共查询到19条相似文献,搜索用时 83 毫秒
1.
人白介素6受体基因在痘苗病毒载体系统中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
人IL-6受体是一个在各种细胞上表达的跨膜糖蛋白分子,是IL-6发挥细胞效应所必需的。本文通过将IL-64 cDNA重组到痘苗病毒的TK基因中构建成重组痘苗病毒VIL64。细胞原位杂交和APAAP染色结果表明,感染VIL6R后的Vero细胞中,IL-6R在mRNA和蛋白水平上于现较强后 相似文献
2.
3.
4.
目的构建人IL-6受体(IL-6R)胞外区真核表达载体,检测其在体外培养细胞中的表达。方法利用PCR扩增IL-6R胞外区,克隆到pcDNA3.1(+)中,用双酶切、测序鉴定。重组质粒通过脂质体转染HL-60细胞,用G418进行筛选,利用Western印迹检测IL-6R蛋白表达。结果PCR扩增出1218bp的目的片段,双酶切和测序结果显示重组质粒正确。Western印迹结果显示转染细胞能够表达目的蛋白。结论成功构建了人IL-6R胞外区真核表达载体,并且能够在真核细胞中表达。 相似文献
5.
6.
通过DNA体外重组技术,以pET-3b为表达载体,构建了重组表达质粒pET-6R(B)和PET-6R(B)4,分别编码28kD的hIL-6R配基结合区片段及其53kD的二联体蛋白,并为酶切分析和DNA序列分析所证实。SDS-PAGE分析表明,含有重组表达质粒的菌株可分别表达出28kD的蛋白rIL6R-28和53kD的rIL6R-53。重组蛋白分别占菌体总蛋白的45%和29%左右。重组蛋白主要以包涵体形式存在,Western印迹表明重组蛋白具有IL-6R的抗原性。 相似文献
7.
以分子对接(docking)方法研究人白介素6受体胞外区配基结合功能域“WSXWS”区氨基酸残基定点突变对受体与配基人白介素6结合时的相互作用能量、分子间相互作用的影响,从分子力学、分子动态学分析了人白介素6受体胞外区功能域关键氨基酸残基在受体与配基结合中的构象变化以及与人白介素6间的相互作用. 相似文献
8.
痘苗病毒载体在病毒疫苗研制中的应用孙劲(中国预防医学科学院病毒研究所,北京100052)随着分子生物学技术的发展及日臻完善,病毒疫苗的制备出现了一些新的动向,继亚单位疫苗、多肽疫苗和抗独特型抗体疫苗之后,又出现了重组病毒活疫苗,即应用基因工程技术,以... 相似文献
9.
人白介素6受体胞外区三维结构的同源模拟 总被引:1,自引:0,他引:1
IL-6受体是造血因子超家族成员,其胞外区细胞因子结合结构域(CBD)是受体结合配基和偶联gp130转导IL-6信号的功能域.据预测,IL-6R功能域的β片层折叠模式和人生长激素受体(hGH-R)及CD4的晶体结构十分相似.应用计算机同源模拟技术,以hGH-R和CD4的三维结构为模板,模建了hIL-6R功能域(106~322位)的三维结构,初步描述了其结构保守区的构象特征.文章研究模建的hIL-6R三维结构模式为探讨可溶性IL-6R点突变的结果,以及进行三维定量分析IL-6R胞外区功能域的构效关系提供了空间结构基础. 相似文献
10.
11.
构建了含有pGHcDNA的重组痘苗病毒,用ELISA证明该重组病毒在被感染的h143细胞中,可表达出猪生长激素并将之分泌到培养基中,表达量约为1.05μg/10 ̄6细胞(24h)。用定位免疫化学法进一步证明该病毒可感染小鼠并在小鼠体内表达pGHcDNA。同时还构建了含双拷贝pGHcDNA的重组痘苗病毒,并证明其pGH表达量比单拷贝重组病毒有明显提高,约为1.50μg/10 ̄6细胞(24h)。 相似文献
12.
人IL-6基因的克隆及其在原核生物中表达及条件的优化 总被引:1,自引:0,他引:1
构建人白细胞介素6(IL-6)的原核表达载体并优化其表达条件,为IL-6的高效表达提供试验依据。以人T细胞cDNA为模板通过PCR方法扩增IL-6基因,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,酶切及测序鉴定重组体。将构建好的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用Western blotting及人IL-6检测试剂盒分析鉴定。在保持菌种不改变的前提下,分别改变IPTG的浓度、培养时间、卡那霉素浓度、培养温度等来优化IL-6表达条件。结果显示,原核表达载体pET28 a(+)-IL-6成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相对分子质量约22 kD的IL-6蛋白,经Western blotting鉴定正确,经人IL-6试剂盒检测显示具有较高的免疫活性。在IPTG浓度400μmol/mL,卡那霉素浓度50μg/mL,40℃培养6 h的条件下,目的蛋白表达量最高,可占总蛋白表达量的40%。成功构建人IL-6原核表达载体且获高效表达,为研究IL-6生物学活性及产品开发提供了试验基础。 相似文献
13.
Gribar JJ Ramachandra M Hrycyna CA Dey S Ambudkar SV 《The Journal of membrane biology》2000,173(3):203-214
P-glycoprotein (P-gp), the product of human MDR1 gene, which functions as an ATP-dependent drug efflux pump, is N-linked glycosylated at asparagine residues 91, 94, and
99 located within the first extracellular loop. We report here the biochemical characterization of glycosylation-deficient
(Gly−) P-gp using a vaccinia virus based transient expression system. The staining of HeLa cells expressing Gly− P-gp (91, 94, and 99N→Q), with P-gp specific monoclonal antibodies, MRK-16, UIC2 and 4E3 revealed a 40 to 50% lower cell-surface
expression of mutant P-gp compared to the wild-type protein. The transport function of Gly− P-gp, assessed using a variety of fluorescent compounds indicated that the substrate specificity of the pump was not affected
by the lack of glycosylation. Additional mutants, Gly− D (91, 94, 99N→D) and Gly−Δ (91, 94, 99 N deleted) were generated to verify that the reduced cell surface expression, as well as total expression, were
not a result of the glutamine substitutions. Gly− D and Gly−Δ Pgps were also expressed to the same level as the Gly− mutant protein. 35S-Methionine/cysteine pulse-chase studies revealed a reduced incorporation of 35S-methionine/cysteine in full length Gly− P-gp compared to wild-type protein, but the half-life (∼3 hr) of mutant P-gp was essentially unaltered. Since treatment with
proteasome inhibitors (MG-132, lactacystin) increased only the intracellular level of nascent, mutant P-gp, the decreased
incorporation of 35S-methionine/cysteine in Gly− P-gp appears to be due to degradation of improperly folded mutant protein by the proteasome and endoplasmic reticulum-associated
proteases. These results demonstrate that the unglycosylated protein, although expressed at lower levels at the cell surface,
is functional and suitable for structural studies.
Received: 28 July 1999/Revised: 20 October 1999 相似文献
14.
以分离提取的HeLa细胞总RNA为模板,通过RT-PCR反应扩增得到了1017bp的人可溶性白细胞介素6受体(sIL-6R)cDNA片段,将扩增片段克隆到pUC19质粒中进行序列测定。结果证明该片的序列与文献报道的sIL-6RcDNA的序列完全一致,将sIL-6RcDNA与链霉素信号肽melCl的编码序列融合后得到的融合基因mel/sIL-6R克隆到链霉菌质粒pLJ459中,构建成重组表达质粒pL 相似文献
15.
16.
密码子偏性对痘苗病毒载体表达效率影响的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
为了研究密码子偏性对痘苗病毒载体表达效率的影响,分别采用痘苗病毒及其宿主细胞的优势密码子对绿色荧光蛋白基因进行改造,利用荧光、Western blot和FCM等方法分析其在痘苗病毒载体系统的表达水平。结果显示,全部采用痘苗病毒优势密码子(富含A T)和全部采用宿主细胞优势密码子(富含G C),以及部分使用宿主细胞优势密码子的三种绿色荧光蛋白基因都能够有效表达,表达水平相近,表明痘苗病毒载体对目的基因密码子的使用具有很好宽容性。为了探讨这种宽容性的机理,分别利用在胞核内和在胞浆内转录的质粒载体对不同密码子偏性的绿色荧光蛋白基因进行表达分析。结果显示,胞核内转录目的基因的pcDNA3质粒载体能有效表达富含G C的绿色荧光蛋白基因,不能有效表达富含A T的绿色荧光蛋白基因,而胞浆内转录目的基因的pSCA质粒载体能同样有效表达上述不同密码子偏性的目的基因。这些结果表明,位于胞浆内的富含A U的转录产物能够有效表达,细胞核内生成的富含A U的转录产物可能受核膜屏障或其它核内因素影响而不能有效表达。因此,胞浆内繁殖的特性是痘苗病毒载体具有密码子宽容性的主要原因。此研究为痘苗病毒载体和常用真核表达载体的选择使用提供了重要实验依据。 相似文献
17.
Gag和Env蛋白是人Ⅰ型免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV1)的结构蛋白,是HIV1诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的主要抗原。本实验通过多次亚克隆,将env基因以正确的三联密码读框插入gag基因的下游,制备了HIV1gagenv嵌合基因,并将嵌合基因分别置于痘苗病毒p75启动子和牛痘病毒A型包涵体(ATI)启动子的下游,经过同源重组和红细胞吸附试验筛选,获得了2株重组痘苗病毒。免疫荧光试验和酶免疫试验证明,两株重组痘苗病毒均能正确地表达HIV1gagenv嵌合基因。动物实验表明,gagenv嵌合基因重组痘苗病毒可诱导小鼠产生抗HIV特异性抗体。这些结果为艾滋病颗粒化疫苗的研制提供了借鉴。 相似文献
18.
在对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的基因组中发现一个具有细胞因子受体特征的开放阅读框,该阅读框全长2022个核苷酸,编码674个氨基酸,蛋白质理论分子量为76kDa。该基因含有真核生物细胞因子gp130受体特征序列。为了研究该基因的功能,采用PCR方法从病毒基因组中扩增出基因片段,克隆到pGEM-T Easy载体中,经BamH I和Sal I双酶切后插入pET28b表达载体中。重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳表明在。76kDa处有目的蛋白表达。用冰浴超声波对诱导后的菌液进行处理以获得初步纯化的蛋白,作为抗原人工免疫实验兔子以获得含特异性抗体的抗血清。该基因的表达成功,为其功能的进一步深入研究奠定了基础。 相似文献
19.
将系列缺失的HIV1长末端重复序列(LTR)和全长的gagORF置于痘苗病毒载体中,经同源重组和血球吸附试验,成功地构建了6株重组痘苗病毒。免疫印迹和免疫酶试验检测均表明,6株重组病毒的Gag蛋白表达量因LTR不同而有明显差异,表明HIV1的LTR及其下游基因置于痘病毒启动子控制下,在痘苗病毒中表达时有下述特点:(1)不同的痘苗病毒启动子与全长LTR相互作用,对gag基因表达有显著不同的调控效果;(2)NR序列对Gag蛋白表达没有明显影响;(3)EN序列不能被重组痘苗病毒表达系统识别;(4)TAR序列可提高Gag蛋白的表达量;(5)U5区及下游非翻译序列不影响Gag蛋白的表达。 相似文献