多聚核苷酸的合成与研究 Ⅰ.十脱氧核糖核苷酸的化学合成

用片段缩合的方法,化学合成了十脱氧核糖核苷酸d-_(MMTr)G_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)G_p~(Bz)T_p~(Bz)C_p~(An)C_p~(An)G~(Bz*)。各中间片段及最终产物在脱除全部保护基后,均能定量地为桔青霉磷酸二酯酶酶解,并得到预期的碱基比例。将三苯甲基一纤维素柱运用于带MMTr基片段反应混合液的分离,能使情况简化,为进一步在DEAE-纤维素柱上分离纯化创造有利条件。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅲ.十三脱氧核糖核苷酸的化学合成

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,d-_(MMTr)G_p~(Bz)A_p~(Bz)C_p~(An)G_p~(Bz)A_p~(Bz)G_p~(Bz)先后同d-_pT_pC_p~(An)C_(OAc)~(An)和d-pG_p~(Bz)G_p~(Bz)A_p~(Bz)A_(OAc)~(Bz)。反应,脱去保护基后,在7M尿素柱上分离纯化,最后得到产物脱氧核糖十三核苷酸(d-G_pA_pC_pG_pA_pG_pT_pC_pC_pG_pG_pA_pA)。因上述两步缩合反应所得到的中间产物带有大量芳香族保护基,增强了寡聚核苷酸对离子交换树脂的吸附,给分离纯化工作造成一定困难。我们发现这些带有保护基的寡聚核苷酸在DEAE-葡聚糖A-25(Cl~-型)柱上,用含有3M尿素和40%乙醇的氯化锂溶液洗脱,可以克服这一困难。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅱ.六脱氧核糖核苷酸的化学合成与抽提分离

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,合成了二个六脱氧核糖核苷酸(d-_(MMT_r)G~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pG~(Bz)和d-(MMT_r)T_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)),脱去保护基后经双向同系层析测定核苷酸排列顺序,完全符合实验设计要求(d-GpApCpGpApG和d.TpCpGpApApC)。上述二个带保护基的六脱氧核糖核苷酸合成的每一步,都是采用溶剂抽提方法分离的,大大简化了分离的步骤和缩短了分离的时间,便于脱氧寡核苷酸的大量制备。此法也适用于其他带保护基寡核苷酸的制备,不论其三苯甲基衍生物基团在5’端或3’端(例如如d-_pG~(Bz)_pA~(Bz)_(-ODMT_r))。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅰ.十脱氧核糖核苷酸的化学合成

用片段缩合的方法,化学合成了十脱氧核糖核苷酸 d-_(MMT_r)G~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pG~(Bz)_pT_pC~(An)_pC~(An)_pG~(Bz)。各中间片段及最终产物在脱除全部保护基后,均能定量地为桔青霉磷酸二酯酶酶解,并得到预期的碱基比例。将三苯甲基-纤维素柱运用于带MMTr基片段反应混合液的分离,能使情况简化,为进一步在DEAE-纤维素柱上分离纯化创造有利条件。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅲ.十三脱氧核糖核苷酸的化学合成

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,d-_(MMT_r)G~(Bz)_pA~(Bz)_pC~(An)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pG~(Bz)先后同d-_pT_pC~(An)_pC~(An)_(-CA(?))和d-_pG~(Bz)_pG~(Bz)_pA~(Bz)_pA~(Bz)_(OAc)反应,脱去保护基后,在7M尿素柱上分离纯化,最后得到产物脱氧核糖十三核苷酸(d-GpApCpGpApGpTpCpCpG_pGpApA)。因上述两步缩合反应所得到的中间产物带有大量芳香族保护基,增强了寡聚核苷酸对离子交换树脂的吸附,给分离纯化工作造成一定困难。我们发现这些带有保护基的寡聚核苷酸在DEAE-葡聚糖A-25(Cl~-型)柱上,用含有3M尿素和40%乙醇的氯化锂溶液洗脱,可以克服这一困难。     

限制性核酸内切酶BamH1的识别顺序 dG_pG_pA_pT_pC_pC 的化学合成

本文报道用硅胶柱层析分离二酯法合成产物的新方法及限制性核酸内切酶BamH 1接头dG_pG_pA_pT_pC_pC 的化学合成。其合成路线是:(1)以溶剂抽提法制备MMTrG_p~(Bz)G_p~(Bz)A~(Bz)-OH,其3'-OH 以磷酸氰乙酯和MSCl 反应磷酸化得到MMTrG_p~(Bz)G_p~(Bz)A_p~(Bz)(Ⅰ);(2)用硅胶分离法制备MMTrT_pC_p~(An)C~(An)-OAC,脱去5'-MMTr 保护基后得HO-T_pC_p~(An)-OAC(Ⅱ);(3)Ⅰ与Ⅱ缩合,脱去保护基后制得dG_pG_pA_pT_pC_pC(图2)。硅胶层析法与抽提法比较,前者有较高的分离效力和速度,并且产品中所含色素较少。硅胶层析法和3'-OH 磷酸化方法的应用,加快了DNA 短片段的合成。     

限制性核酸内切酶BamH1真的识别顺序dG_pG_pA_pT_pC_pC的化学合成

本文报道用硅胶柱层析分离二酯法合成产物的新方法及限制性核酸内切酶BamH1接头dG_pG_pA_pT_pC_pC的化学合成。其合成路线是:(1)以溶剂抽提法制备MMTrG_p~(Bz)G_p~(Bz)A~(Bz)-OH,其3'-OH以磷酸氰乙酯和MSCl反应磷酸化得到MMTrG_p~(Bz)G_p~(Bz)A_p~(Bz)(Ⅰ);(2)用硅胶分离法制备MMTrT_pC_p~(An)C~(An)-OAC,脱去5'-MMTr保护基后得HO-T_pC_p~(An)C~(An)-OAC(Ⅱ);(3)Ⅰ与Ⅱ缩合,脱去保护基后制得dG_pG_pA_pT_pC_pC(图2)。硅胶层析法与抽提法比较,前者有较高的分离效力和速度,并且产品中所含色素较少。硅胶层析法和3'-OH磷酸化方法的应用,加快了DNA短片段的合成。     

多核苷酸的合成与研究——Ⅴ.一种由3′端向5′端延伸的脱氧寡核苷酸的化学合成与抽提分离的新方法

化学合成特定顺序的DNA片段,目前除广泛采用三酯方法外,对二酯方法的合成与分离也作了不少的研究。为了用抽提法制备5′端带磷的片段,有些实验室曾采用三苯甲基苯硫乙醇、三苯甲基对胺基苯酚及三苯基苯胺等来保护5′端磷酸基,但这些磷酸上的保护基脱落条件比较复杂,产物回收也不够理想,抽提分离的片段长度一般在二核苷二磷酸。本文则用DMT选择性地保护5′核苷酸的3′羟基,抽提制备了脱氧二核苷二磷酸dpG~(BZ)pA~(BZ)-ODMT和脱氧四核苷四磷酸dpC~(An)pG~(Bz)pG~(BZ)pA~(Bz)-ODMT片段。     

脑啡肽基因的合成 Ⅰ.d-GATCCTAGA的合成

本文报道了脑啡肽基因下链二十六核苷酸中九核苷酸d-GATCCTAGA的合成。合成系采用改良的三酯法,即先合成d-_(Dmt)G_?~(ib)A_?~(Bs)T_(?OH)、d-_(Dmt)C_?~(An)C_?~(An)T_(?OH)和d-_(Dmt)A_?~(Bs)G_?~(ib)A_(OBs)~(Bz)三个片段,然后由d-_(Dmt)A_?(Bs)G_?~(ib)A_(OBz)~(Bz)脱去5′-Dmt基后依次同d-_(Dmt)C_?~(An)C_?~(An)T_(?OH)和d-_(Dmt)G_?~(ib)A_?~(Bz)T_(?OH)向5′端延伸缩合得到产物d-_(Dmt)G_?~(ib)A_?~BsT_?C_?~(An)C_?~(An)T_?A_?~(Bs)G_?~(ib)A_((OBs)_o)~(Bs) d-_(Dmt)G_?~(ib)A_?~(Bs)T_(?OH)和d-_(Dmt)C_?~(An)C_?~(An)T_(?OH)是通过d-_(Dmt)G_?~(ib)A_(?OH)~(Bs)和d-_(Dmt)C_?~(An)C_(?OH)~(An)分别同过量的d-T缩合,然后再用对氯苯磷酰双三唑对产物的3′-OH进行磷酰化得到。d-_(Dmt)A_?~(Bs)G_?~(ib)A_(OBz)~(Bs)则是由d-_(Dmt)A_?~(Bz)G_(?OH)~(ib)同d-A_(OBs)~(Bs)反应得到。在所有的缩合反应中,都采用2,4,6-三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂,缩合产物都以硅胶短往层析分离纯化。除保护的九核苷酸未进行硅胶柱层析纯化之外,各中间片段经硅胶柱层析纯化后的收率都在75%以上。合成的全保护九核苷酸用浓氨水和80%醋酸相继脱去全部保护基后,以DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析(含7M尿素)分离纯化,经去盐后得到d-GATCCTAGA,收率31.7%。产物的5′-OH用~(32)P标记后,同系层析均一,蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后,作电泳-同系层析双向图谱,证明核苷酸排列顺序正确。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅳ.用改进的二酯法化学合成d-pCpCpCpA

用改进的二酯法化学合成了几个脱氧寡核苷酸片段(d-_pC_pC,d-_pC_pC_pC,d-_pC_pC_pC_pA)。改进的主要之点是:(1)全部脱去保护基后柱分离,以克服在柱分离时寡核苷酸的保护基引起的亲脂性;(2)对所需的寡核苷酸片段重上适当的保护基,以作下一步的合成之用,于是避免了原先二酯法的操作中保护基的不希望有的丢失。用改进二酯法获得的寡核苷酸,产率和纯度得到提高和改善。虽然此改进目前仅用来合成寡核苷酸短片段,但可能提供用3′-5′磷酸二酯键方式连接两天然DNA短片段的途径。     

多核苷酸合成的研究——Ⅱ.CpUpCp、GpUp和CpUpCpGPUp的合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端茎区顺序中CpUpCpGpUp五核苷五磷酸的合成。Hou(OBz)-p-NHC_6H_5同_(MMT)G~(Ac)(OAc)-p或_(MMT)G~(iHu)(OiBu)-p用DCC缩合再脱去5′-MMT后可分别得到_(HO)G~(Ac)(OAc)-p-U(OBz)-p-NHC_6H_5和_(HO)G~(iBu)(OiBu)-U(OBz)-p-NHC_6H_5。_(HO)U(OBz)p-NHC_6H_5同_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p用DCC缩合再脱去3′-末端磷酸的苯胺保护基得到_(Bz)C~(Bz)(OBz)-pU(OBz)-p,此保护二核苷酸再同_(HO)C~(Bz)(OBz)-p-NHC_6H_5用DCC缩合,然后再脱去3′-末端磷酸的苯胺保护基得到_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)-p-C~(Bz)(OBz)-p。此保护的三核苷酸同_(HO)G~(Ac)(OAc)-p-U(OBz)-p-NHC_6H_5用DCC缩合,然后脱去3′-末端磷酸的苯胺保护基和全部酰基保护基并经7世尿素柱层析纯化,最后得到自由的五核苷酸CpUpCp--GpUp0产物经纸电泳、薄板层析鉴定为均一,用牛胰核糖核酸酶水解后得到预期的核苷酸组成比例。     

多核苷酸合成的研究——改良三酯法化学合成脱氧十二核苷十一磷酸 d-CATGAATTCATG

本文报道一种简便的化学合成多聚脱氧核苷酸的三酯法以及自身互补的脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG 的化学合成,这种方法包括:(1)直接使用容易制备的O~5',N-保护的脱氧核苷-3'-对氯苯磷酸二酯的钡盐和过量的N-保护的脱氧核苷缩合,高效地合成保护的二聚体三酯中间物DmtN'(?)N'OH(N'表示d-T,d-BzA,d-_(an)C 或d-_(ib)G;(?)表示对氯苯磷酸二酯)。(2)二聚体三酯中间物3'端的羟基和过量的对氯苯磷酰双三唑反应,得到几乎定量产率的磷酸化中间物DmtN'(?)N'(?)OH。(3)采用均三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂。试剂十分稳定,具有容易制备和缩合能力强的优点。(4)硅胶短柱层析方法应用于各个三酯中间物的分离纯化,层析过程可在3小时内完成。通过脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG 的化学合成,证明这是一个快速合成多聚脱氧核苷酸的有效途径。首先,我们合成不同的二聚体三酯中间物,并依次缩合,得到八聚体d-_(HO)A~(Bz)(?)A~(Bz)(?)T(?)T(?)C~(An)A~(B(?))(?)T(?)G_(OBz)~(ib)和四聚体磷酸化中间物d-DmtC~(An)(?)A~(Bz)(?)T(?)G~(ib)(?)OH(产率70～94%)。然后,将上述四聚体和八聚体片段进一步缩合,并用浓氨水、80%醋酸脱除所有保护基,经葡聚糖凝胶G-75和DEAE-葡聚糖凝胶A-25二次柱层析纯化,得到脱氧十二核苷十一磷酸。顺序分析的结果证明合成的产物具有正确的结构。此外,产物能被限制性内切酶EcoRI 识别并水解得到预期的结果。     

多核苷酸合成的研究 改良三酯法化学合成脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG

本文报道一种简便的化学合成多聚脱氧核苷酸的三酯法以及自身互补的脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG的化学合成,这种方法包括:(1)直接使用容易制备的O~5',N-保护的脱氧核苷-3'-对氯苯磷酸二酯的钡盐和过量的N-保护的脱氧核苷缩合,高效地合成保护的二聚体三酯中间物DmtN'(?)N'OH(N'表示d-T,d-BzA,d-(an)C或d-_(tb)G;(?)表示对氯苯磷酸二酯)。(2)二聚体三酯中间物3'端的羟基和过量的对氯苯磷酰双三唑反应,得到几乎定量产率的磷酸化中间物DmtN'(?)N'(?)OH。(3)采用均三甲基苯磺酰硝基咪唑为缩合剂。试剂十分稳定,具有容易制备和缩合能力强的优点。(4)硅胶短柱层析方法应用于各个三酯中间物的分离纯化,层析过程可在3小时内完成。通过脱氧十二核苷十一磷酸d-CATGAATTCATG的化学合成,证明这是一个快速合成多聚脱氧核苷酸的有效途径。首先,我们合成不同的二聚体三酯中间物,并依次缩台,得到八聚体d-_(HO)A~(Bz)(?)A~(Bz_(?)T(?)T(?)C~(An)A~(Bz)(?)T(?)G_(OBz)~(ib)和四聚体磷酸化中间物d-DmtC~(An)A~(Bz)(?)T(?)G~(ib)(?)OH(产率70～94%)。然后,将上述四聚体和八聚体片段进一步缩合,并用浓氨水、80%醋酸脱除所有保护基,经葡聚糖凝胶G-75和DEAE-葡聚糖凝胶A-25二次柱层析纯化,得到脱氧十二核苷十一磷酸。顺序分析的结果证明合成的产物具有正确的结构。此外,产物能被限制性内切酶EcoRI识别并水解得到预期的结果。     

多聚核苷酸的合成与研究 Ⅳ.用改进的二酯法化学合成d-pCpCpCpA

用改进的二酯法化学合成了几个脱氧寡核苷酸片段(d-pCpC,d-pCpCpC,d-pCpCpCpA)。改进的主要之点是:(1)全部脱去保护基后柱分离,以克服在柱分离时寡核苷酸的保护基引起的亲脂性;(2)对所需的寡核苷酸片段重上适当的保护基,以作下一步的合成之用,于是避免了原先二酯法的操作中保护基的不希望有的丢失。用改进二酯法获得的寡核苷酸,产率和纯度得到提高和改善。虽然此改进目前仅用来合成寡核苷酸短片段,但可能提供用3’-5’磷酸二酯键方式连接两天然DNA短片段的途径。     

多核苷酸合成的研究 Ⅺ.酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-端半分子中含N,N-二甲基鸟苷的四核苷三磷酸(CpGpCpm_2~2G)的合成

(1)参照已报道方法,从鸟苷合成了N,N-二甲基鸟苷(m_2~2G)。(2)N、2′、5′-O-三苯甲酰胞苷酸[_(Bz)C~(Bz)(OBz)p],与2′、3′-O-二乙酰基-N,N-二甲基鸟苷[m_2~2G(OAc)_2]经DCC 缩合,脱去保护基后可分离出胞苷酰-(3′→5′)-N,N-二甲基鸟苷(Cpm_2~2G)。(3)_(Bz)C~(Bz)(OBz)p 与N-二甲基氨基甲叉鸟苷酸(G_p~(DMM)),用DCC 缩合,脱保护基后可得到胞苷酰-(3′→5′)-鸟苷-2′,3′-环状磷酸(CpG>p)。(4)用RNase N_1(E.C.2.7.7.26)催化CpG>p 与Cpm_2~2G 反应生成26%产率的CpGpCpm_2~2G。经纯化后产物不含酶,用RNasc N_1水解得到等克分子的CpGp CpG>p 和Cpm_2~2G,碱解可分离出Cp(2′ 3′),Gp(2′ 3′)及m_2~2G,克分子比为2.07:1.0:1.1。     

多聚核苷酸的合成与研究——Ⅵ.用于DNA无性繁殖研究的八脱氧核苷酸EcoRI接头的化学合成

用均三甲基苯磺酰氯(MS)作缩合剂,合成了带保护基的八脱氧核苷酸 dMMTr GpGpApApTpTpCpCp。B_2B_2B_2B2 AnAn脱去保护基后,经葡聚糖G-50凝胶过滤和7M尿素柱层析分离和纯化,得到双链的完全自身配对的八脱氧核苷酸 5′G—G—A—A—T—T—C—C—3′ 3′C—C—T—T—A—A—G—G—5′。经双向同系层析分析,核苷酸排列顺序符合实验设计要求。用Eco RI酶处理后,可以降解成小片段。     

寡聚脱氧核苷酸的结构与抗降解特性的研究

合成了４段具有不同高级结构或不同修饰的寡聚脱氧核苷酸,检查它们在２０％血清中的稳定性．发现：（１）寡核苷酸主要被血清中的３′外切核酸酶降解,未经修饰的线性寡核苷酸降解严重;（２）末端部分硫代修饰的寡核苷酸稳定性明显提高;（３）自身互补形成的配对结构可有效保护３′末端．具有４个以上（含４个）ＧＣ对的３′端发夹结构寡核苷酸,其抗核酸酶的能力几乎与硫代修饰的寡核苷酸相当．     

酵母丙氨酸转移核糖核酸分子中一个十三核苷酸片段(顺序23～35)CpGpCpm_2~2GpCpUpCpCpCpUpUpIpGp的合成

以CpGpCpm_2~2G、CpUpCpC、CpUpUpI和Gp为原料,采用T_4RNA ligase催化连接的方法,通过用3′-端带有起保护怍用的磷酸单酯的寡核苷酸作供体(途径A)以及除最后一步外各步都用3′-端是自由OH基的寡核苷酸作供体(途径B)的两种途径,都合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸分子中一个十三核苷酸片段(顺序23～35)CpGpCpm_2~2GpCpUpCpCpCpUpUpIpGp。产率较高。产物的连接点、末端和序列都经过严格鉴定。研究表明,位于受体分子3′-端的稀有嘌呤核苷m_2~2G对T_4RNA ligase催化的连接反应没有不利影响,并再次证实,在用3′-端是自由OH基的寡核苷酸作供体进行T_4RNA ligase催化的连接反应时,为了得到高的产率,避免或降低同时产生供体分子的自聚和环化,并不一定需要受体分子大大过量。用本法合成的CpGpCpm_2~2GpCpUpCpCpCpUpUpIpGp已用于酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-端半分子和全分子的合成中。     

多核苷酸合成的研究——Ⅵ.酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子反密码区中CpUpCpC和CpUpUpI的合成

本文报道用化学方法合成了酵母丙氯酸转移核糖核酸5′-半分子中反密码区的CUCC和cuuI两个四核苷酸片段。CUUI的合成路线是由(HO)I~(Bz)(OBz)_2开始,先同_(MMT)U(OBz)-p缩合并脱去5′-MMT后得到_(HO)U(OBz)-p-I_(Bz)(OBz)_2,然后与_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)-p缩合或者与_(MMT)U(OBz)-p和_(Bz)C_(Bz)(OBz)-p依次缩合得到全保护的四核苷三磷酸,最后用NH_3-甲醇溶液脱去保护基并分离纯化得到CUUI。而用_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)-p同_(HO)C_(Bz)(OBz)-p-C_(Bz)(OBz)_2缩合然后脱去保护基并分离纯化则可得到CUCC。反应缩合剂均采用DCC。合成的CUCC和CUUI均能为牛胰核糖核酸酶完全水解得到预期的碱基组成比例。     

多核苷酸合成的研究 Ⅱ.CpUpCp、GpUp和CpUpCpGpUp的合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸3’-端茎区顺序中CpUpCpGpUp五核苷五磷酸的合成。_(HO)U(OBz)-p-NHC_6H_5同_(MMT)GA~(AC)(OAc)-p或_(MMT)G~(iBu)(OiBu)-p用DCC缩合再脱去5’-MMT后可分别得到_(HO)G~(Ac)(OAc)-p-U(OBz)-p-NHC_6H_5和_(HO)G~(iBu)(OiBu)-U(OBz)-p-NHC_6H_(50) _(HO)U(OBz)-p-NHC_6H_5同_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p用DCC缩合再脱去3’-末端磷酸的苯胺保护基得到_(Bz)C~(Bz)(OBz)-pU(OBz)-p,此保护二核苷酸再同_(Ho)C~(Bz)(OBz)-p-NHC_6H_5用DCC缩合,然后再脱去3’-末端磷酸的苯胺保护基得到_(Bz)C~(Bz)(OBz)-p-U(OBz)-p-C~(Bz)(OBz)-p。此保护的三核苷酸同_(Ho)G~(Ac)(OAC)-p-U(OBz)-p-NHC_6H_5用DCC缩合,然后脱去3’-末端磷酸的苯胺保护基和全部酰基保护基并经7M尿素柱层析纯化,最后得到自由的五核苷酸CpUpCpGpUp。产物经纸电泳、薄板层析鉴定为均一,用牛胰核糖核酸酶水解后得到预期的核苷酸组成比例。