一株封小白鼠皮下感染有高度致死力的流行性乙型脑炎病毒京卫研株与中山株感染力的比较

以流行性乙型脑炎病毒京卫研,株舆中山株在各种途径感染的致死力进行了比较试验,结果表明： (一)雨株病毒对不同鼠龄的小白鼠脑内接种感染致死力没有明顯差别,但在脑外途径(皮下和腹腔)接种感染的致死力则随鼠龄的增加而下降。 (二)京卫研,株病毒封小白鼠具有高度的皮下感染的致死力,而中山株则很低。     

利用蚀虫斑选种由乙型脑炎病毒(京卫研1株)中获得毒力不同的毒株

本实验利用蚀斑技术由对小白鼠皮下致死力较高的流行性乙型脑炎病毒京卫研,株分离出10株皮下致死力高低不等的毒株。经小白鼠脑内连续盲传10代,证明其皮下成染力是比较稳定的,所选出的毒株的其他生物学性质,如血凝性质,在不同温度下培养时的蚀斑形成能力等,也有所不同,但其抗原性则仍相似。作者根据本实黢的结果,孰为京卫研1株病毒实际上不是由单一性质的病毒颗粒所相成,而是由一些抗原性相似,但在某些生物性厦上不同的病毒颗粒所粗成的羣落。此外,本文对自然界存在有不同毒力的脑炎毒栋的可能原因进行了讨论。     

一种新的病毒空斑技术

本文报道了一种不同于Dulbecco细胞单层法和Cooper琼脂细胞悬浮法的病毒空斑技术——速成单层法病毒空斑试验。用24孔细胞培养板,不经预先制备细胞单层,将Vero细胞和水泡性口炎病毒Indiana株同时加入培养孔内,使细胞在贴壁的同时被病毒吸附,继后在营养凝胶下,细胞形成单层的同时病毒产生空斑。结果表明,此法简单快速,稳定可靠,经济节约,方便易行。用于单纯疱疹病毒分型的鸡胚细胞空斑形成试验,亦获得满意结果。     

SINDBIS病毒基因组的研究

Sindbis病毒经蔗糖密度梯度离心纯化后,用SDS/酚/氯仿/异戊醇处理和乙醇沉淀,制得的基因组RNA具有典型核酸紫外吸收光谱的特征:最大吸收在260nm,最小在235nm。沉降系数为45S。沉降扫描图表明,RNA样品均一,分子完整。 用高渗法在原代鸡胚纤维母细胞测定了基因组RNA的感染性,空斑滴度为5.9×10~4pFU(空斑形成单位)/ml,空斑形态和大小与完整病毒颗粒相同。经核糖核酸酶处理,基因组RNA即丧失感染性,说明了这种生物活性的特异性。     

H5N1亚型禽流感病毒HA糖基化位点缺失突变株的构建及生物学特性

不同H5亚型禽流感(AIV)HA上糖基化位点的分布是不同的,然而不同糖基化位点对病毒的作用仍不十分清楚。本研究利用定点突变和反向遗传操作构建了3个不同糖基化位点单缺失突变病毒,并对其增殖特性和毒力进行了测定。结果表明,通过HA基因序列测定和免疫印迹分析证实已成功去除了特定糖基化位点。158位糖基化位点缺失突变株rS△158在鸡胚中的EID50和MDCK细胞上TCID50比野生型rS略低,空斑直径显著减小;而单独去除169位和290位糖基化位点的rS△169和rS△290的EID50和TCID50略高于野生型rS,空斑直径相近,但空斑数要比后者高出10倍以上。所有突变株及野生型病毒在CEF上增殖速率相同,对SPF鸡均是高致病性的。因此,糖基化位点可影响病毒的体外增殖,但结果因细胞而异。     

检测流行性出血热病毒滴度和中和抗体效价的半微量空斑法

建立了检测流行性出血热病毒滴度和中和抗体效价的半微量空斑法。小牛血清与胎牛血清的培养效果无差异。7株不同来源的出血热病毒均能在E6细胞上形成空斑。接种的病毒浓度与形成的空斑数呈直线关系。用空斑法测得的病毒滴度稍低于荧光TCIE50滴定法。空斑减少中和试验的敏感性较荧光中和试验高30倍左右。同时还初步表明了本方法可用于流行性出血热病毒的抗原性分析。     

海南岛两个虫媒病毒分离物的初步鉴定

本文报告,1985年夏从海南岛采集的6种蚊子中,分离到4株乙型脑炎病毒和38株非乙脑病毒,其中两株(HN8和HN99)为甲组虫媒病毒。二者抗原性非常相近,对乳小白鼠脑内、腹腔和皮下接种部有较强的致病力,能在多种组织培养细胞上增殖并产生病变,能在鸡胚纤维母细胞上形成空斑,能凝集多种动物红细胞,血凝pH范围为5.75～6.4,最适pH为5.75或6.0,血凝素在4～37℃均较稳定,血凝素对福尔马林敏感。病毒呈球形,有包膜,直径60～65nm,属RNA病毒,对热、酸、乙醚和紫外线均敏感。血清学鉴定表明这两株病毒只与甲组虫媒病毒抗体有反应,尤其与MAY病毒抗原性关系较密切。同年从当地人、畜血清中检查了HN99病毒抗体,其阳性率为:健康人14％,猪23％,山羊35％。另外还与北京的M4株病毒作了初步比较,并对新毒株及我国其它有关毒株的分类学地位提出了初步看法。     

鸡马立克氏病毒Ⅱ型无毒株Z_4的分离和鉴定

从扬州市郊区土种鸡中分离到一株血清Ⅱ型马立克氏病毒(MDV)Z4株,并进行了鉴定。初次分离时,Z4在鸡胚成纤维细胞(CEF)上生长缓慢,12天后产生以圆形大合胞体为特征的空斑形态。用Z4CEF培养物接种易感鸡,13周内不引起任何马立克氏病临床症状,也无大体的病理变化,显微镜检查仅部分鸡的坐骨神经出现炎性细胞浸润。保护性实验证明,接种Z4株的鸡可抵抗MDV强毒的致瘤作用,表明它是很有希望的疫苗候选毒株。 用型特异性单克隆抗体,对MDV强毒株京-1株、弱毒株K株,以及作者新分离的另外9个分离物进行了血清型鉴定。证实京-1株、K株和5个分离物为Ⅰ型病毒;2个为Ⅱ型病毒;另有2个分离物同时含有Ⅰ型和Ⅲ型病毒。本工作为进一步研究不同血清型MDV在我国鸡群中的流行和分布规律打下了基础。     

鸡源和鹅源新城疫病毒在宿主细胞上的蚀斑形成特性及形态发生学比较

通过蚀斑形成试验比较鸡源(F48E9株)和鹅源(NA-1株)新城疫病毒在不同细胞的蚀斑形成能力,结果显示F48E9、NA-1两种病毒在Vero细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)和鹅胚成纤维细胞(GEF)上蚀斑形成能力存在明显的差异,在GEF上NA-1株的蚀斑形成能力强于F48E9株,而在CEF上弱于F48E9株,在Vero细胞上NA-1株的蚀斑形成能力稍强于F48E9株,表明病毒蚀斑形成特性与宿主种属特性一致。通过电镜观察两株病毒以相同感染量感染Vero细胞后的病毒形态发生过程。NA-1株和F48E9株病毒在Vero细胞中不同时段的形态发生的进程上存在区别,无论从出芽时间还是出芽后病毒囊膜的完整性上,NA-1株均优于F48E9株,提示NA-1株病毒对宿主环境的适应力较强。     

满山香水煎液对流行性感冒病毒的抑制效果观察

一、满山香水煎液75％浓度,在鸡胚内对流感病毒亚．洲甲型赣防71-5株、京科68一1株(60EID50感染量)均有较明显的抑制作用。 二、“毒一药”或“药一毒”,虽感染和注药先后不同(相隔60分钟),其抑制效果无显著差异。 三、鸡胚尿襄腔感染病毒,60分钟后,经卵黄襄注药,对流感病毒赣防71-5株,京科68-1株也均有抑制作用。 四、阴性尿液经鸡胚尿囊腔盲传两代后,除个别血凝转阳外,大部分仍为阴性,药液在鸡胚内的抑毒作用比较显著。     

甲型流感病毒各代表株在鸡胚腎组培养上的表现

一、甲型流戚病毒各代表栋均能良好地在鸡胚肾组织培养氅殖：PR8、FMl、洛57—4、兰生60—2等株EID∞一般可达到5．0—6．0个对数,但沪防60一l梢低;多数毒株均能产生明显的细胞病变;病毒在戚染鸡胚肾组织培养后32—48小时为繁殖高壅。 二、甲型流戚病毒各代表株均能良好地在端胚肾组织培养中传代适应,在最初几代EID,。及血凝湔虔逐渐增高,以后维持在一定的水平。 三、利用血球吸附试验测定流戚病毒在鸡胚肾组织培养的繁殖滴度,是一种比较敏感和可靠的方法。 四、在鸡胚肾组织培养传代适应的病毒株与原株之同的抗原性及对非特异性抑制素的敏感性无显著的差别。 五、关于鸡胚肾组织培养与人胚肾、猴肾组织培养之间对流成病毒的敏感性的差异及鸡胚肾组织培养的实用价值进行了讨论。     

流行性乙型脑炎病毒的变異II．不同毒株通过鸡胚组织培养后的毒力变異

1．流行性乙型脑炎不同毒栋通过鸡胚悬浮组织块连续传代50一100代后对小白鼠的神经外毒力逐渐下降,但其表现程度不完全一致,原来神经外毒力较低的SA4毒株则下降比较多,直至完全丧失。脑腔毒力的变化在不同毒株之同的差异更为明显;P3及Lm株经培养200代左右其毒力始格保持恒定,而SA4株毒力(LD50)则自181代以后开始下降1一2log。 2．对小白鼠脑腔毒力下降的SA4株对恒河猴脑腔致病力亦有一定的减弱,主耍表现在猴子于感染病毒后的发病溉伏期及病程比原毒株延长约一倍。 3．通过鸡胚组织块连续传代后的病毒对小白鼠的致病力和免疫力之间有一定的关系,SA4株当其脑腔毒力开始下降,腹腔毒力完全丧失后,则几乎完全失去了对小白鼠的 免疫性,而P3及Lm株的神经外毒力虽有下降,但仍然保持一定的致病力,因而仍然具有一定的免疫力。     

流行性出血热(EHF)病毒半微量甲基纤维素空斑法的建立

本文报道EHF病毒一种新的空斑形成按术,即半微量甲基纤维素空斑法的建立及其应用。6株来源不同的毒株均可在V_(ero)-E_6细胞或V_(ero)细胞上形成清晰的空斑,形成的空斑能被特异抗EHF病毒血清所中和。其敏感性与用琼脂糖作覆盖物的空斑法一致。该法具有操作简便、快速等优点,适用于EHF的病原学和血清学研究。     

仙苔病毒诱导细胞融合效力的研究

用瓦克(Walker)256-大白鼠未分化腺癌细胞和鸡红血球二种细胞来研究仙苔病毒诱导细胞融合的效力、与鸡胚尿囊液,病毒的血凝单位(HAU),病毒的不同稀释度、病毒在鸡胚中繁殖的时间,分布于不同密度梯度离心带的病毒颗粒,及病毒毒种的关系;并比较了不同细胞系统对仙苔病毒融合效力的影响,提出了融合因子存在于病毒颗粒本身,而不似存在于尿囊液中。文中从细胞融合这一角度,认为同一病毒毒种繁殖出来的子代是不同质的,有高融合效力的和低融合效力的病毒颗粒。HAu不能反映各种不同融合效力病毒颗粒的含量,因而其与融合效力不直接相关。病毒在鸡胚中繁殖的时间及毒种的质量,影响病毒子代的融合效力。病毒的不同稀释度和不同细胞系统影响病毒的融合效力,但这种影响不是绝对的,而是相对。     

细胞源与鸡胚源传染性支气管炎病毒激活JAK-STAT信号通路的差异性研究

鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)对鸡的呼吸道、肾脏和输卵管等器官造成严重损伤,主要引起鸡产蛋率下降和雏鸡死亡.目前通过鸡胚传代获得IBV疫苗株和流行毒株.IBV Beaudette株是目前实验室研究的经典毒株,已经适应人源和猴源细胞,可利用Vero细胞进行制备.有研究表明,IBV感染延迟干扰素的表达,并对JAK-STAT信号通路具有拮抗作用.本研究中发现,通过Vero细胞制备的IBV Beaudette株,在感染早期激活STAT1,通过鸡胚制备的IBV Beaudette,则不能有效激活STAT1.进一步研究发现,鸡胚传代的IBV QX株和新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)亦不能有效刺激JAK-STAT信号通路.两种制备病毒的方式分别得到不同的试验结果,推测是由于在病毒感染条件下,Vero细胞分泌到培养液中的细胞因子所致.进一步研究揭示,病毒感染条件下,细胞分泌的因子,瞬时激活了 STAT1.本研究对于病毒的制备方式对天然免疫信号通路的影响,具有一定的参考和借鉴作用.     

随机引物PCR扩增鸡胚致死孤儿病毒DNA的研究

在电镜下观察鸭病毒性肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒时,另看到一大小为70—80nm,无囊膜,20面体对称的病毒颗粒。为了解该污染病毒,作者挑选了4条随机引物对此未知病毒分别进行反转录PCR和直接PCR扩增,结果共扩增出3条基因片段,经测序(一个反应)后分析与禽腺病毒1型——鸡胚致死孤儿病毒基因组部分序列同源性分别高达99．5％、99．6％和99．5％。从而得知鸭病毒性肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒受到了鸡胚致死孤儿病毒的严重污染。     

H5N1亚型禽流感病毒拯救体系的建立

选择鸡胚高产的鸭源H5N1亚型禽流感病毒A/Duck/Shandong/093/2004株作为骨架病毒,在完成了全基因组序列测定基础上,设计合成的11对引物对病毒的8个基因分11段进行扩增。通过与转录载体PHW2000连接,构建A/SD/04的8个基因的拯救载体,经测序获得序列准确的拯救质粒:2412、42、243、244、245、246、247和248。A/SD/04的8质粒与PR8(H1N1)进行不同组合的拯救,获得8个均含A/SD/04 HA基因的H5重组流感病毒。鸡胚尿囊液中重组病毒的血凝效价在28~210,EID50在10-8.5~10-9之间,MDT在34~46h之间,均与野生A/SD/04(wt A/SD/04)相似。重组病毒对6周龄的SPF鸡的静脉接种指数(IVPI)与wt A/SD/04却有明显的差异,说明不同组合的内部基因影响病毒对鸡的致病力,但不影响病毒的鸡胚致死能力、对鸡胚的感染能力和病毒在鸡胚中的繁殖能力。构建的A/SD/04的8个质粒拯救系统,为H5N1的基因功能研究和新型疫苗开发奠定基础。     

甲型肝炎重组痘苗病毒(VMS11HAV25)的构建及其某些生物学性质

将5′端经过剪切的甲型肝炎病毒全部开放读码框架cDNA连接于痘苗病毒晚期启动子P11下游,重组于痘苗病毒天坛株的HiodⅢM片段Spb Ⅰ位点获得了重组病毒VMS11HAV25。对其生物学性质的研究表明,该重组病毒诱生痘苗抗体的能力、对鸡红细胞的血凝性质、空斑大小及对温度的稳定性等均与原天坛株相同。重要的区别是,重组病毒在家兔皮内和小鼠脑内的毒力都比原天坛株低约1个对数。病毒在人胚肺二倍体细胞连续传15代的表达水平与传代早期者相同。连续传20代后提取病毒DNA做Southern blot杂交表明,甲型肝炎病毒基因仍稳定地存在于原插入位置。     

H5N1亚型禽流感病毒NS第263—277位核苷酸缺失提高病毒对鸡的致病力

为研究2000年以来绝大多数H5N1亚型禽流感病毒分离株在非结构基因的第263—277位发生15个碱基缺失现象的生物学意义,构建H5N1A／D／SD／04株HA、NA、NS的全基因表达／转录载体,以及NS的删除突变载体（m248）,A/D/YZ/04株的NS基因表达／转录载体（848）和其补加15个核苷酸的NS突变载体（m848）。构建的载体分别与编码WSN（H1N1）内部基因载体进行组合转染,拯救获得4个具不同NS的重组的H5N1亚型流感病毒：RWSN-848和RWSN—m248在263-277位缺失15个碱基。RWSN-m848和RWSN-248则在相同位置不发生缺失。4个重组病毒的平均鸡胚繁殖效价（HA）、鸡胚的平均死亡时间（MDT）和鸡胚半数感染量（EID50）均无显著差异;但RWSN-848和RWSN-m248对6周龄SPF鸡的致病力明显高于RWSN—m848和RWSN-248。结果说明H5N1的NS基因在263～277位核苷酸发生缺失后,不影响重组H5N1在鸡胚中的繁殖性能,但提高了病毒对鸡的致病力。     

H5N1亚型禽流感病毒NS第263～277位核苷酸缺失提高病毒对鸡的致病力

为研究2000年以来绝大多数H5N1亚型禽流感病毒分离株在非结构基因的第263~277位发生15个碱基缺失现象的生物学意义,构建H5N1 A/D/SD/04株HA、NA、NS的全基因表达/转录载体,以及NS的删除突变载体(m248),A/D/YZ/04株的NS基因表达/转录载体(848)和其补加15个核苷酸的NS突变载体(m848)。构建的载体分别与编码WSN(H1N1)内部基因载体进行组合转染,拯救获得4个具不同NS的重组的H5N1亚型流感病毒:RWSN-848和RWSN-m248在263~277位缺失15个碱基,RWSN-m848和RWSN-248则在相同位置不发生缺失。4个重组病毒的平均鸡胚繁殖效价(HA)、鸡胚的平均死亡时间(MDT)和鸡胚半数感染量(EID50)均无显著差异;但RWSN-848和RWSN-m248对6周龄SPF鸡的致病力明显高于RWSN-m848和RWSN-248。结果说明H5N1的NS基因在263~277位核苷酸发生缺失后,不影响重组H5N1在鸡胚中的繁殖性能,但提高了病毒对鸡的致病力。