ASR蛋白(MpASR)与GFP的融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布.     

拟南芥谷氨酸受体基因的亚细胞定位

为明确拟南芥谷氨酸受体1.3基因(AtGLR1.3)的亚细胞定位,该实验以拟南芥(Arabidopsis thalianaCo-lumbia ecotype)为材料,运用PCR方法从其基因组中扩增得到了AtGLR1.3的启动子和基因序列,将其连接到载体pBIsGFP上,构建成AtGLR1.3基因与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体,通过农杆菌介导的花序浸润法将重组载体转化拟南芥野生型,转基因植株通过激光共聚焦扫描显微镜观察显示,GFP荧光信号存在于细胞质膜上,表明AtGLR1.3为细胞膜蛋白.该结果为进一步研究AtGLR1.3的作用机理奠定了基础.     

人SDCT2蛋白亚细胞定位信号分析

为了确定人高亲和力钠离子依赖性二羧酸共转运蛋白（high-affinity sodium-dependent dicarboxylate co-transporter, SDCT2,NaDC3）在细胞内的定位,构建了SDCT2与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白表达载体,并转染肾小管上皮细胞LLC-PK1,激光共聚焦显微镜观察显示,SDCT2蛋白主要定位于细胞的基底侧膜上.同时将SDCT2-EGFP融合基因mRNA显微注射到爪蟾卵母细胞中表达,可见融合蛋白的绿色荧光仅分布在细胞膜上.为了进一步确定该蛋白质的亚细胞定位信号序列,将SDCT2基因的N端及C端分别缺失,并构建缺失突变体与EGFP的融合蛋白表达载体,将它们转染到LLC-PK1中,观察SDCT2 缺失体在细胞内的分布情况.结果显示,N端缺失的SDCT2蛋白主要位于细胞质中,顶膜和基底侧膜上也有表达;C端缺失的SDCT2蛋白主要位于基底侧膜上,顶膜几乎没有表达,细胞质中表达很少.免疫组化结果也显示,SDCT2只表达于人近端肾小管上皮细胞的基底侧膜.这表明SDCT2蛋白的N端序列对其亚细胞定位是必需的,人SDCT2蛋白的基底膜定位信号位于N端序列中.     

盐穗木功能未知蛋白 (HcUKPP)的亚细胞定位

藜科的极端盐生植物盐穗木（Halostachys caspica）的高盐胁迫抑制差减文库中有39%的功能未知蛋白（proteins with obscure features, POFs）,利用亚细胞定位分析可以初步判断其可能的功能.将盐穗木的1个POF-cDNA序列HcUKPP的编码区构建至pCAMBIA1301-GFP植物表达载体上,冻融法将重组质粒pCAMBIA1301-HcUKPP-GFP转化农杆菌EH105A,利用花序浸染法将基因导入拟南芥,经潮霉素筛选获得T1代阳性幼苗.通过激光扫描共聚焦显微镜观察转基因拟南芥植株的根部细胞. 结果显示,表达GFP蛋白的对照转基因植株中,绿色荧光在细胞核、细胞膜以及细胞质中均能检测到,而表达HcUKPP-GFP融合蛋白的转基因植株中,绿色荧光只在细胞质膜上表达,说明HcUKPP蛋白为细胞质膜相关蛋白.本研究为深入探讨盐穗木未知蛋白的功能奠定了基础.     

拟南芥磷酸酶基因亚细胞定位与组织表达

通过克隆拟南芥磷酸酶PP2C家族基因At3g51370,构建了绿色荧光蛋白融合表达载体,用基因枪将构建好的载体轰击洋葱表皮细胞进行瞬时表达分析,发现该At3g51370基因表达蛋白定位在细胞核中;用实时定量PCR方法分析At3g51370基因的组织表达特性,发现该基因在花器官中的表达量明显高于其它组织.进一步构建了含At3g51370基因的启动子和GUS报告基因的植物表达载体,经农杆菌介导转化拟南芥,对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色,分析该启动子在不同生长时期与不同组织中的转录活性,结果发现,在幼苗期At3g51370基因主要集中在根尖分生组织和顶端分生组织表达,在成年植株中则集中在生殖器官如花和果荚柄等部位表达,在光照和黑暗条件下,At3g51370基因的表达特性没有明显差异.研究表明,At3g51370可能与其它核定位的PP2C磷酸酶一样参与了基因表达的调控,可能在拟南芥早期发育阶段的细胞增值分裂相关信号转导途径中发挥功能,并在花器官的发育过程中行使功能,且不参与光信号转导.     

农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达

实验以甘蓝型油菜宁油16为材料,绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,建立了农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达系统。我们构建了GFP表达载体pB2GW7.0-gfp,并成功转化农杆菌。实验中通过添加P19来提高GFP在油菜子叶中的瞬时表达量。并提取了注射有P19和pB2GW7.0-gfp农杆菌混合液的油菜子叶RNA,经RT-PCR鉴定,发现在4～8 d GFP均能表达。激光共聚焦显微镜分析表明农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达系统能够转化油菜子叶的表皮细胞和保卫细胞。甘蓝型油菜子叶瞬时表达方法简便、快速、可靠,从种子播种到获得荧光蛋白表达,全过程只需要20 d。表明在研究油菜基因的表达和功能方面有潜在的应用前景。     

拟南芥3个蛋白磷酸酶2C基因编码蛋白的亚细胞定位及组织表达分析

利用gateway技术从拟南芥中克隆了3个蛋白磷酸酶2C基因At5G66080、At1G68410和At5G06750,3个基因的ORF全长分别为1 158 bp、1 311 bp和1 182 bp,分别编码一条385、376和393个氨基酸残基的多肽.构建了3个基因的植物表达载体35S:GFP:At5G66080、35S:GFP:At1G68410和35S:GFP:At5G06750,采用基因枪法进行的洋葱表皮细胞GFP瞬时表达实验表明,荧光信号主要分布在细胞核上,显示这3个基因的产物可能在细胞核上发挥作用.利用实时荧光定量PCR研究At5G66080、At1G68410和At5G06750基因在不同组织中的表达特性,结果表明:3个基因在各个器官均有表达,但表达量不同;At5G66080、At1G68410和At5G06750基因在花中表达量最大;At5G66080和At5G06750基因在根、叶和叶柄中的表达量次之,在茎中的表达量最低;At1G68410基因在根中的表达量次之,在茎、叶和叶柄中的表达量较低.     

人类GABARAPL2基因的亚细胞定位

为了对GABARAPL2（GABAA受体相关蛋白相似蛋白2）基因的功能进行初步分析,首先通过同源比较的方法将序列与其同源物进行比较,发现GABARAPL2的氨基酸序列与GABARAP（GABAA受体相关蛋白）高度同源,而GABARAP已证实通过结合细胞骨架的微蛋白,使GABAA受体聚集,定位在细胞膜上,本文采用PCR法从人脑组织的cDNA文库中扩增出GABARAPL2的cDNA,克隆至T质粒载体中进行测序验证,然后以此为模板引物中引入酶切位点再次PCR,扩增出GABARAPL2的开放阅读框,并将其插入到加强型绿色荧光蛋白融合表达载体EGFP中,将绿色荧光蛋白标记的GABARAPL2和GABARAP分别转染HLF细胞株,结果两种蛋白的分布情况基本一致,在细胞质内和核内均有分布,而且核内的分布较胞质为多,结构功能域分析表明,GABARAPL2含有蛋白激酶C磷酸化位点和酪氨酸激酶磷酸化位点,可能通过磷酸化参与细胞骨架的变化,结论 GABARAPL2和GABARAP不仅在胞质中作为受体相关蛋白协助受体的聚集、定位,还参与体内许多其它重要的生理过程。     

High-throughput protein localization in Arabidopsis using Agrobacterium-mediated transient expression of GFP-ORF fusions

We describe a streamlined and systematic method for cloning green fluorescent protein (GFP)-open reading frame (ORF) fusions and assessing their subcellular localization in Arabidopsis thaliana cells. The sequencing of the Arabidopsis genome has made it feasible to undertake genome-based approaches to determine the function of each protein and define its subcellular localization. This is an essential step towards full functional analysis. The approach described here allows the economical handling of hundreds of expressed plant proteins in a timely fashion. We have integrated recombinational cloning of full-length trimmed ORF clones (available from the SSP consortium) with high-efficiency transient transformation of Arabidopsis cell cultures by a hypervirulent strain of Agrobacterium. To demonstrate its utility, we have used a selection of trimmed ORFs, representing a variety of key cellular processes and have defined the localization patterns of 155 fusion proteins. These patterns have been classified into five main categories, including cytoplasmic, nuclear, nucleolar, organellar and endomembrane compartments. Several genes annotated in GenBank as unknown have been ascribed a protein localization pattern. We also demonstrate the application of flow cytometry to estimate the transformation efficiency and cell cycle phase of the GFP-positive cells. This approach can be extended to functional studies, including the precise cellular localization and the prediction of the role of unknown proteins, the confirmation of bioinformatic predictions and proteomic experiments, such as the determination of protein interactions in vivo, and therefore has numerous applications in the post-genomic analysis of protein function.     

TransientAgrobacterium-mediated gene expression in theArabidopsis hydroponics root system for subcellular localization studies

To a great extent, the cellular compartmentalization and molecular interactions are indicative of the function of a protein. The development of simple and efficient tools for testing the subcellular location of proteins is indispensable to elucidate the function of genes in plants. In this report, we assessed the feasibility ofAgrobacterium-mediated transformation of hydroponically grown roots to follow intracellular targeting of proteins fused to green fluorescent protein (GFP). We developed a simple in planta assay for subcellular localization of proteins inArabidopsis roots via transient transformation and tested this method by expressing a GFP fusion of a known nuclear protein, IQD1. Visualization of transiently expressed GFP fusion proteins in roots by means of confocal microscopy is superior to the analysis of green tissues because the roots are virtually transparent and free of chlorophyll autofluorescence.     

香蕉Maasr1基因表达产物的亚细胞定位

利用SSH分离香蕉果实采后差异表达基因,获得香蕉的ASR基因,并将其命名为Maasr1。对该基因与香蕉采后成熟衰老进行相关性研究,发现其在果实采后早期表达上调。通过对Maasr1基因进行生物信息学分析表明,Maasr1基因编码的蛋白可能作为转录因子定位于细胞核或细胞质中。为进一步深入研究该基因功能,构建了香蕉Maasr1基因与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体pCAMBIA1304-Maasr1。利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,荧光显微镜检测结果表明,Maasr1基因表达产物定位在细胞核中,符合转录因子特性。     

Subcellular localization and phosphorylation of antizyme 2

Antizymes (AZs) are polyamine‐induced proteins that negatively regulate cellular polyamine synthesis and uptake. Three antizyme isoforms are conserved among mammals. AZ1 and AZ2 have a broad tissue distribution, while AZ3 is testis specific. Both AZ1 and AZ2 inhibit ornithine decarboxylase (ODC) activity by binding to ODC monomer and target it to the 26S proteasome at least in vivo. Both also inhibit extra‐cellular polyamine uptake. Despite their being indistinguishable by these criteria, we show here using enhanced green fluorescent protein (EGFP)‐AZ2 fusion protein that in mammalian cells, the subcellular location of AZ2 is mainly in the nucleus, and is different from that of AZ1. The C‐terminal part of AZ2 is necessary for the nuclear distribution. Within a few hours, a shift in the distribution of EGFP‐AZ2 fusion protein from cytoplasm to the nucleus or from nucleus to cytoplasm is observable in NIH3T3 cells. In addition, we found that in cells a majority of AZ2, but not AZ1, is phosphorylated at Ser‐186, likely by protein kinase CK2. There may be a specific function of AZ2 in the nucleus. J. Cell. Biochem. 108: 1012–1021, 2009. © 2009 Wiley‐Liss, Inc.