重叠延伸PCR法合成EV71 VP1-LTB融合基因及其原核表达

目的用重叠延伸PCR（overlap extension PCR）法获得人肠道病毒71型vp1与大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位（ltb）的融合基因,构建EV71 VP1-LTB融合表达质粒并在原核系统表达。方法设计14对引物通过重叠延伸PCR技术合成vp1基因,以ETEC（44815）质粒DNA为模板,PCR扩增ltb基因,将vp1基因与ltb基因连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pBEX,构建重组质粒pBEX-VP1-LTB,转化E.coliB1221（DE3）进行表达,SDS-PAGE及W estern blotting分析其表达。电转法将重组质粒转入双歧杆菌。结果合成的vp1基因全长891 bp,测序结果与预期相符,重组表达质粒pBEX-VP1-LTB经PCR及双酶切鉴定,表明构建正确;目的蛋白在E.coliBL21（DE3）中获得了表达,Western bloting分析结果表明该蛋白具有与EV71 VP1抗体的反应原性;电转法成功将重组质粒转入双歧杆菌。结论应用重叠延伸PCR技术成功构建了EV71 VP1-LTB融合表达质粒,并在E.coliBL21（DE3）中获得有生物学功能的VP1表达产物,重组质粒双歧杆菌转化及VP1-LTB融合蛋白的表达研究,为研制EV71分子内佐剂疫苗打下了基础。     

‘黄花’梨及其芽变‘绿黄花’梨HHT基因克隆与表达分析

该试验以砂梨品种‘黄花’梨（果皮褐色）及其芽变‘绿黄花’梨（果皮绿色）盛花后第8周的果皮为试材,利用常规PCR和巢式PCR技术克隆了ω 羟基棕榈酸O 阿魏酰转移酶（ω hydroxypalmitate O feruloyl transferase, HHT）基因cDNA的全长,命名为 PpyHHT（登录号为KX131155）。序列分析结果表明,该基因开放阅读框（ORF）为1 335 bp,编码444个氨基酸。生物信息学分析显示,推定的PpyHHT蛋白质相对分子质量为49.91 kD,等电点是4.75,与白梨相似性高达98%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT PCR）表达分析显示,2种梨果皮中 PpyHHT基因在盛花后6~9周的4个转色关键期表达量不断变化,在‘黄花’梨果皮中的表达量明显高于‘绿黄花’梨。推测 PpyHHT基因可能参与砂梨果实褐色/绿色性状的形成。     

可用于实时荧光定量PCR标准化的白桦内参基因

为了快速、准确的对白桦多个样品进行基因表达分析,本研究应用荧光定量PCR技术,对白桦持家基因微管蛋白基因（Tu）和泛素基因（UbQ）在不同处理的细胞及不同树龄或不同生长季节白桦植株各部位表达的稳定性进行检测。结果表明,对于茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）处理的白桦细胞和不同生长季节白桦植株的基因定量表达分析,可同时使用Tu和UbQ平衡化qRT-PCR数据;而针对不同树龄白桦茎皮中基因表达研究时,单独使用UbQ基因作为内参对照即可获得精确的表达数据。     

水稻OsRPL36A基因的表达特性研究

【目的】核糖体蛋白（ribosomal protein,RP）是参与蛋白质合成及基因表达调控的一种重要因子,在植物生长发育和胁迫响应过程中具有重要的作用。研究在水稻中克隆了1个核糖体蛋白家族基因OsRPL36A,并对其生物学功能进行初步研究,为后续OsRPL36A基因功能研究提供理论依据和研究方向。【方法】利用生物信息学技术分析OsRPL36A基因结构、顺式作用元件和演化过程;同时利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）技术分析OsRPL36A的组织表达特异性、节律表达模式、及其对不同激素和非生物胁迫的响应情况。【结果】（1）OsRPL36A的编码区全长为297 bp,共编码98个氨基酸,属于核糖体蛋白L36超基因家族。（2）OsRPL36A的启动子区包含3个节律表达相关元件、10个光响应元件、14个激素响应元件和27个环境胁迫响应元件。（3）OsRPL36A在叶片中的表达量相对高于其他组织;具有典型的节律表达模式;且受IAA、高温、低温和渗透胁迫等诱导表达。【结论】OsRPL36A在叶中高表达,具有典型节律表达模式,对IAA显著响应,可能参与热激、低温、盐害和渗透胁迫响应。     

文心兰乙烯不敏感基因EIN2的克隆及表达分析

该研究采用PCR、RACE方法,对文心兰‘南茜’的乙烯不敏感蛋白基因（ethylene insensitive 2,EIN2）进行克隆及生物信息学分析,并采用qRT PCR技术,对该基因在文心兰不同组织器官和不同花期中的表达模式进行分析。结果表明：（1）成功克隆得到文心兰_EIN2基因序列,命名为OnEIN2（MH497388）;该基因cDNA序列全长为4 177 bp,其中开放阅读框3 879 bp,编码1 292个氨基酸,3′非编码区长208 bp,5′非编码区长90 bp。（2）生物信息学分析显示OnEIN2是一个不稳定的疏水蛋白,含有跨膜结构,分子式为C₆₄₀₆H₉₉₈₈N₁₆₇₀O₁₈₉₇S₄₇;蛋白质分子量142.22 kD,理论等电点5.80。多序列比对和系统进化分析表明,文心兰EIN2与铁皮石斛EIN2的相似度最高（81.98%）,二者亲缘关系也最为接近。（3）实时荧光定量PCR分析发现,OnEIN2基因在根、茎、叶花中均有表达,在花中表达量最高,茎中表达量最低;而在不同花期中,盛开期表达量最高,其次是衰老期。研究表明,文心兰OnEIN2基因在开花和衰老过程中可能有重要的作用。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及原核表达

利用反转录PCR（RT-PCR）和套式PCR（nest Polymerase Chain Reaction ,nPCR）技术扩增出当前猪瘟流行毒（广西玉林株,GXYL）与中国猪瘟兔化弱毒（C-株）兔脾组织毒E₂基因的主要抗原区,将其克隆到表达载体pP_ROEX-HTb中,获得重组质粒pP_ROEX-GXYL和pP_ROEX-C,经PCR、酶切和序列分析鉴定表明,插入的位置、大小和读码框均正确。 SDS-PAGE检测表明,经重组质粒pP_ROEX-GXYL和pP_ROEX-C转化、诱导的受体菌能表达E₂基因主要抗原区蛋白,Western-blot检测表明,诱导表达的抗原蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应。      

内蒙古地区鄂伦春族人红细胞CR1基因组密度多态性的研究

目的：研究内蒙古地区鄂伦春族人红细胞CR1基因组密度多态性。方法：PCR-SSP技术是使用能够特异识别特定等位基因的引物通过PCR扩增检测序列多态性的方法,根据PCR产物的有无进行等位基因的分型。本研究采用PCR-SSP技术对内蒙古地区198例鄂伦春族人群进行CR1基因组密度多态性分析。结果：198例鄂伦春族中CR1基因高表达（HH）型占63．64％,中表达（HL）型占34．34％,低表达（IJL）型占2．02％,与北方汉族相比HH和HL型差异有显著性（P〈O．05）。结论：鄂伦春族人群CR1基因密度分布有其独特的规律。     

猕猴桃6个LOX基因家族成员实时定量PCR引物特异性的检测与应用

从基因家族成员的视角开展基因表达研究是阐明基因功能的重要组成内容,实时定量PCR（QPCR）技术是分析基因表达的有效手段.以猕猴桃脂氧合酶（LOX）基因家族6个成员为对象,分析了引物特异性的检测方法.该方法整合了熔点曲线分析、琼脂糖电泳、交叉PCR扩增和PCR产物测序等分析手段,有效消除其他成员的交叉扩增干扰,为利用QPCR检测基因家族成员表达提供了特异、准确与可行的途径.     

胡萝卜肉桂醇脱氢酶基因的克隆及其对非生物胁迫的响应

该实验采用RT PCR技术,从胡萝卜‘黑田五寸’中克隆获得了编码肉桂醇脱氢酶（Cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD）的基因DcCAD。DcCAD序列长1 074 bp,编码357个氨基酸。亲水/疏水性分析表明,DcCAD属于亲水性蛋白。系统进化分析显示,DcCAD与番茄CAD（XP_010314515.1）亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,DcCAD基因在胡萝卜根、叶片和叶柄中的表达量差异显著,其相对表达量为叶片＞根＞叶柄。DcCAD基因对高温（38 ℃）、低温（4 ℃）、干旱（20% PEG）和盐（0.2 mol·L^-1 NaCl）胁迫均有响应,尤其对高温胁迫和低温胁迫响应明显,而且高温处理后1 h和低温处理后2 h表达量最高。研究推测,DcCAD基因对胡萝卜抗逆性具有一定的作用。     

沉默Gpr3基因表达对猪卵泡颗粒细胞凋亡的影响

G蛋白偶联受体3（G protein-coupled receptor 3,Gpr3）属于G蛋白偶联受体超家族成员,能够维持卵泡卵母细胞减数分裂的前期阻滞,但在卵泡颗粒细胞中的作用不清。该研究利用RNAi技术,以化学合成的siRNA转染体外培养的猪卵泡颗粒细胞,并利用Real-time PCR和Western blot技术检验Gpr3基因的沉默效果;利用MTT（四甲基偶氮唑盐）、流式细胞术和Real-time PCR技术检测沉默Gpr3基因表达对猪卵泡颗粒细胞凋亡以及凋亡相关基因表达的影响。结果显示,Gpr3-siRNA能够有效地抑制猪卵泡颗粒细胞中Gpr3基因mRNA和蛋白的表达（P〈0.01）;在沉默Gpr3基因表达后,猪卵泡颗粒细胞的细胞活性由0.419升高至0.586,同时细胞凋亡率由2.67%下降至0.42%,并在显著上调Bcl-2表达的同时,下调了Bax的表达（P〈0.05）。结果表明,沉默Gpr3基因的表达抑制了猪卵泡颗粒细胞的凋亡,其机制可能与调控Bcl-2和Bax表达有关。     

猪链球菌2型全基因组DNA芯片的研制及基因表达谱技术平台的建立

目的：研制猪链球菌2型（SS2）全基因组DNA芯片,建立SS2基因表达谱技术平台。方法：利用SS2全基因组序列,挑选出2194条基因,经PCR扩增出2156条基因并将产物纯化,点样制备芯片;将芯片用于表达谱研究,采用实时定量PCR验证表达谱结果,对芯片进行可靠性分析。结果：芯片杂交数据与实时定量PCR验证显示了较高的相关性,二者相关系数r=0.87。结论：研制了一批SS2全基因组DNA芯片,并建立了基于DNA芯片的表达谱技术平台。     

用基因芯片结合荧光差异显示—PCR筛选和识别胃腺癌转移相关的基因

使用来源于同一个胃腺癌病人的原发灶RF－1（ATCC编号：CRL－1864）和转移灶RF－48细胞系（ATCC编号,CRL－1863）作为研究肿瘤转移分子机制的模型,RF－1（实验组）和RF－48（对照组）的mRNA通过逆转录方法,将Cy3和Cy5两种荧光染料分别标记到两种细胞的cDNA上,制备成cDNA探针,并与表达谱芯片（双点4096条基因）进行杂交与扫描,重复2次实验,利用计算机数据处理判断基因是否在上述两种细胞中有表达差异,共筛选出差异表达的基因共138条,其中81条在RF－48细胞中表达明显上调,57条在RF－48细胞中表达显著下调,同时也通过荧光差异显示－PCR（FDD－PCR）技术,克服了45个涉及胃腺癌转移相关基因,包括未被发现的基因3个,在两种筛选方法中都存在差异表达的基因共有7条,对部分可能与肿瘤志移机制有关的差异表达基因的作用进行了分析和讨论,基因芯片技术可高通量,大规模地研究基因表达水平,FDD－PCR技术可克隆出未发现的新基因,二者结合,初步筛选出与转移相关的基因,有助于揭示胃腺癌转移的分子机制。     

热休克蛋白70（HSP70）对HBV复制及抗原分泌的影响

目的了解慢性乙型肝炎患者（CHB）血清中热休克蛋白70（HSP70）与HBV—DNA的关系,并探讨HSP70能否影响乙型肝炎病毒（HBV）的复制与抗原分泌。方法选择安徽医科大学第二附属医院住院和门诊CHB患者60例为研究对象,并以30例健康体检人群为对照者,采用酶联免疫技术（ELISA）分析CHB患者和对照者血清HSP70表达水平,运用荧光定量PCR技术分析CHB患者血清HBV—DNA复制水平;以RNA干扰（RNAi）技术抑制HepG2．2．15细胞中HSP70基因的表达,同时分析细胞培养上清中HBVDNA以及相关抗原的表达情况。结果CHB患者血清中HSP70的表达水平明显高于其在健康对照者血清中的表达水平（P〈0．05）,且与HBV—DNA拷贝数呈正相关性（r=0．540,P〈0．05）;其中HBeAg阳性的CHB患者血清中HSPT0的表达水平也显著高于HBeAg阴性CHB患者血清中的表达水平（P〈0．05）。以RNAi技术特异性降低HSP70在HepG2．2．15细胞中的表达,HepG2．2．15细胞培养上清中HBV—DNA和相关抗原的分泌量明显降低（P〈0．05）。结论HSP70蛋白很可能在HBV的生命周期中发挥重要作用,从而影响HBV的复制和乙型肝炎的进展。     

桃蛀螟成虫Orco嗅觉受体基因的克隆及组织表达谱分析

【目的】克隆桃蛀螟Conogethes punctiferalis (Guenée)的Orco嗅觉受体基因, 并研究其在不同组织的表达谱。【方法】利用PCR技术克隆桃蛀螟触角Orco基因, 对该基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析, 并利用荧光定量PCR技术分析该基因在的表达量。【结果】获得桃蛀螟成虫Orco的cDNA全长序列, 并命名为CpunOrco（GenBank登录号： JX101681）。该基因的开放阅读框全长1 425 bp, 编码475个氨基酸, 序列中有7个跨膜区。对桃蛀螟成虫不同组织中CpunOrco的荧光定量PCR结果表明, CpunOrco主要在触角和下颚须中表达, 雄虫触角中的表达量高于雌虫, 并且该基因在其他组织中也有一定的表达。【结论】本研究明确了该嗅觉受体基因在桃蛀螟成虫不同组织内的表达水平, 为进一步研究其功能提供了理论依据。     

文心兰不育花粉粒形态观察及相关基因克隆与表达分析

该研究以文心兰品种‘柠檬绿’（雄性不育）和‘巧克力’（可育）为试验材料,对花粉团和花粉粒的形态进行观察,并在转录组数据分析的基础上,利用RT PCR技术从‘柠檬绿’中克隆了1个MYB转录因子基因（OnMYB106）,用qRT PCR技术分析该基因的相对表达量,以初步鉴定‘柠檬绿’花粉败育特征,揭示花粉败育与OnMYB106基因的调控关系。结果显示：（1）‘柠檬绿’花粉团药室明显变扁,外壁凹陷、皱缩。（2）‘柠檬绿’花粉细胞内含物缺失,细胞质空泡化严重,花粉粒形态异常,花粉壁发育不连续,有许多孔洞（并非萌发孔）。（3）成功克隆获得‘柠檬绿’MYB106的基因序列,命名为OnMYB106,其开放阅读框为819 bp,编码272个氨基酸;其基因组序列与cDNA比对显示,OnMYB106基因含有3个外显子和2个内含子。（4）生物信息学分析表明,OnMYB106属于SANT 超家族,具有2个连续的MYB DNA binding结构域,是一个典型的R2R3 MYB转录因子;进化树分析表明,OnMYB106与高粱、水稻和二穗短柄草的MYB106蛋白序列的一致性最高,进化距离最近。（5）qRT PCR分析显示,OnMYB106在‘柠檬绿’花粉团中下调表达;该基因在‘柠檬绿’不同组织器官中均有表达,但在花中表达量最高,假鳞茎中表达量最低;在不同花期中,花苞期表达量最高,盛开期只有微量表达。研究认为,‘柠檬绿’花粉壁发育异常可能导致其花粉败育;OnMYB106基因可能在‘柠檬绿’花器官的生长发育中起重要的调控作用,并且该基因可能属于花粉发育“早期”表达基因,主要影响‘柠檬绿’花粉壁的的形成。     

基于CRISPR/Cas9系统构建绵羊VASA基因敲入载体及验证

本研究旨在探索VASA基因在绵羊睾丸发育中的表达变化,并通过构建VASA基因敲入载体,为下一步进行绵羊生殖细胞体外诱导分化研究提供基础。采集性成熟前后即3月龄（3-month-old,3M）和9月龄（9-month-old,9M）绵羊睾丸组织,利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,qPCR）和Western blotting技术分析VASA基因的差异表达,并利用免疫组织化学技术对VASA基因的表达定位进行分析。设计靶向VASA基因的向导RNA （guide RNA,gRNA）,并构建同源重组载体,进行质粒转染绵羊耳成纤维细胞。结合CRISPR/dCas9技术对VASA基因进行激活,进一步验证载体效率。结果表明,VASA基因随着绵羊睾丸发育,表达水平极显著增加（P<0.01）,且主要定位在精母细胞和圆形精子细胞中。利用CRISPR/Cas9系统构建了VASA基因敲入载体,联合pEGFP-PGK puro-VASA载体转染耳成纤维细胞,CRISPR/dCas9系统激活后,耳成纤维细胞成功表达VASA基因。结果提示,VASA基因在绵羊睾丸发育和精子发生中发挥潜在功能,且通过CRISPR/Cas9系统可在体外构建VASA基因敲入载体,为下一步探究VASA基因对绵羊雄性生殖细胞的发育和分化提供有效的研究手段。     

香菇C91-3转录本Unigene 24277基因克隆表达及其生物学活性的研究

通过对香菇C_91-3转录本Unigene 24277基因的生物信息学分析,克隆表达含RCC1结构域的Unigene 24277基因,并研究其抗肿瘤活性。从香菇C_91-3菌丝体中提取总RNA,反转录合成cDNA,并利用Rapid Amplification of cDNA Ends（RACE）技术获得基因全长。NCBI数据库分析提示其含有RCC1结构域。PCR扩增RCC1结构域,将其克隆产物与pET-32a（+）载体连接,热转化至E.coil Rosetta-gami（DE3）中诱导表达,纯化、复性后,通过MTT法研究其抗肿瘤活性。结果显示原核表达载体构建成功,重组蛋白成功诱导表达,并初步证明了重组蛋白具有抑制肿瘤细胞增殖活性的功能,为后续抗肿瘤机制的探究奠定了基础。     

烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒双价RNA沉默抗病载体的快速构建*

利用重组PCR技术将烟草花叶病毒(TMV)部分移动蛋白基因（△MP）和黄瓜花叶病毒（CMV）部分复制酶基因（△Rep）连接起来,获得全长约1000 bp的MP-Rep融合基因,将所得融合基因以反向重复的方式与大豆内含子相连,并定向插入到植物表达载体pBIN438上35S启动子下游,构建了含两种不同病毒来源基因的植物表达载体pBIN438-MP-Rep（i/r）。酶切和PCR鉴定证明所构建的载体与预期的设计完全一致。该研究结果为利用RNA沉默原理进行植物广谱抗病研究奠定了基础。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及原核表达

利用反转录PCR（RT－PCR）和套式PCR（nest Polymerase Chain Reaction,nPCR)技术扩增出当前猪瘟流行毒（广西玉林株,GXYL)一中国猪瘟兔化弱毒（C－株）兔脾组织毒E2基因的主要抗原区,将其克隆到表达载体pPROEX-HTb中,获得重组质粒pPROEX-GXYL和pPROEX-C,经PCR,酶切和序列分析鉴定表明,插入的位置,大小和读码框均正确。SDS－PAGE,检测表明,经重组质业pPROEX-GXYL和pPROEX-C转化,诱导的受体菌能表达E2基因主要抗原区蛋白,Western-blot检测表明,诱导表达的抗原蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因的克隆表达及表达产物免疫原性的鉴定

目的：克隆表达恶性疟原虫（Hasmodium falciparum,p．f）海南株（FCC1／HN）乳酸脱氢酶（LDH）,并对其免疫原性进行鉴定．为制备抗LDH抗体用于胶体金法快速检测疟原虫奠定基础。方法：应用PCR技术对恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDHpf）基因进行特异性扩增,将扩增产物克隆入表达载体pET-32a（＋）,重组表达载体经鉴定后诱导表达;重组LDHpf（rLDHpf）经纯化后,免疫家兔制备兔抗rLDHpf免疫血清,间接免疫荧光和Western印迹鉴定表达产物的免疫原性。结果：构建了pET-32a／LDHpf重组表达载体,测序后同源性分析显示p．f不同株间LDH氨基酸序列同源性大于98％,不同种间同源性也在90％以上;间接免疫荧光和Western印迹分析显示rLDHpf具有较好的免疫原性。结论：LDHpf基因高度保守;rLDHpf得到高效表达并具有良好的免疫原性。