人胎盘核糖核酸酶抑制因子研究

人胎盘核糖核酸酶抑制因子研究崔秀云,田余祥（大连医科大学,大连１１６０２３）关键词人胎盘核糖核酸酶抑制因子人胎盘核糖核酸酶抑制因子（ｈｕｍａｎｐｌａｃｅｎｔａｌｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ,ＰＲＩ）是一种酸性胞溶性蛋白质,分子量为５０ｋ...     

宫颈癌患者核糖核酸酶抑制因子基因突变的分析

目的通过对宫颈癌患者血液核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因RNH的突变分析,探讨RNH基因与肿瘤生长的关系。方法针对RNH全基因序列设计21对引物,PCR扩增后采用SSCP对突变进行检测。结果正常人和宫颈癌患者均扩增出相应的21个条带,未发现异常;经过SSCP分析未发现所收集的18例宫颈癌患者血液中的RNH基因有突变发生。结论尚不能肯定RNH基因的突变是否与肿瘤无关,也不能肯定其他肿瘤没有发生突变。需缩小检测片段进一步实验。     

核糖核酸酶抑制因子对血管生成素功能的调控

血管生成素（angiogenin,ANG）能有效促进血管生成和肿瘤细胞增殖,在肿瘤发生发展中起重要作用.其主要分子机制是通过核转位和激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,刺激rRNA转录和核糖体生成.ANG也被发现在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病（PD）患者中存在基因编码区的功能突变,表明其在运动神经元生理方面发挥作用,其缺陷是神经退行性疾病的一个危险因素.核糖核酸酶抑制因子（ribonuclease inhibitor,RI）是胞内酸性蛋白质,由460个氨基酸残基组成,分子质量约为50 kD,当其与核糖核酸酶A（RNaseA）结合形成复合物后,可抑制RNaseA 的90％以上活性,从而有效调节细胞内RNA水平. ANG具有低核糖核酸酶活性, 是RNase超家族一员,与RNase A有着高度保守的同源顺序. 序列、结构和酶学等分析表明,RI也能够与ANG紧密结合,且得到体外实验的证明. 研究发现,RI具抑癌基因功能;RI与ANG在细胞内共定位;Co IP和GST pull down证实其相互作用,获取了RI与ANG在体内结合的直接证据;RI与AKT磷酸化表达负相关.在膀胱癌细胞及临床标本中证实了RI与 ANG和PI3K/AKT通路分子表达的相关性及与肿瘤细胞生长与转移的关系．在细胞和动物模型研究表明,RI调节ANG活性的功能及其分子机制,即RI通过结合ANG而封锁其核转位和调控PI3K/AKT/mTOR信号通路及其相关通路交互应答（cross talk）的能力,从而抑制肿瘤生长及转移. RI是一个有希望的抗肿瘤蛋白新药和血管生成抑制剂,可望成为基因治疗的靶基因.     

核糖核酸酶抑制因子与衰老关系的研究

本文研究了红细胞核糖核酸酶抑制因子(RI)活力在小鼠和人增龄时的变化。在3、7、17和34周龄?性小鼠(BALB/C,ICR和DBA/2)的实验中,观察到红细胞RI活力随小鼠周龄的增加而显著下降。用20—60岁健康人为研究对象,发现红细胞RI的活力变化与增龄具有线性相关。y=-43.25x+5290,r=0.477,P<0.001,n=58。 本文提出;红细胞RI活力随增龄而下降,能反映生物年龄的变化,并对RI在细胞代谢的意义及与衰老的关系进行了讨论。RI的研究为阐明衰老机理提供了一条途径。     

高表达人核糖核酸酶抑制因子的乳腺癌细胞株的建立及其鉴定

目的建立稳定高表达人核糖核酸酶抑制因子（hRI）的真核细胞系：乳腺癌细胞系,为进一步研究hRI抗肿瘤、抗氧化的作用机制奠定实验基础。方法将hRI通过逆转录病毒载体（pLNCX-hRI）经过病毒包装细胞（PA317）包装后的高滴度病毒上清,感染乳腺癌（MCF-7）细胞系,经G418筛选后,运用RT-PCR、Western blot等方法进行鉴定hRI在MCF-7中的高表达。结果hRI克隆到乳腺癌细胞（MCF-7）基因组,并随着基因组稳定高表达hRI。结论利用逆转录病毒载体感染真核细胞后获得高表达hRI的肿瘤细胞株,从而为进一步研究真核细胞内hRI的抗肿瘤作用机制提供条件。     

核糖核酸酶抑制因子(RI)的融合表达与复性

应用PCR技术从核糖核酸酶抑制因子 (ribonucleaseinhibitor ,RI)的克隆载体pT7 ri中扩增出ri片段 (1 5kb) ,亚克隆到融合表达载体pGEX 2T中 ,并转化感受态大肠杆菌BL2 1.异丙基半乳糖苷 (IPTG)诱导表达的GST RI经SDS PAGE证明分子量约 76kD ,表达量约占菌体蛋白总量 2 0 % .以包涵体形式表达的目的蛋白经尿素变性 ,透析复性得到的产物具有较高的抑制RNaseA的活性(15 0U ml) .复性的融合蛋白于 2 4℃经凝血酶作用 16h ,可被切割成 5 0kD的RI和 2 6kD的GST .     

人核糖核酸酶抑制因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含有人核糖核酸酶抑制因子（hRI）基因的重组腺病毒载体。方法以含有全长cDNA的pT7-RI为模板,PCR扩增hRI,经T载体克隆后,酶切亚克隆到穿梭质粒pAdTrack—CMV上,在BJ5183细菌内和pAdEasy-1同源重组。筛选阳性克隆,酶切、PCR及测序鉴定,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增。通过观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果酶切鉴定及PCR结果证明hRI基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度为1．5×10^10 pfu/ml。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含hRI基因的重组腺病毒载体。     

双点突变核糖核酸酶抑制因子在毕赤酵母中的表达及对抗氧化能力的影响

人胎盘核糖核酸酶抑制因子(HRI)是一种存在于细胞浆中的50 kDa的酸性蛋白质,富含亮氨酸和半胱氨酸。作为胞浆蛋白可保护细胞不受外来的胰RNase的侵袭。HRI有32个半胱氨酸残基,且多数半胱氨酸残基是成对的并在序列上相连。文章用丙氨酸同时取代cys328/cys329,并将此双突变的HRI的cDNA片段构建于质粒pPIC9K,电击转化入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,进行分泌型表达。对表达产物进行亲和层析纯化及抗氧化活性检测。实验结果表明,双点突变后的HRI对RNase A的亲和力几乎没有影响,但其抗氧化能力却增加7～9倍。此种抗氧化能力的提高可能是因为在cys328-cys329之间不能形成二硫键而稳定了HRI的三维结构所致。     

A FLUOROMETRIC ASSAY FOR CHOLINE ACETYLTRANSFERASE and ITS USE IN THE PURIFICATION OF THE ENZYME FROM HUMAN PLACENTA

Abstract— A fluorometric assay for choline acetyltransferase has been developed. This assay is based on coupling the choline acetyltransferase dependent formation of acetyl-CoA from acetylcholine and coenzyme A, to the reactions catalyzed by the enzymes citrate synthase and malic dehydrogenase. Although this assay is not as sensitive as previously described radiometric assays, it can be conveniently used during enzyme purification.
Employing this assay method, choline acetyltransferase has been purified from human placenta to a specific activity of 92.7 μmol acetylcholine formed/min/mg protein.     

高压快速柱分离纯化牛血球超氧化物歧化酶的研究

以牛血球为材料,经溶血等处理和丙酮沉淀,获得牛血球超氧化物歧化酶粗品。此粗酶可以通过ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ快速柱层析,获得超氧化物歧化酶纯品。纯化的酶比活可达１３５００ｕ／ｍｇ,经ＰＡＧＥ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和快速蛋白液相色谱（ＦＰＬＣ）检测,结果表明,纯化酶是均一的Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝胶过滤测得该酶分子量为３１,８００,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得亚基分子量为１５     

细胞色素P450scc在人早期胎盘中的表达(简报)

人妊娠期间,胎盘合成大量的类固醇激素,与妊娠的启动、维持、分娩以及胎儿的发育均存在密切的关系。阐明胎盘类固醇激素特别是孕酮合成与分泌的调节机制对于寻找理想的生育调控技术和生殖保健方法具有重要的意义。因此,胎盘类固醇激素合成与分泌的调节向来是生殖生物学与妇产科学领域所关注的焦点问题之一,并为此开展了大量的研究,但迄今仍不清楚,其主要原因之一是     

抗人胃癌单链抗体的分离纯化及其活性测定

用已经构建的工程菌高效表达抗人胃癌链缺本并使用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００柱层析分离纯化抗体蛋白。同时用免疫竞争抑制实验,测出单链抗体具有特异性结合胃癌抗原活性。     

球孢白僵菌胞外壳聚糖酶的纯化和性质*

球孢白僵菌Beauveria bassiana 1316-V1的培养上清液经硫酸铵分级沉淀,Sephadex G-75凝胶过滤,Chitosan-bead亲和层析,第二次Sephadex G-75凝胶过滤, 得到电泳纯的一种胞外壳聚糖酶,比活力达到45u/mg 。此酶的分子量为36 kD; 最适酶反应温度为60℃;最适pH为4.0;最适离子强度为 0.25mol/L NaCl; 37℃以下,pH 2.0~5.0之间稳定性好; Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ni2+ 对该酶有强烈抑制作用;Ag+、Mn2+也有较强抑制作用;Fe2+有轻微激活作用。该壳聚糖酶是一种糖蛋白,含糖约为12.6%。酶的最适底物为脱乙酰度为90%的胶体壳聚糖;也能轻微水解CMC、DEAE-Cellulose和胶体几丁质;但不能水解片状的壳聚糖和几丁质。     

杭州虻纤溶酶的纯化及其生物活性分析

经过７５％硫酸铵沉淀、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶过滤层析、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５离子交换层析、Ｂ ｅｎｚａｍｉｄｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析,从杭州虻（Ｔａｂａｎｕｓ ｈｏｎｇｃｈｏｗｅｎｓｉｓ）腹部匀浆液中分离纯化出分子量约为３６．５ｋＤ的纤溶酶ＴＨＦＥ。经纤维蛋白平板测定表明,ＴＨＦＥ既具有纤溶酶作用,又具有激活纤溶酶原的作用。ＴＨＦＥ能分解纤溶酶原激活剂的生色底既具有纤     

人脑醛糖还原酶的纯化和一些基本性质

使用DEAE纤维素柱层析、PBE-94层析聚焦、NADP~+-Sepharose 4B亲合层析及SephadexG-100凝胶过滤分离纯化了人脑醛糖还原酶。在DEAE层析中,用咪唑-HCI缓冲液替代了磷酸缓冲液,改善了分离效果。在聚丙烯酰胺及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,纯化的人脑醛糖还原酶均呈一条区带。它的pI为5.6,最适pH为6.5,分子量为36,000,底物特异性和氨基酸组成与其它哺乳动物的醛糖还原酶有相似性。开链式醛糖是醛糖还原酶的真正底物,它在开链式和半缩醛的平衡体系中占比例极小,因而推知醛糖还原酶对此底物有很高的K_(cat)和K_(cat)/K_m值,能有效地将它们还原成相应的醇。     

PURIFICATION OF SOLUBLE GLYCOPROTEINS FROM HUMAN NERVOUS TISSUE AND LIVER

—The isolation of some water-soluble, 50% methanol-soluble glycoproteins from human normal brain, human ependymoma and human liver is reported. One of them (AM protein) has a similar, or even identical, electrophoretic mobility to brain-specific protein S-100 under certain electrophoretic conditions. Although bands of identical mobility are found in both brain and liver samples, we lack experimental evidence, at the present stage of this work, to draw conclusions on the identity (or relatedness) of such proteins. On the other hand, the brain-soluble glycoproteins appear to be antigenically different from brain protein S-100, from brain α₂-glycoprotein and from GP 350 glycoprotein.     

竹红菌甲素对红细胞膜上几种酶光敏失活作用的研究

本文比较了竹红菌甲素对人红细胞膜AchE,GPDH,Na~ -K~ ATPase和Ca~(2 )-Mg~(2 )ATPase的光敏失活能力,结果表明甲素对Ca~(2 )-Mg~(2 )ATPase作用最强,Na~ -K~ ATPase次之,GPDH再次之,AchE最不敏感,甲素还引起膜蛋白巯基氧化,膜脂质过氧化。其中,巯基氧化可能是ATPase光敏失活的主要原因,而脂质过氧化对ATPase活力损伤作用不大。游离GPDH不如与膜结合的GPDH敏感。GSH,NAD分别对ATPase,GPDH有保护作用。膜蛋白的电泳及内源荧光证据表明:在GPDH活力受到严重损伤时,酶结构并未发生剧烈改变。     

草鱼血清IgM蛋白的纯化及抗血清的制备

采用盐析法、重组蛋白A(HiTrapr Protein A Sepharose)亲和层析法分离纯化草鱼血清中的IgM,并通过SDS-PAGE及Western-blot技术对纯化蛋白的部分特性进行分析比较并制备兔抗IgM抗血清。结果表明:33%硫酸铵溶液可以沉淀血清中大部分蛋白,但电泳条带仍较多,其中含有78kD和28kD的条带,因此仅可作为免疫球蛋白粗提的方法;而rProtein A亲和层析法所提蛋白则仅有上述重链(78kD)和轻链(28kD)。Western-blot显示,鼠抗人Ig抗体可与78kD及28kD条带发生发应。rProtein A亲和法提纯蛋白的纯度较高,但含量较低,条带较淡,仅可作为实验室小量提纯草鱼IgM的有效方法。将提纯的蛋白免疫实验兔后可制得效价高达1:25600的兔抗鱼IgM血清,并测得血清蛋白总量和IgM含量分别为25.87mg和4.5mg,IgM占血清蛋白总量的17.39%。本实验所采用的蛋白A亲和层析法提取草鱼血清IgM可以方便、快捷地获得高纯度的产物,适合在实验室中纯化鱼类IgM。同时本研究所制备的兔抗草鱼IgM血清也为今后的相关研究工作打下基础。