海洋真菌Thraustochytrium sp.FJN-10 Δ~4脱饱和酶基因的cDNA克隆及结构分析

海洋真菌Thraustochytriumsp.FJN-10是二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA,C22:6n-3)的高产菌株。为阐明其DHA生物合成机制及采用基因工程技术提高DHA生物合成能力,通过RT-PCR扩增了DHA生物合成相关脱饱和酶基因的保守区,采用cDNA末端扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)获取全长基因,结果分析表明其克隆基因为Δ4脂肪酸脱饱和酶基因,开放阅读框由1560个核苷酸组成,共编码519个氨基酸,这是Thraus-tochytriumsp.FJN-10Δ4脂肪酸脱饱和酶基因研究的首次报道。     

海洋真菌Thraustochytrium sp.FJN-10 △4脱饱和酶基因的cDNA克隆及结构分析

海洋真菌Thraustochytrium sp.FJN-10是二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA,C22:6n-3)的高产菌株.为阐明其DHA生物合成机制及采用基因工程技术提高DHA生物合成能力,通过RT-PCR扩增了DHA生物合成相关脱饱和酶基因的保守区,采用cDNA末端扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)获取全长基因,结果分析表明其克隆基因为△4脂肪酸脱饱和酶基因,开放阅读框由1560个核苷酸组成,共编码519个氨基酸,这是Thraustochytrium sp.FJN-10△4脂肪酸脱饱和酶基因研究的首次报道.     

雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

根据真菌Δ6-脂肪酸脱氢酶基因保守的组氨酸Ⅱ区和Ⅲ区附近保守序列设计兼并引物进行RT-PCR,得到雅致枝霉(Thamnidium elegans)As3.2806Δ6-脂肪酸脱氢酶基因459bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术(RACE)向两端延伸得到1504bp的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个1377bp、编码459个氨基酸的开放阅读框TED6。推测的氨基酸序列与已知其他真菌的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的氨基酸序列比对,具有3个组氨酸保守区、2个疏水区及N末端细胞色素b5融合区。将此编码区序列亚克隆到酿酒酵母缺陷型菌株INVSc1的表达载体pYES2.0中,构建表达载体pYTED6,并在酿酒酵母INVSc1中异源表达。通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-MS)分析表明,该序列在酿酒酵母中获得表达,产生γ-亚麻酸(GLA)的含量占酵母总脂肪酸的7.5%。证明此序列编码的蛋白能将外加的亚油酸转化为γ-亚麻酸,是一个新的有功能的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(GenBank,AY941161)。     

海洋破囊壶菌Δ~4-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒酵母中的表达

以质粒pGEM-TFAD4为模板,扩增获得1.6kb的Δ4-脂肪酸脱饱和酶基因(FAD4)。将FAD4酶切后连接到HindⅢ/XbaⅠ处理过的pYES2.0载体,构建重组表达质粒pYFAD4。转化酿酒酵母缺陷型菌INVScl,通过SC-U选择性培养基筛选阳性克隆子。添加外源脂肪酸C22:5底物,半乳糖诱导表达。气相色谱分析表明阳性克隆子总脂肪酸中出现了二十二碳六烯酸C22:6(占酵母总脂肪含量的41.13%),Δ4-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒酵母中得到了表达。     

被孢霉△~9脂肪酸脱饱和酶基因保守区的cDNA克隆及结构分析

被孢霉被广泛采用用于发酵生产γ-亚麻酸、花生四烯酸和EPA等多不饱和脂肪酸。为了解决发酵产率过低等诸多问题,我们拟采用基因工程技术改造生产菌株。通过对已克隆△~9脂肪酸脱饱和酶基因的分析,合成一组简并引物,PCR扩增了被饱霉△9脂肪酸脱饱和酶基因的保守区。结果表明被抱霉△9脂肪酸脱饱和酶基因保守区由537个核苷酸组成,共编码179个氨基酸。其与迄今为止发表的微生物面△9脂肪酸脱饱和酶基因有很高的同源性。这是被饱霉△~9脂肪酸脱饱和酶基因研究的次次报道。     

大豆fad基因反义表达载体构建及转化烟草研究

使用PCR方法从大豆基因组DNA中扩增出大豆油酸脱饱和酶基因fad2-1,连接到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109菌株.测序后,用DNAstar软件进行同源性比对.然后将正确的序列反向克隆到表达载体pBt,并转化农杆菌菌株LBA4404,经双酶切鉴定和PCR扩增检测,获得具有该基因反向序列的农杆菌工程菌,转化...     

被孢霉△9脂肪酸脱饱和酶基因保守区的cDNA克隆及结构分析*

被孢霉被广泛采用用于发酵生产Y一亚麻酸、花生四烯酸和EPA等多不饱和脂肪酸。为了解决发酵产率过低等诸多问题,我们拟采用基因工程技术改造生产菌株。通过对已克隆△9脂肪酸脱饱和酶基因的分析,合成一组简并引物,PCR扩增了被饱霉△9脂肪酸脱饱和酶基因的保守区。结果表明被孢霉△9脂肪酸脱饱和酶基因保守区由537个核苷酸组成,共编码179个氨基酸。其与迄今为止发表的微生物△9脂肪酸脱饱和酶基因有很高的同源性。这是被饱霉△9脂肪酸脱饱和酶基因研究的次次报道。     

利用长引物嵌套式反向PCR方法克隆雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因上游序列

用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ分别对雅致枝霉As3.2806基因组DNA进行消化,而后在低浓度条件下利用T4DNA连接酶使DNA自身环化。根据已知基因序列,设计一对长度为35nt的长反向引物和两对较短的引物,以基因组连接产物为模板,通过三轮嵌套式PCR反应,获得一长度约为4kb的扩增片段。经序列测定表明得到了Δ6-脂肪酸脱氢酶基因上游序列约为1.3kb,初步序列分析显示该序列为一潜在的启动子序列。     

高山被孢霉Δ6Ⅱ-脱饱和酶的克隆、表达和功能鉴定

产油微生物高山被孢霉中Δ6脱饱和酶是决定ω3/ω6脂肪酸代谢流的关键酶,该酶对不同底物的催化特性直接决定该菌体内脂肪酸的流向。在已完成基因组测序的高山被孢霉ATCC32222中经注释发现它存在两种Δ6脱饱和酶(Δ6-Ⅰ和Δ6-Ⅱ),选择对其中的Δ6-Ⅱ脱饱和酶进行克隆、表达和功能鉴定。首先以p YES2/NT C质粒为骨架构建了Δ6-Ⅱ脱饱和酶基因(FADS6-Ⅱ)的表达载体(p YES2/NT C-FADS6-Ⅱ),并转化至酿酒酵母中进行诱导表达,进一步通过在重组菌培养基中添加Δ6脱饱和酶的底物来考察Δ6-Ⅱ脱饱和酶对各底物的偏好作用。实验结果表明,在分别添加0.5 mmol/L亚油酸(LA)和0.5 mmol/Lα-亚麻酸(ALA)时,Δ6-Ⅱ脱饱和酶对LA的转化率为42.94%,对ALA没有催化作用。而当底物添加方式改为同时添加LA和ALA时(分别为0.25 mmol/L),Δ6-Ⅱ脱饱和酶对LA的转化率为37.12%,对ALA仍没有催化作用。该实验结果为高山被孢霉中Δ6-Ⅱ脱饱和酶的催化功能研究提供了理论依据。     

海洋破囊壶菌△4-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒母中的表达

以质粒pGEM-TFAD4为模板,扩增获得1.6 kb的△4-脂肪酸脱饱和酶基因(FAD4).将FAD4酶切后连接到Hond Ⅲ/XbaⅠ处理过的pYES2.0载体,构建重组表达质粒pYFAD4.转化酿酒酵母缺陷型菌INVScl,通过SC-U选择性培养基筛选阳性克隆子.添加外源脂肪酸C22:5底物,半乳糖诱导表达.气相色谱分析表明阳性克隆子总脂肪酸中出现了二十二碳六烯酸C22:6(占酵母总脂肪含量的41.13%),△4-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒酵母中得到了表达.     

小眼虫藻Δ8-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

Δ8途径是合成多不饱和脂肪酸的替代途径,Δ8-脂肪酸脱氢酶是该途径的关键酶之一。根据已报道的Δ8-脂肪酸脱氢酶基因设计引物,分别从小眼虫藻基因组DNA和cDNA中扩增得到该基因片段,序列分析表明：结构基因长1 266 bp,编码421个氨基酸;该基因没有内含子,比已经报道的Δ8-脂肪酸脱氢酶基因长6 bp,并且N末端序列也有所不同。利用酿酒酵母的载体pYES2.0构建Δ8-脂肪酸脱氢酶表达载体pYEFD,并转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVSc1中,在选择培养基中筛选得到酿酒酵母转化菌株YD8。YD8在合适的培养条件下,添加外源底物二十碳二烯酸和二十碳三烯酸并诱导基因表达。脂肪酸甲酯气相色谱分析表明小眼虫藻Δ8-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中获得了高效表达,将二十碳二烯酸和二十碳三烯酸分别转化成二高-γ-亚麻酸和二十碳四烯酸,其底物转化率分别达到了31.2％和46.3％。     

少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

根据真菌Δ6 脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行RT PCR ,获得一个 5 93bp的cDNA片段 ,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物 ,通过cDNA末端扩增技术 (RACE)获得该cDNA的 3′和 5′序列 ,从而得到全长为 14 82bp的cDNA序列。序列分析结果表明 ,该序列具有一个长度为 1377bp、编码 4 5 8个氨基酸的开放阅读框 ,所编码蛋白质的大小为 5 2kD。与报道的Δ6 脂肪酸脱氢酶一样 ,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的 3个组氨酸保守区和疏水结构 ,在其氨基酸序列的N 末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区。该序列为一个新的编码Δ6 脂肪酸脱氢酶的基因 ,为了验证其功能 ,把开放阅读框序列RAD6亚克隆到表达载体 pYES2 0 ,构建重组表达载体pYRAD6 ,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达。通过气相色谱(GC)和气相色谱 /质谱 (GC MS)分析表明 ,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的酶具有Δ6 脂肪酸脱氢酶活性 ,能将外源性的底物亚油酸转化为γ 亚麻酸 ,γ 亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的 3 85 %。     

利用反向PCR方法扩增细菌热激蛋白HSP60基因

利用PCR简并引物扩增出HSP6 0基因中一段约 6 0 0bp的核心片段 ,将该核心片段标记为探针 ,与基因组DNA进行Southern杂交 ,选择出适宜的限制性内切酶 ,以便消化基因组DNA得到大小合适的、含有HSP6 0基因的酶切片段。将酶切片段自身环化后作为模板进行反向PCR ,引物的延伸方向自核心片段出发延环化分子向未知序列区进行 ,可扩增出核心区上下游的序列。应用该方法 ,扩增并测定了寓齿双歧杆菌 (Bifidobacteriumdenticolens)DSM1 0 1 0 5 T、奇异双歧杆菌 (Bifidobacteriuminopinatum)DSM1 0 1 0 7T 和阴道加德纳氏菌 (Gard nerellavaginalis)ATCC1 40 1 8T 的HSP6 0全基因序列及青春双歧杆菌 (Bifidobacteriumadolescentis)JCM1 2 75 T98%以上的HSP6 0全基因序列。结果表明 ,反向PCR方法可有效的扩增细菌HSP6 0基因     

被孢霉cDNA文库的构建及△^9脂肪酸脱饱和酶cDNA序列的筛选

为了克隆被孢霉不饱和脂肪酸生物合成途径的相关酶基因,构建了基于λgt10的被孢霉cDNA文库.cDNA文库库容量为2×106pfu.以已克隆的被孢霉△9脂肪酸脱饱和酶保守区cDNA为探针对被孢霉cDNA文库进行筛选.经过两轮筛选获得1个阳性克隆,其插入片段长度大于1.6kb.     

利用长引物嵌套式反向PCR方法克隆雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因上游序列

用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ分别对雅致枝霉As32806基因组DNA进行消化,而后在低浓度条件下利用T4DNA连接酶使DNA自身环化。根据已知基因序列,设计一对长度为35nt的长反向引物和两对较短的引物,以基因组连接产物为模板,通过三轮嵌套式PCR反应,获得一长度约为4kb的扩增片段。经序列测定表明得到了Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因上游序列约为1.3kb,初步序列分析显示该序列为一潜在的启动子序列。     

高山被孢霉中Δ9脂肪酸脱饱和酶的表达、纯化和其细胞色素b_5功能域的鉴定

在毕赤酵母中表达和纯化源自高山被孢霉ATCC 32222的膜结合Δ9-I脂肪酸脱饱和酶,测定其活性,并探究其细胞色素b_5功能域的性质。构建含有高效纯化标签ZZ-tag的表达载体;用Western blotting和SDS-PAGE筛选Δ9-I脂肪酸脱饱和酶高表达量转化子;通过梯度离心和去垢剂筛选确定膜蛋白质提取条件;采用IgG亲和纯化色谱和阴离子交换色谱对Δ9-I脂肪酸脱饱和酶进行纯化;利用酿酒酵母细胞破碎物为底物考察Δ9-I脂肪酸脱饱和酶活性;通过波长扫描和Na_2S_2O_4还原实验对Δ9-I脂肪酸脱饱和酶细胞色素b_5功能域进行表征。结果显示,目的蛋白质被成功表达并筛选出高表达量转化子;20 000g离心1h为最佳膜分离条件,Fos-Choline-16为最佳去垢剂;纯化后的Δ9-I脂肪酸脱饱和酶结构完整,具有细胞色素b_5功能域;在酿酒酵母提取物中Δ9-I脂肪酸脱饱和酶对C16:0和C18:0底物的转化效率分别为(16.88±9.32)%和(20.61±7.55)%;波长扫描显示Δ9-I脂肪酸脱饱和酶在411nm处有强吸收,并且在Na_2S_2O_4作用下被还原至422nm,说明细胞色素b_5功能域在体外能够被还原。因此,含有细胞色素b_5功能域的脂肪酸脱饱和酶的首次成功表达、纯化和鉴定为亚铁血红素脂肪酸脱饱和酶脱饱和反应机制的研究奠定了基础。     

植物脂肪酸脱饱和酶特性及转基因研究进展

脂肪酸代谢是有机体的基本代谢之一。植物体内首先合成的是饱和脂肪酸,然后在脂肪酸脱饱和酶作用下形成不饱和脂肪酸。目前已经从很多植物中克隆到了脂肪酸合成相关的酶,并对其功能进行了鉴定。详细介绍了近年来应用基因工程技术对植物油中不饱和脂肪酸含量和组分进行改造所取得的进展,并对其在植物抗性育种中的应用进行了展望。     

海洋破囊壶菌Δ4-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒酵母中的表达

以质粒pGEM-TFAD4为模板,扩增获得1．6kb的△^4-脂肪酸脱饱和酶基因（FAD4）。将FAD4酶切后连接到hin dⅢ,Xba I处理过的pYEs2．0载体,构建重组表达质粒pYFAD4。转化酿酒酵母缺陷型菌INVScl,通过SC-U选择性培养基筛选阳性克隆子。添加外源脂肪酸C22：5底物,半乳糖诱导表达。气相色谱分析表明阳性克隆子总脂肪酸中出现了二十二碳六烯酸C22：6（占酵母总脂肪含量的41．13％）,△^4-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒酵母中得到了表达。     

被孢霉Δ^9脂肪酸脱饱和酶基因保守区的cDNA克隆及结构分析

被孢霉被广泛采用用于发酵生产γ－亚麻酸、花生四烯酸和ＥＰＡ等多不饱和脂肪酸。为了解决发酵产率过低等诸多问题,我们拟采用基因工程技术改造生产菌株。通过对已克隆Δ＾９脂肪酸脱饱和酶基因的分析,合成一组简并引物,ＰＣＲ扩增了被饱霉Δ＾９脂肪酸脱饱和酶基因的保守区。结果表明被孢囊Δ＾９脂肪酸脱饱和酶基因保守区由５３７个核苷酸组成,共编码１７９个氨基酸。其与迄今为止发表的微生物Δ＾９脂肪酸脱饱和酶基因有很高     

脂肪酸脱饱和的应用进展

脂肪酸脱饱和是由脂肪酸脱饱和酶所催化的不饱和脂肪酸合成途径的关键步骤。脂肪酸脱饱和酶分为脂酰CoA脱饱和酶、脂酰ACP脱饱和酶和脂酰脂脱饱和酶等三类。近年来脂肪酸脱饱和遗传操作在植物抗寒育种、植物油基因工程、食品工程、微生物发酵工程和植物抗害育种等方面的应用研究均取得了相当进展。