用错配PCR技术检测中国人β-地中海贫血基因突变

β-地中海贫血(β-地贫)的分子基础主要为点突变,目前中国β-地贫人群中已发现16种点突变。我们在基因频率调查的基础上,发现我国南方95％以上的β-地贫由5种点突变所致,它们是:codon 41-42(-CTTT)缺失突变,IVS-2 nt 654(C→T)突变,codon 17     

用直接测定基因组DNA序列的方法检测β-地中海贫血基因突变

本文报道一种结合聚合酶链反应(PCR)技术直接测定基因组DNA中单考贝基因片段序列的方法,以及利用这种方法测定两例β-地贫纯合子的β珠蛋白基因序到结果。测定出基因点突变,一例为编码子17(A→T)突变纯合子,另一例为编码子69(G→A)突变纯合子。针对上述两个点突变合成寡核苷酸片段,末端标记~(82)P后为探针进行斑点杂交的结果与测序结果一致。     

寡核苷酸探针制备的优化

目的:探讨寡核苷酸微阵列制备中适合使用的探针浓度、探针缓冲液pH值、离子强度、优化杂交条件。方法:选取人白细胞抗原DQA1位点,针对多态性集中的外显子2设计一对保守引物及16条特异性分型探针;分别用ddH2O和0.1、0.2mol/L碳酸盐缓冲液(pH=7)稀释探针至100μmol/L;选取合适的缓冲液浓度后,调碳酸盐缓冲液为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0等6种pH值,选取最优pH值及离子强度,分别溶解探针至20、50、100、200μmol/L,比较上述不同条件的杂交结果。结果:用0.1mol/L、pH9的碳酸盐缓冲液溶解探针杂交效果最佳;探针浓度为20μmol/L时信号弱,其他浓度下无显著差别。结论:通过探针制备的优化可以提高杂交效率,探针浓度与杂交信号强度无明显正相关。     

β-地中海贫血基因检测膜条制备及其临床评价

根据GenBank报道的人β-珠蛋白序列及中国人β-地中海贫血基因特点,设计并合成30条探针用于检测在中国人中发现的17个β-地中海贫血基因突变位点,然后将探针点至醋酸纤维膜上,制成反向杂交膜条,通过检测950份标本,对其临床检测效果进行评价.共制备了含30条寡核苷酸探针的反向杂交膜条,临床验证结果表明,以对照膜条为标准,制备膜条阳性符合率为99.76%(421/422),特异性为99.05%(523/528),总符合率为99.37%.对6份检测结果不符的标本进行测序验证,结果为TATAbox-28/Int双重杂合子(1份)、TATAbox--32杂合子(1份)、IVS-1-5杂合子(3份)、-30杂合子(1份),均为少见突变位点,与制备膜条检测结果一致;采用等位基因特异性PCR法检测5个常见β-地中海贫血基因位点(CD41/42,IVS-2-654,CD17,TATAbox--28,CD71/72),检测结果与制备膜条完全相符.结果表明,研制的β-地中海贫血基因检测反向杂交膜条敏感度高,特异性好,不仅能准确检测中国人常见的β-地中海贫血基因类型,而且还能检测少见基因突变类型.     

PCR-SSCP分析结合直接测序检测β-地中海贫血患者基因突变型

聚合酶链反应－单链DNA构象多态性（PCR－SSCP）分析适用于DNA多态性分析和基因突变检测．在遗传病诊断及癌基因、抑癌基因等基因突变检测中得到日益广泛的应用［1,2］．我们把PCR－SSCP分析同直接测序结合起来,应用于β-地中海贫血患者基因突变型的检测．同时,对假阳性和假阴性结果出现的频率也作了观察．1材料和方法1．112例卜地中海贫血患者外周血样品,由中国人民解放军第303医院提供,按常规方法提取白细胞DNA［3］l．2PCR按文献介绍的方法进行”’．引物序列：174－ATCACTTAGACCTCACCCTGT（－118——一98）;…     

重型β-地中海贫血异基因造血干细胞移植术后的护理

目的总结异基因造血干细胞移植治疗重型β-地中海贫血的护理要点。方法对2007年12月~2014年2月在我科行异基因造血干细胞移植治疗的112例重型β-地中海贫血患儿的临床资料进行回顾性分析。结果 96例从层流病房转入普通病房治疗的患儿通过环境保护、饮食护理、心理护理等,有效地减少了并发症的发生,为家庭护理管理起到了承上启下的作用。结论精心的护理可降低儿童造血干细胞移植术后并发症发生率,促进了患儿的康复。     

基因编辑技术在β-地中海贫血治疗中的研究

β-地中海贫血(β-地贫)是一种全球性的单基因遗传病,目前针对该病的治疗方法除造血干细胞移植外都是对症治疗,无法达到根治效果。基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病,达到根治疾病的目的。近年,随着基因编辑技术的发展,基因治疗越来越成熟完善,在β-地贫治疗中的应用也变得广泛。目前,基因编辑技术发展经历了4个阶段,分别为ZFN技术、TALEN技术、CRISPR/Cas9技术以及单碱基编辑技术。本综述将总结上述4种基因编辑技术在β-地贫治疗中的原理、研究、优缺点以及局限性,旨在优化β-地贫的治疗策略。     

在中国壮族家系中发现的一例-α~T/-α~Q复合β~0β~0珠蛋白基因型

本文报道在我国广西隆林壮族中发现一个罕見的HbQ复合α,β地中海贫血家系。先证者女,18岁,贫血面容,肝脾肿大。化学结构分析确证本Hb变异体为HbQ Thailand[α74(EF3)Asp→His]。血红蛋白组成以及α和β珠蛋白基因分析结果表明,先证者的珠蛋白基因型为-α~Q/-α~T复合β°/β°(IVSI-1G→T/Codon17A→T);先证者父的基因型为-‘α~Q/-复合β~O/β~A(IVSI-1G→T/β~A);先证母的基因型为-α~T/αα复合β~O/β~A(Codon17A→T/β~A)。     

用聚合酶链反应和生物素寡核苷酸探针分析HLA-DQα的基因型

 来自不同人的染色体DNA经聚合酶链反应(PCR)将其HLA-DQα基因的多态区242bp人工地扩增30个循环。用1/10扩增产物点在尼龙膜上。将四种不同的等位基因特异的寡核苷酸(ASOs)经Bio-11-duTP进行3'末端标记得生物素探针。以此探针对不同扩增标本做狭缝印迹杂交。结果表明用此种非放射性的方法能探测出人白细胞表面抗原DQα基因的微多态性,从而得到不同个体的基因型。ASO分型是对血清HLA分型的重要补充和发展,它在骨髓或器官移植以及法医的个人识别中有一定实用价值。     

肽缀合反义寡核苷酸的合成和性能

反义寡核苷酸可作为基因表达的抑制剂和潜在的治疗药物,但多种类型的寡核苷酸为聚阴离子化合物,难以跨过细胞膜.已知包括融合肽、信号肽在内的多种生物活性多肽具有跨膜与核定位能力.讨论了反义寡核苷酸-肽缀合物的合成和生物活性.     

β-内酰胺的合成方法

本方法是以(R)-3-羟基丁酸甲酯为初始原料,合成β-内酰胺(简写4-AA)的一条路线,它的优点是:其初始原料(R)-3-羟基丁酸乙酯是通过生物发酵生产的具有天然手性的P3hb通过高温高压裂解得来的。去除了以往纯化学合成手性拆分的麻烦,大大缩短了合成路线,而且此路线成本较低,有利于工业化。     

APM和Liped两程序在β-地中海贫血特征连锁分析上的比较研究

Liped程序已广泛地应用在遗传方式明确的遗传病(或性状)家系的连锁分析上,具有精确、简便、快速和多效(如还可考虑突变的影响,以及依赖年龄的外显率等分析上)诸优点;但显然不能用于遗传方式尚未搞清的遗传病家系的连锁分析。晚近由Weeks编制的APM(Affected-Fedigree-Member,暂译为家系患者连锁分析)程序突破了Liped程序的上述局限性,具有更广泛的应用,且有更强的检测力;但该法只能估计连锁的显著性,还不能揭示连锁强度,因而还难以用于人类整个基因组的序列分析研究上。 本文以一个β-地中海贫血特征的大家系为实例,对上述两程序作了具体的比较研究。结果表明了上述两程序分别具有的优缺点,因此在连锁分析上可相互补充。     

一例CYP11B基因突变导致11β-羟化酶缺乏症的诊疗和基因检测分析

先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia,CAH)是一种常染色体隐性遗传病,在不同类型的CAH发病率中,11β-羟化酶缺乏症排第二位,该疾病的发生与人8号常染色体上CYP11B基因突变有关。本研究采集了1名14岁患者的外周血,通过提取基因组DNA,应用全外显子测序对其进行了基因检测,对疑似变异进行Sanger测序验证,并分析其特点。结果发现,患者CYP11B1基因第8外显子存在c.1226C>T纯合错义突变,导致其编码蛋白第409位丝氨酸突变为苯丙氨酸(p.Ser409Phe),从而影响血红素与酶的结合,最终导致CYP11B1酶活性丧失,引起一系列临床症状。这一突变目前尚未见国内外有相关报道。本研究丰富了CYP11B1基因变异谱,为进一步研究11β-羟化酶缺乏症的致病机制提供了临床资料和遗传资源。     

聚乙二醇修饰β-干扰素的研究

采用平均分子量为5kD的已活化的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)对重组人β-干扰素(rhIFN-β)进行化学修饰。优化修饰条件,选择对rhIFN-β反应性高的修饰剂,制备三种不同修饰程度的修饰物,并对修饰物进行初步检定。三种修饰物的修饰率分别为10．12％、22．99％、42．47％;比活性分别保留为原来的93．53％、48．69％、13．18％;PEG修饰后的rhIFN-β在pH7时的溶解度增加。     

采用随机突变方法对β-琼胶酶YM01-3活性位点的研究

【背景】琼胶酶是一种多糖水解酶,在保健食品、医药、科研及化妆品等行业极具价值。本实验室发现来源自嗜琼胶卵链菌(Catenovulumagarivorans)的β-琼胶酶YM01-3具有较高的酶活性,在最适条件下的比酶活可达到1.14×10~4U/mg。【目的】探讨不同位点的突变对β-琼胶酶YM01-3酶活力的作用,发现影响其酶活力的新位点。【方法】通过易错PCR在短芽孢杆菌(Bacillus brevis)表达系统中构建随机突变文库,从约10 000个克隆中筛选出227株有效突变体,从中选取80株进行测序。【结果】对突变体序列进行分析和定点突变验证发现,137位和237位氨基酸发生突变后酶活力丧失90%以上。【结论】位于催化腔内的137位和237位氨基酸,对于维持β-琼胶酶YM01-3酶活力具有重要作用。该研究结果为β-琼胶酶的催化机理研究及分子改造提供了借鉴。     

APM 和Liped两程序在β-地中海贫血特征连锁分析上的比较研究

Liped程序已广泛地应用在遗传方式明确的遗传病（或性状）家系的连锁分析上，具有精确、简便、快速和多效（如还可考虑突变的影响，以及依赖年龄的外显率等分析上）诸优点；但显然不能用于遗传方式尚未搞清的遗传病家系的连锁分析。晚近由Weeks编制的APM (Affected-Pedigree-Member,暂译为家系患者连锁分析）程序突破了Liped程序的上述局限性，具有更广泛的应用，日有更强的检测力；但该法只能估计连锁的显著性，还不能揭示连锁强度，因而还难以用于人类整个基因组的序列分析研究上。 本文以一个β-地巾海贫血特征的大家系为实例，对上述两程序作了具体的比较研究。结果表明了上述两程序分别具有的优缺点，因此在连锁分析上可相互补充。     

一个α,β地中海贫血复合家系β珠蛋白基因的进一步研究

 前文~[1]曾报道广西一个α,β地中海贫血复合家系的血红蛋白组成及α珠蛋白基因分析结果,并讨论了各成员可能的β珠蛋白基因结构情况。本文利用先进的PCR即基因扩增技术,结合特异寡核苷酸探针斑点杂交及扩增后直接测定DNA序列的技术,进一步研究并彻底搞请了该家系各成员的β珠蛋白基因结构情况。结果显示:母亲及两个弟弟都是编码子41—42TTCT四个碱基缺失造成框架位移所致β地中海贫血的杂合子。父亲与先证者的β基因均属正常。前三个成员均为α地贫复合β地贫,其α与β珠蛋白链合成的不均衡状态得到改善,贫血症状也明显轻。     

杰氏棒杆菌L-天冬氨酸α脱羧酶半理性改造及全细胞催化合成β-丙氨酸

β-丙氨酸是多个药物合成的重要砌块,可以通过天冬氨酸α脱羧酶（Pan D）催化L-天冬氨酸脱羧来合成,但普遍在用的Pan D酶活性不高是制约全细胞催化合成β-丙氨酸的瓶颈。因此,本研究通过酶的挖掘,选择将杰氏棒杆菌来源（Corynebacterium jeikeium）Pan D在Escherichia coli中异源表达。对杰氏棒杆菌来源Pan D进行Alaph Fold2建模和分子对接,采用Rosetta虚拟突变确定突变热点,结合薄层层析初筛和纯化后复筛,最终筛选到突变体L39A,其比酶活为13.45 U/mg,相比野生型酶的比酶活（9.6 U/mg）提升了1.4倍。酶学性质表征数据表明,野生型酶和L39A突变体最适p H均为6.5,且在p H 6.0-7.0之间酶活性稳定;两者最适温度为55℃,但L39A热稳定性较野生型提高;突变体酶的催化效率比野生型提升了1.4倍。对突变体进行结构解析发现,39位取代为侧链基团更小的丙氨酸,亲水性增强,增加了关键催化氨基酸58位酪氨酸与其他氨基酸的相互作用,使活性中心周围的区域稳定性提高,从而提高了催化活性。全细胞催化数据表明,在OD600=4...     

中国裸燕麦β-葡聚糖含量的鉴定研究

对来源于中国13个省（区）1010份和国外引进的4份裸燕麦品种（系）进行了β-葡聚糖含量的鉴定研究。结果表明,中国裸燕麦β-葡聚糖含量为2．0％～7．5％,其中含量〈3．00％的占6．61％,3．00％～4．99％的占86．4％。5．00％～5．99％的占5．72％,≥6．00％的占1．18％。按品种类型划分,地方品种的含量低于育成品种（系）。按来源地划分,河北、山西、内蒙古的含量较高,云南、贵州、四川的含量较低,而陕西的含量最低。同年不同地点或相同地点不同年份种植的相同品种（系）,含量有一定的变化（0．27％～0．83％）。在鉴定中筛选出一批高β-葡聚糖品种（系）。本研究不仅为燕麦高β-葡聚糖育种提供了理论依据和物质基础,而且为降脂燕麦保健片的生产提供了优良品种。