重组人干扰素βser17工程菌发酵培养条件的优化研究

实验对重组人干扰素βser17(rhIFNβser17)工程菌的发酵培养条件进行了研究,通过实验优化确定了适宜rhIFNβser17表达的培养基、诱导剂使用浓度、诱导时期和诱导后的收获时间等,建立了发酵培养工艺,并在50L发酵罐进行了中试发酵,菌体收获量湿重达13.08g/L,rhIFNβser17表达量占菌体总蛋白的20.2%,纯化后比活性达2×107IU/mg蛋白以上,为进一步的下游开发奠定了基础。     

注射用重组人干扰素βser17的分离纯化及鉴定

重组人干扰素βser17(rhIFN βser17)工程菌经发酵培养后,采用高压匀浆破菌、离心分离包涵体、有机抽提、酸沉淀、SephacrylS -200、SephadexG -75等进行分离纯化,通过各种方法对终产品进行鉴定。结果显示,纯化的rhIFN- βser17比活性超过 2×107IU/mg,纯度超过 99%,其它各项质量指标均符合质量标准。通过研究建立了大规模制备rhIFN- βser17的纯化工艺,研制出了符合规程要求的注射用rhIFN -βser17纯品,为临床研究奠定了基础。     

重组人干扰素—β在大肠杆菌中的表达与活性分析

利用定点突变技术将人干扰素-β第17位半胱氨酸编码序列突变为丝氨酸(IFN-βser17),DNA序列分析证明了其核苷酸序列的正确性,并在大肠杆菌TAP106中获得高效表达,IFN-βser17表达量达20%,用Westemblot得到单一条带,细胞病变抑制法测定其比活性达(2～3)×107U/mg.INF-βser17的比活性和稳定性均超过天然人IFN-β.     

干扰素-β1b的高效表达、纯化及抗病毒活性研究

IFN-β1b是大肠杆菌产生的17位Cys被Ser替换的人IFN-β的类似物,为了获得高表达,使用了大肠杆菌的偏爱密码子,人工合成了IFN-β-1b基因,插入质粒pBV220中,转化大肠杆菌DH5α.IFN-β1b的制备过程,包括发酵和一系列的纯化步骤.经修饰,IFN-β1b基因在启动子PRPL控制下发酵表达,合成的蛋白质以包涵体的形式存在.培养的细菌经收集、裂解后,将包涵体释放出来,包涵体经含SDS的溶液溶解,DTT还原.纯化过程包括有机溶剂抽提、分子筛层析、脱盐、氧化复性和反相层析,并用旋转蒸发除去有机溶剂.IFN-β-1b在不同种系来源的细胞上显示不同的抗病毒活性.     

双抗体夹心ELISA定量检测IFNβ-HSA融合蛋白方法的建立

为了建立β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HSA)的酶联免疫定量分析方法,以抗IFNβ单克隆抗体为包被抗体,IFNβ-HSA融合蛋白为夹心抗原,辣根过氧化酶(HRP)标记抗HSA单克隆抗体为检测抗体,建立了一种定量测定IFNβ-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法.并进行了检测限、精密度、准确度和稳定性等方法学考核.结果表明,包被抗体和检测抗体的最佳工作浓度均为2μg/ml,抗原浓度在51.88-3320 ng/ml范围内呈良好线性关系,相关系数R2>0.99.检测限为10ng/m1.经方法学考核,批内、批间变异系数分别为4.86%和8.08%,回收率为91.9%～110.4%,与IFN-B、IFN-α、HSA、IFNα2b-HSA基本无交叉反应.健全性分析表明发酵液稀释倍数对该方法无影响,8 d连续检测标准曲线表明稳定性良好.这种定量检测IFNβ-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法,灵敏度高,重复性好,为当前融合蛋白发酵优化、分离纯化研究提供了定量检测的方法,并为后期药代动力学、临床研究提供了思路和备选方法.     

人一β干扰素结构基因的定向点突变

用简单而高效的“缺口双链DNA”的定向点突变方法,将IFN-β结构基因编码17位cys的密码TGT改成编码ser的AGT。变异株用合成的诱变引物作为探针来筛选,由Hinf I酶切电泳图谱分析及DNA顺序的测定得到证实。变异率为11％。在大肠杆菌表达的lFN-βser17的抗病毒活力明显高于在相同宿主菌中表达的lFN-β的抗病毒活力。     

小鼠17β-hsd10的克隆、表达及双抗夹心ELISA方法的建立

原核表达小鼠17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-hsd10),制备抗17β-hsd10多克隆抗体,建立17β-hsd10双抗夹心酶联免疫检测方法 (Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。采用RT-PCR技术克隆得到小鼠肝脏17β-hsd 10基因,构建原核表达体系p ET15b-17β-hsd10/Escherichia coli BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,并优化表达条件;目的蛋白用His融合蛋白纯化柱(His-Binding-resin)纯化并免疫BALB/c小鼠和新西兰大耳白兔,免疫血清总Ig G采用硫酸铵沉淀法纯化,用获得的高效价鼠源和兔源两种多克隆抗体,建立17β-hsd10双抗夹心酶联免疫检测方法。表达蛋白约为29.5 k Da,纯化后浓度为1.5 mg/m L,鼠源和兔源多克隆抗体效价分别为1.25×104和2.5×104,建立的检测方法对于多种羟基类固醇脱氢酶无交叉反应,特异性良好,可检出含量约为0.05-0.1μg/m L的阳性血清。建立的17β-hsd10双抗夹心ELISA方法,简便、快速、敏感,适合实验室研究科研广泛应用。并可能为检测阿尔茨海默病提供新思路和方法。     

50L规模中试发酵重组核苷二磷酸激酶A工程菌

中试规模发酵重组人核苷二磷酸激酶A（rhNDPK-A）工程菌,并对表达产物进行纯化。摇瓶培养一级种子至合适密度,以10%比例接种二级种子培养基,在7L发酵罐中培养至OD600为9.6～10.5,然后转入80L发酵罐中进行补料分批培养,所得菌体裂解后,经离子交换层析和亲和层析两步纯化得重组蛋白制品。结果表明,50L培养液经过10h培养后,湿菌收量为1560 g/批,NDPK-A表达量为23.8%。另外,补料方式对发酵密度有明显影响。与单纯补加碳源相比,同时补加碳源和氮源可以显著提高菌体产量,但对目的蛋白表达量地提高不明显。在较优条件下,菌体产量为(2220.00±169.71) g/批,蛋白表达量为(22.00±0.42) %,纯化后重组蛋白得率为510mg/L。产物可溶、密度适中、工艺简便的中试发酵条件的建立为高得率、大规模制备重组rhNDPK-A奠定了基础。     

马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)产生的开菲尔多糖的分离及其结构特性

研究了Lactobacillus kefiranofaciens发酵产生的开菲尔多糖的初步纯化方法,并对开菲尔多糖的分子组成、分子量以及单糖之间的连接方式进行了研究.研究结果表明,采用酶解与Sevage试剂相结合的方法进行纯化,当蛋白去除率为93%时,多糖得率60%,样品中多糖的百分含量为96%.采用HPLC和红外光谱研究表明,培养基的组成会明显影响开菲尔多糖中葡萄糖与半乳糖的比例,由MRS培养基发酵产生的KEFⅠ的相对分子质量约为2.4×105Da,葡萄糖/半乳糖约为14;而由改良的MRS培养基发酵产生的KEFⅡ的相对分子质量约为1.5×105Da,葡萄糖/半乳糖约为110.Lactobacillus kefiranofaciens发酵的开菲尔多糖分子中均含有β糖苷键.     

人IFN-γ体外释放检测法的建立及其在结核病诊断中的应用

本研究旨在建立人IFN-γ体外释放检测法,用于人结核病的特异性诊断.克隆表达了人IFN-γ基因,利用纯化的重组IFN-γ免疫小鼠,获得两株高效价的单克隆抗体.用所获得的单克隆抗体及兔抗IFN-γ多克隆抗体建立了检测人IFN-γ的夹心ELISA,检测灵敏度达到31.25 pg/mL.采集111位结核病阳性病人与292位临床健康对照者肝素抗凝全血,利用结核菌特异性抗原ESAT-6/CFP-10融合蛋白体外刺激外周血淋巴细胞释放IFN-γ,用所建立的夹心ELISA及商品化试剂盒平行检测所有样本,结果表明两种方法的检测结果相符.结核患者的检测灵敏度为95.5%,健康对照的阳性检出率为16.7%,患者与健康对照的阳性检出率差异极显著(P<0.01),证实所建立的方法灵敏度与特异性均很高,具有良好的应用前景.     

不同型别的基因工程干扰素抗病毒活性的比较

对大肠杆菌生产的不同型别的基因工程干扰素rIFN-α1(α1)、rIFN-αA(αA)、rIFN-β17ser(β17ser)和rIFN-γ(γ),以及自然人白细胞干扰素nIFN-αco,在不同细胞上对不同病毒的抗病毒活性做了比较研究。证明:①α1抗病毒作用的细胞谱较广,尤其在牛肾MDBK细胞和猪肾PK细胞上有很高的活性,分别为在人细胞上的29倍和7倍。β17ser和γ在异种细胞上活性极低,在鼠、猪和牛肾细胞上的活性为人细胞上的1～2％以下。②5种干扰素对麻疹、CoxB1、Sindbis、腺病毒7型和Ⅰ、Ⅱ型单纯疱疹病毒的抗病毒活性无明显差异。但不同病毒对干扰素的敏感性有明显差别,以Sindbis病毒为最敏感,7型腺病毒最不敏感。③5种干扰素对流行性出血热病毒均有明显的抗病毒作用,尤以人α1型和β干扰素作用最强,α1对出血热病毒的抗病毒活性是对滤泡性口膜炎病毒(VSV)的1/2.85,人β干扰素是对VSV的1/4.1。上述结果为人基因工程干扰素的临床应用提供了实验依据。     

利用Pichia pastoris生产S-腺苷甲硫氨酸的发酵工艺

在摇瓶中考察了重组Pichia pastoris发酵的诱导剂量,L-甲硫氨酸,以及pH对腺苷甲硫氨酸产量的影响.放大到3.7 L发酵罐和30 L发酵罐后,研究了重组细胞的发酵过程变化,对S-腺苷甲硫氨酸初步纯化.摇瓶中优化后的发酵条件是:每天添加1%甲醇诱导,L-甲硫氨酸为50mmol/L,培养基pH 5.0.培养144 h后SAM产量达到2.32 g/L.3.7 L发酵罐中发酵251 h后细胞浓度为120 g/L,SAM总量为15.18 g.放大到30 L发酵罐中,发酵225.5 h后细胞浓度约为120 g/L,SAM总量为145.05 g.纯化后SAM的纯度为93.5%,回收率为84.5%.     

基于磁性纳米微球的γ干扰素酶联免疫检测方法建立

目的:建立及评价使用磁性纳米微球作为固相载体的人γ干扰素(Interferon-gamma,IFN-γ)双抗体夹心酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法。方法:以杂化细乳液合成法制备磁性纳米微球,将其作为免疫检测的固相载体。将磁性微球与IFN-γ抗体进行偶联,建立基于磁性微球的ELISA检测方法,检测人IFN-γ,绘制IFN-γ标准曲线并进行方法学评价。结果:获得包被有人IFN-γ抗体的免疫微球,抗体偶联率为54.5%。用它建立IFN-γ的双抗体夹心的ELISA检测方法,检测范围为0-1000 pg/m L,相关系数为0.9996,灵敏度23.2 pg/m L,功能灵敏度0 pg/m L,批内和批间变异系数(Coefficients of Variance,CVs)8%,检测总共需要2小时。结论:成功制备了IFN-γ免疫微球并建立了定量检测人IFN-γ的双抗体夹心磁珠酶联免疫方法。     

基于pH调控的环β-1,2-葡聚糖合成及结构鉴定

目的:研究pH调控对发酵法生产环β-1,2-葡聚糖的影响,并对pH调控条件下所产环葡聚糖的结构进行解析。方法:以根瘤菌ATCC 1333为研究对象,进行pH调控与不调控的发酵过程分析,并结合乙醇分级沉淀对pH调控后的发酵液中多糖进行分离提纯,经Superose 12层析纯化,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-MS)、单糖组成分析、电喷雾串联质谱(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS),傅里叶红外光谱(fourier transform infrared spectoscopy,FTIR),核磁共振nuclear magnetic resonance,NMR)手段对葡聚糖进行结构鉴定。结果:提出两阶段pH调控发酵策略,生长期pH控制为7.0,产糖期pH控制为5.5,与自然发酵模式相比,环葡聚糖产量增加了52%,细胞浓度增加了102%,并且发酵颜色不再发生褐化现象,更有利于后续环葡聚糖的分离纯化。并确定pH调控对根瘤菌ATCC 1333发酵生产的葡聚糖的结构并无影响,合成的环葡聚糖是以葡萄糖为单体,通过β-1,2糖苷键连接的环葡聚糖,聚合度从17~22,以19为主的环状葡聚糖,无支链结构。结论:pH调控对于发酵生产环β-1,2-葡聚糖的结构无影响,为环β-1,2-葡聚糖的发酵工艺研究提供理论基础,也为研究β-1,2-葡聚糖提供可靠的糖源。     

4Aβ_(15)基因在毕赤氏酵母中的分泌表达及初步纯化

以pQE4Aβ15为模板,PCR扩增4Aβ15基因,并克隆到pMD18T载体中.以之进一步构建了酵母表达载体pPICZα4Aβ15.通过电转化,重组质粒pPICZα4Aβ15被整合到毕赤氏酵母GS115基因组中.甲醇诱导GS115/pPICZα4Aβ15表达,得到重组蛋白.SDS-PAGE显示重组蛋白的分子质量为18 kD,而4Aβ15的分子质量理论值为8 kD,经Western blot和质谱分析证实重组蛋白为4Aβ15.毕赤氏酵母GS115/pPICZα4Aβ15工程菌发酵上清经60%饱和硫酸铵沉淀初步纯化,获得纯度为80%的重组4Aβ15.     

马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)产生的开菲尔多糖的分离及其结构特性

研究了Lactobacillus kefiranofaciens发酵产生的开菲尔多糖的初步纯化方法,并对开菲尔多糖的分子组成、分子量以及单糖之间的连接方式进行了研究。研究结果表明,采用酶解与Sevage试剂相结合的方法进行纯化,当蛋白去除率为93%时,多糖得率60%,样品中多糖的百分含量为96%。采用HPLC和红外光谱研究表明,培养基的组成会明显影响开菲尔多糖中葡萄糖与半乳糖的比例,由MRS培养基发酵产生的KEFⅠ的相对分子质量约为2.4×105Da,葡萄糖/半乳糖约为1:4;而由改良的MRS培养基发酵产生的KEFⅡ的相对分子质量约为1.5×105Da,葡萄糖/半乳糖约为1:10。Lactobacillus kefiranofaciens发酵的开菲尔多糖分子中均含有β糖苷键。     

5型肺炎球菌荚膜多糖无乙醇无苯酚纯化工艺的建立

目的建立一种无乙醇无苯酚的5型肺炎球菌荚膜多糖纯化工艺,并进行工艺验证。方法 5型肺炎球菌发酵培养液采用脱氧胆酸钠法去除蛋白质,再利用层析法去除核酸等杂质,并对去除蛋白质工艺、层析工艺分别进行优化。采用优化后的方法纯化3批5型肺炎球菌发酵培养液,并对新工艺进行验证。结果去除蛋白质工艺的最适参数为:脱氧胆酸钠体积分数为0.5%,pH 4.3;层析工艺的最佳条件为:氯化钠浓度200 mmol/L,pH 8.0,上样流速150 cm/h,多糖质量浓度0.50 mg/mL。在上述工艺条件下,纯化的荚膜多糖各项指标均符合《欧洲药典》9.0版标准。结论该工艺稳定、可靠,可用于大规模生产,相比于传统的乙醇苯酚纯化工艺具有先进性。     

人γ干扰素的结构特征

<正> γ干扰素(IFN-γ)是人体三种主要的干扰素之一,现已表明其具有抗增殖、免疫调节和抗病毒等广泛的生物学活性。在理化性质方面,IFN-γ不同于α干扰素(1FN-α)和β干扰素(1FN-β)。由互补DNA(cDNA)推断1FN-γ,为146个氨基酸的多肽链。天然IFN-γ的纯化与结构分析表明有两种主要的活性分子,其分子量分别为25KDa和20KDa,两者的氨基酸序列完全相同,均     

人癌细胞系上自然和重组干扰素(α和β)抗肿瘤效应的比较

三名人癌细胞系上(Daudi淋巴瘤,PLC/PRF/’肝瘤和G361黑色素瘤),研究人Ⅰ型干扰素[IFN-a(le),rIFN-αA,γTFN-αD,IFN-β和γIFN-β]5个不同亚型的抗肿瘤效应。IFN-α(le)对Daudi细胞有极大的效力。IFNs的效应是细胞抑制剂。另外,IFN-α(le),IFN-β 500IU/ml和rIFN-β5000IU/ml对PL-C/PRF/5细胞证明有杀细胞效应。G361细胞对试验的IFNs是最不敏感的。这是从昆虫细胞分离的rIFN-β抗肿瘤效应最早的报道。rIFN-β的这个效应和IFN-β的效应相似。     

水牛瘤胃宏基因组的一个新的β-葡萄糖苷酶基因umcel3G 的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶.本工作分 6 次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库,获得 1.26×105个克隆,文库含外源 DNA 的总长度约为 4.8×106kb.从文库中筛选到118个表达β-葡萄糖苷酶活性的独立克隆.发现其中 8 个克隆表达的β-葡萄糖苷酶在pH5.0、37℃条件下活性较强.对其中一个克隆进行了亚克隆,序列分析发现一个 2223 bp 的潜在的编码β-葡萄糖苷酶基因(umcel3G)的开放阅读框(ORF),其编码产物的氨基酸序列与来自于 Bacillus sp.的一个β-葡萄糖苷酶同源性最高,具有 60%的一致性和73%的相似性.该ORF在 E.coli中的表达产物Umcel3G的分子量与预测大小相似,酶谱分析表明该表达产物具有β-葡萄糖苷酶活性,证实该基因为一个β-葡萄糖苷酶基因.测定了用Ni-NTA纯化的Umcel3G 的酶学特性,其最适 pH 和最适温度分别为 6.0～6.5 和 45℃.一些金属离子如 Ca2+、Zn2+能显著提高该酶的酶活,而另外一些金属离子如 Fe3+、Cu2+能抑制 Umcel3G 的活性.在 pH4.5、35℃和 5 mmol/L 的 Ca2+存在的条件下,用 Ni-NTA 纯化的重组酶的比活为 22.8 IU/mg,说明该酶在用SSCF工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值.