一种从重组质粒快速提纯DNA插入片段的方法

本文介绍一种从重组质粒中快速提纯ＤＮＡ插入片段的方法。质粒ＤＮＡ的制备简单、快速、分离的质粒ＤＮＡ可用于限制性酶切和转化大肠杆菌等。从琼脂糖凝胶中提纯ＤＮＡ插入片段的方法操作简单,回收效率高,提纯的ＤＮＡ片段可用于连接和制备杂交探针等。     

一种快速提取质粒DNA用于鉴别重组克隆的方法

介绍了一种利用过夜培养的菌液瞬时提取质粒DNA,并用于电泳鉴别含有插入子克隆的方法。事先无需准备许多繁琐的相关试剂,提取质粒的全过程只需3~5min就可完成,非常适合于做重组克隆的快速鉴别。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3．1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1—egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45％。瞬时转染pcDNA3．1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

改善大分子质粒DNA重组效率的新方法

采用两次连接法对一个质粒载体为7.65 kb,插入子为1.47 kb的片段进行重组连接,使连接效率大大提高.此方法对于大分子的质粒DNA重组是非常有效的.     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3.1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1-egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45%,瞬时转染pcDNA3.1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3.1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1-egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45%,瞬时转染pcDNA3.1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

利用Red重组系统快速构建基因打靶载体

基因敲除小鼠模型是在哺乳动物体内研究基因功能最可靠的方法之一。利用常规的分子克隆的方法构建基因打靶载体往往工作周期长,对于难度特别大的基因有时甚至无法完成打靶载体的构建。通过合理应用Red重组系统和低拷贝中间载体,利用50bp的同源重组序列直接从BAC载体中克隆了长片段的小鼠基因组序列;将得到的基因组序列再次通过重组和改造,构建了Gpr56等基因的完全敲除并带有报告基因的打靶载体,实现了打靶载体的快速构建。     

一种融合抗体ScFv-Fc通用表达载体的构建

为了构建一个可供自由替换的ScFv区,表达人小分子融合抗体ScFv-Fc的通用载体,利用RT-PCR技术扩增人抗体IgG1的Fc片段克隆至毕赤酵母表达载体pPICZα,将一段人工合成的互补寡核苷酸链插入重组载体pPICZα/Fc中Fc区的上游,引入2个可供小分子抗体ScFv-Fc的ScFv区自由替换的限制性酶切位点。分别扩增人抗狂犬病毒以及抗乙型肝炎表面抗原的ScFv片段,克隆至已构建的通用载体pPICZα/Fc,在毕赤酵母中诱导表达。进一步在1L条件下对活性抗体进行发酵,并利用protein A亲和层析柱进行纯化。应用酵母基因组PCR、ELISA、Western blotting、活性检测等试验对此小分子抗体的表达进行生物学及免疫学分析。结果表明具有狂犬病毒抗原结合活性以及乙肝表面抗原结合活性的人源抗体分子均获得成功表达,1L发酵条件下表达量达到20~30mg/L, protein A亲和层析纯化后纯度＞95%。研究构建了可用于功能性抗体分子ScFv-Fc筛选和表达的通用载体并对其发酵、纯化条件进行了摸索,为重组抗体分子诊断、治疗试剂的开发以及抗体的人源化奠定了物质基础。     

利用DNA Assembly方法构建重组腺病毒载体

目的:建立一种基于DNA Assembly方法的重组腺病毒载体构建方法.方法:首先,通过设计合适的酶切位点及同源臂,采用了传统的限制性内切核酸酶连接方法和DNA Assembly方法获得63型猩猩腺病毒(Chimpanzee adenovirus serotype 63,ChAd63)的骨架质粒 pChAd63.随后,...     

一种新的DNA重组系统

通路克隆系统(Gateway Cloning System)是一种位点特异的DNA重组新技术,具有载体问DNA片段相互转化灵活、操作简单、重组反应高效快捷等优点。本文介绍了该系统的原理、结构及特点。     

DNA重组技术：Ⅲ.重组质粒在大肠杆菌中的转化

氯化钙法是用质粒DNA转化细菌细胞,尤其是大肠杆菌细胞最常使用的方法。实验操作如下: (1) 将受体菌接种在平板培养基上划线,37℃过夜,进行活化。 (2) 挑选单菌落,接于5ml LB培养液,37℃震荡过夜。 (3) 从上述培养液中取0.5ml,转入50mlLB培养液,37期震荡培养2～4小时,到细菌密度大约为5×10~7/ml,OD_(575)约为0.8。     

微生物融合重组子的鉴定——DNA分子检测技术

融合子是双亲融合的产物,必然带有双亲的分子标记,因此ＤＮＡ水平上的分子标记是鉴别融合子最可靠的指标。生物群体中等位基因的差异导致遗传多样性,它形成的分子基础是基因组ＤＮＡ序列变异。在生物基因组中,还存在大量不编码ＤＮＡ序列,它们是中性的,在进化过程中...     

一种快速简单的质粒DNA纯化方法

本文介绍一种快速获取高纯度质粒DNA的方法。本法对煮沸提取法进行改良后,快速提取质粒DNA粗制品,然后用国产滤纸从琼脂糖凝胶中回收纯化质粒DNA。同时对本法所提取的质粒DNA的回收率、浓度、纯度及可能的用途进行验证和讨论,证明此法简易,所得样品纯度高,可直接用于转化、酶切和基因克隆。     

一种提取质粒DNA的改良方法

本文详细介绍了一种改良碱裂解法提取质粒ＤＮＡ的方法,该法采用ＮＨ４Ａｃ代替苯酚和氯份的抽提过程,得率高,质量好,完全达到了分子生物学常规实验的要求,如酶切、连接、转化大肠杆菌、ＰＣＲ等,甚至用于序列测定和植物遗传转化,该法重复性好,操作简单、实用．     

快速鉴定重组质粒菌落的新方法

快速鉴定重组质粒菌落的新方法董北阎锡蕴（康奈尔大学医学院医学系,纽约）（中国科学院微生物研究所,北京１０００８０）筛选含重组质粒菌落常用的方法有探针杂交、小规模制备质粒ＤＮＡ进行限制酶切鉴定、。互补及插人失活。我们在此介绍一种新方法,即半菌落ＰＣＲ扩...     

酵母菌基因工程载体——pCN系杂种质粒的构建及其特性的研究

pCN系质粒是利用DNA重组技术,以YRp7和pAT153为原始质粒所构建的酵母菌基因工程载体。pCN系质粒由酵母菌TRPL基因的1．4 kb DNA片段和完整的pAT 153分子组成。根据pAT153质粒中所插入的TRPl DNA片段的方向性,pCN质粒有两种不同的构型。在性质上,pCN系质粒保留了 YRp7高转化能力和pAT153高拷贝水平,同时它在酵母受体中的稳定性比’YPp7明显提高。pCN质粒中尤以pCN60可作为酵母基因工程的载体。