日本血吸虫Sj Cyclophilin B基因的克隆、表达及免疫保护效果分析

本研究克隆和表达了日本血吸虫Cyclophilin B(Sj CyPB)编码基因的cDNA,分析其在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,评估该重组抗原在小鼠体内诱导的抗血吸虫免疫保护效果。本研究以日本血吸虫童虫cDNA为模板,RT-PCR扩增其基因全长cDNA,提交序列到NCBI,登录号为GQ403665。荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,构建重组表达质粒,表达纯化重组蛋白。利用Western blotting检测重组蛋白的抗原性。以重组抗原免疫小鼠,评估其对小鼠诱导的免疫保护效果。结果表明,RT-PCR获得了Sj CyPB编码基因的全长cDNA,其开放阅读框为672bp。经分析确定其为CyPs家族中的CyPB基因,命名为Sj CyPB。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在18d童虫期表达量最高,32d次之。构建了重组表达质粒pGEX-6P-1-SjCyPB,并在大肠杆菌中成功表达,表达产物分子量为49.5kDa。Western blotting试验显示该重组蛋白具有良好的抗原性,在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得31.5%的减虫率和41.01%的肝脏减卵率。本研究获得了日本血吸虫童虫期高表达的Sj CyPB基因的全长cDNA,成功构建了Sj CyPB原核重组表达质粒,并在大肠杆菌中成功表达,证实该重组抗原在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护效果。     

日本血吸虫SjOST48基因的克隆、表达及其重组蛋白免疫保护效果分析

为了鉴定日本血吸虫SJCHGC01743基因并评估其重组蛋白作为新的血吸虫病候选疫苗抗原的潜力,利用PCR技术扩增日本血吸虫SJCHGC01743基因,应用荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的转录水平,以p ET-28a(+)为载体构建重组表达质粒并诱导其在大肠杆菌中表达。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备免疫血清,利用Western blotting检测重组蛋白的免疫原性,应用间接免疫荧光技术对SJCHGC01743进行蛋白组织定位,利用间接ELISA方法检测小鼠血清中特异性抗体水平。将重组抗原免疫小鼠,评估其免疫保护效果。PCR扩增得到1 248 bp不含信号肽的c DNA序列,同源性分析结果显示,该基因为日本血吸虫寡糖转移酶OST48亚基,命名为Sj OST48。实时定量PCR分析显示Sj OST48在检测的童虫和成虫各个期别虫体中均有转录,其中在28 d虫体中的转录水平最高,在42 d雌虫中的转录量显著高于雄虫。构建的重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj OST48成功在大肠杆菌中表达,重组蛋白r Sj OST48分子量约50 k Da。Western blotting分析表明r Sj OST48能被小鼠免疫血清识别,具有良好的免疫原性,间接免疫荧光实验表明Sj OST48蛋白主要分布于虫体体被,少量分布于实质。ELISA检测结果表明r Sj OST48能诱导产生较高的特异性Ig G、Ig G1和Ig G2a抗体。动物免疫保护实验结果表明Sj OST48能诱导小鼠产生32.62%(P0.05)的减虫率及57.61%(P0.01)的肝脏减卵率。本研究为深入探讨日本血吸虫Sj OST48基因的生物学功能及筛选新的血吸虫疫苗候选分子奠定了基础。     

日本血吸虫SjRAD23基因的克隆表达及基因重组抗原的免疫保护效果

辐射敏感蛋白23具有核苷酸切除修复功能,在泛素蛋白酶体途径中起到重要作用。本研究利用PCR技术克隆了日本血吸虫辐射敏感蛋白23(Sj RAD23)编码的c DNA序列,成功获得Sj RAD23的基因序列,其ORF为1 053 bp。构建Sj RAD23基因重组表达质粒p ET28a(+)-Sj RAD23,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达,重组蛋白在上清和沉淀中都有存在。利用免疫组化技术检测该蛋白在虫体的分布情况,该蛋白广泛分布在日本血吸虫虫体被膜。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,免疫小鼠血清中检测到较高水平的特异性Ig G、Ig G1和Ig G2a。Western blotting分析显示重组蛋白能够被日本血吸虫成虫可溶性抗原免疫小鼠血清所识别。用重组蛋白r Sj RAD23免疫结果与206佐剂对照组比较,r Sj RAD23在BALB/c小鼠中诱导了35.94%减虫率,40.59%肝脏减卵率。结果表明Sj RAD23具有作为疫苗候选分子的潜力。     

日本血吸虫磷酸甘油酸变位酶SjPGAM基因的克隆、表达及功能分析

磷酸甘油酸变位酶(Phosphoglycerate mutas)是糖酵解过程中的一种重要酶,主要催化3-磷酸甘油酸转化为2-磷酸甘油酸.利用PCR技术从日本血吸虫19 d童虫中首次扩增到一个PGAM家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含753 bp,编码250个氨基酸,理论分子量28.26 kD,理论等电点7.01.同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型PGAM家族特征,推测为血吸虫的PGAM基因,命名为SjPGAM(GenBank Accession No.EU374631).实时定量PCR分析显示该基因在14d和19d童虫中的表达量明显高于其他发育阶段,42d雄虫中的表达量高于雌虫.构建了该基因的原核重组表达质粒pET-28a( )-PGAM,在大肠杆菌系统中成功获得了表达,重组蛋白以包涵体形式存在,Western blotting显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别.SjPGAM基因及其表达产物的获得,为探索PGAM基因家族在血吸虫能量代谢过程中碳水化合物转运、新陈代谢调节和生长发育提供了重要基础.     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt_4基因的克隆、表达及功能分析

由Wnt基因家族产物与其它相关基因产物构成的Wnt信号通路,是细胞发育和生长调节的一个关键途径,对动物的发育特别是生殖系统的发育起重要的调节作用。在人类和小鼠中,Wnt4蛋白是性腺分化过程中主要调节因子,在胚胎发育中起着关键作用。利用RACE技术从日本血吸虫19d童虫中首次扩增到一个Wnt家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含1311bp,编码436个氨基酸,理论分子量49.6kD。同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征,与日本三角涡虫、人Wnt4的氨基酸序列相似性分别达43％、37％,推测为血吸虫的Wnt4基因,命名为Sjwnt4（GenBank登陆号DQ643829）。实时定量PCR分析显示该基因在14d童虫、19d童虫、31d虫体、44d雌虫及44d雄虫中均有表达,其中19d童虫中的表达量明显高于其它发育阶段,44d雌虫中的表达量明显高于雄虫。构建了该基因的原核表达载体pGEX_4T_2_Sjwnt4,应用大肠杆菌系统进行了表达,表达蛋白以包涵体形式存在,Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。Sjwnt4基因及其表达产物的获得,为探索Wnt信号通路对血吸虫发育、生殖的调节提供了重要基础。     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt-4基因的克隆、表达及功能分析

由Wnt基因家族产物与其它相关基因产物构成的Wnt信号通路,是细胞发育和生长调节的一个关键途径,对动物的发育特别是生殖系统的发育起重要的调节作用。在人类和小鼠中,Wnt4蛋白是性腺分化过程中主要调节因子,在胚胎发育中起着关键作用。利用RACE技术从日本血吸虫19d童虫中首次扩增到一个Wnt家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含1311bp,编码436个氨基酸,理论分子量49.6kD。同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征,与日本三角涡虫、人Wnt4的氨基酸序列相似性分别达43%、37%,推测为血吸虫的Wnt4基因,命名为Sjwnt4(GenBank登陆号DQ643829)。实时定量PCR分析显示该基因在14d童虫、19d童虫、31d虫体、44d雌虫及44d雄虫中均有表达,其中19d童虫中的表达量明显高于其它发育阶段,44d雌虫中的表达量明显高于雄虫。构建了该基因的原核表达载体pGEX-4T-2-Sjwnt4,应用大肠杆菌系统进行了表达,表达蛋白以包涵体形式存在,Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。Sjwnt4基因及其表达产物的获得,为探索Wnt信号通路对血吸虫发育、生殖的调节提供了重要基础。     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt_4基因的克隆、表达及功能分析

由Wnt基因家族产物与其它相关基因产物构成的Wnt信号通路,是细胞发育和生长调节的一个关键途径,对动物的发育特别是生殖系统的发育起重要的调节作用。在人类和小鼠中,Wnt4蛋白是性腺分化过程中主要调节因子,在胚胎发育中起着关键作用。利用RACE技术从日本血吸虫19d童虫中首次扩增到一个Wnt家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含1311bp,编码436个氨基酸,理论分子量49.6kD。同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征,与日本三角涡虫、人Wnt4的氨基酸序列相似性分别达43％、37％,推测为血吸虫的Wnt4基因,命名为Sjwnt4（GenBank登陆号DQ643829）。实时定量PCR分析显示该基因在14d童虫、19d童虫、31d虫体、44d雌虫及44d雄虫中均有表达,其中19d童虫中的表达量明显高于其它发育阶段,44d雌虫中的表达量明显高于雄虫。构建了该基因的原核表达载体pGEX_4T_2_Sjwnt4,应用大肠杆菌系统进行了表达,表达蛋白以包涵体形式存在,Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。Sjwnt4基因及其表达产物的获得,为探索Wnt信号通路对血吸虫发育、生殖的调节提供了重要基础。     

日本血吸虫SjIrV1的基因特性及免疫保护效果

钙结合蛋白是日本血吸虫生长发育不可缺少的蛋白,具有非常广泛而重要的功能.在课题组日本血吸虫体被表膜蛋白研究基础上,利用PCR技术克隆了中国大陆株日本血吸虫66 kDa钙结合蛋白(SjIrV1)编码基因的cDNA序列,BLAST分析与菲律宾株日本血吸虫SjIrV1 cDNA编码序列一致,荧光定量PCR分析表明该基因在童虫和成虫期不同发育阶段均有表达,其中在35d和42d成虫中表达量较高,在42d雌虫中该基因表达水平远高于42d雄虫.构建重组表达质粒pET28a(+)-SjIrV1,在大肠杆菌中成功诱导表达,重组蛋白主要以可溶性形式存在,通过高效液相色谱法(RP-HPLC)以及串联质谱法(MS/MS)鉴定所获蛋白为目的蛋白SjIrV1.蛋白质印迹(Western blotting)分析结果显示重组蛋白能被感染日本血吸虫鼠血清和免疫鼠血清所识别,SjIrV1蛋白在虫体各发育阶段中均表达.免疫荧光染色实验观察表明SjIrV1主要分布在日本血吸虫成虫的表膜.应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,免疫鼠血清中检测到较高水平的特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体.结果表明SjIrV1可能在日本血吸虫的生长发育过程中起着重要作用.     

日本血吸虫中国大陆株26kD GST基因在大肠杆菌中的高效表达

用大肠杆菌高效表达日本血吸虫中国大陆株 2 6k D GST基因 (Sj2 6)并观察表达产物诱导的免疫保护效果 .将 Sj2 6基因亚克隆至 p ET2 8b(+)中构建重组表达质粒 Sj2 6/ p ET,转化大肠杆菌 BL 2 1 (DE3) .Sj2 6在诱导条件下及未诱导条件下均获得高效表达 .表达产物 (r Sj2 6GST)以包含体形式表达 ,分子量为 2 8k D左右 ,能用 6× His亲和层析柱纯化 ,纯化产量为 55～ 60 mg/ L大肠杆菌培养物 .免疫印迹及 ELSA实验证实 r Sj2 6GST具有良好抗原性 .用 r Sj2 6GST不加佐剂直接背部皮下免疫昆明系小鼠 ,获得了 1 9.6% (P<0 .0 5)的减虫率及 31 .9% (P<0 .0 5)的成熟虫体减虫率 ;且免疫组检获的虫体中未成熟虫体的比例为 32 % (66/ 2 0 6) ,明显高于对照组的 1 9.6% (56/2 85) (P<0 .0 1 ) ,说明 r Sj2 6GST免疫不仅可诱导抗日本血吸虫的部分攻击感染作用 ,而且能抑制部分虫体的发育 .     

日本血吸虫凋亡基因Sjcaspase3的克隆、真核表达 及其功能分析

为深入研究日本血吸虫细胞凋亡机制。利用PCR技术扩增得到Sjcaspase3的全长序列,其ORF含900 bp,编码299个氨基酸,理论分子量为33 509.7 Da,理论等电点为6.39。Real-time PCR分析表明该基因在日本血吸虫生长发育的各个时期均有表达,其中21 d表达量最高,42 d雌虫表达量高于42 d雄虫。成功构建了p XJ40-FLAG-Sjcaspase3重组质粒并转染到Hela细胞内,荧光定量PCR和Western blotting分析表明Sjcaspase3成功在Hela细胞中表达。酶活分析提示重组Sjcaspase3具有切割特异性底物天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(DEVD)的活性。流式细胞术检测了Sjcaspase3可诱导Hela细胞发生早期细胞凋亡。研究结果为深入探讨Sjcaspase3的生物学功能及日本血吸虫细胞凋亡机制奠定了基础。     

日本血吸虫单性感染雄虫和双性感染雄虫差异表达蛋白的筛选与鉴定

采用双向凝胶电泳和质谱技术对日本血吸虫单性感染雄虫和双性感染雄虫蛋白质表达谱进行分析，并在mRNA水平进行验证；观察差异表达SJCHGC蛋白重组真核表达质粒pEGFP-C1/SJCHGC在COS-7细胞中的表达和亚细胞定位，并分析其表达产物的抗原性. 成功鉴定了9个日本血吸虫雌雄合抱差异表达蛋白，其中在日本血吸虫雄虫合抱前表达上调的蛋白质有6个；而有3个蛋白质在日本血吸虫雄虫合抱后表达明显上调. 大多数差异蛋白功能涉及血吸虫的生长发育、生殖、营养、运动、信号传递等过程. 重组质粒pEGFP-C1/SJCHGC 融合基因真核表达载体在真核细胞COS-7中获得了表达,可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位,细胞所表达的融合蛋白具有血吸虫抗原性. 研究结果为揭示日本血吸虫雌雄合抱机制、研制抗血吸虫雌雄合抱疫苗提供了理论依据.     

日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白编码基因的克隆和表达

根据曼氏血吸虫抱雌沟蛋白SmGcp序列和日本血吸虫编码抱雌沟蛋白保守区的基因片段jGcp1分别设计三对引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板 ,用RT－PCR法扩增出大小为1949bp的基因片段。经序列分析推断该基因片段含编码日本血吸虫抱雌沟蛋白基因的阅读框,与SmGcp碱基一致性为85％,其理论推测氨基酸组成与曼氏血吸虫抱雌沟蛋白的一致性为83．7％。将上述扩增的基因片段克隆到表达载体pET28c( )中,在大肠杆菌BL21中获得表达,融合表达产物分子量约为80kD。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测,在预测位置出现了明显的识别条带,说明该编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因的表达产物具有抗原性。     

日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj14-3-3-Sj32)疫苗的构建及其表达

目的构建和鉴定日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj14-3-3-Sj32)疫苗,并研究日本血吸虫Sj14-3-3-Sj32融合基因在两歧双歧杆菌中的表达情况。方法将重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32电转化至两歧双歧杆菌中,构建重组Bb(pGEX-Sj14-3-3-Sj32)疫苗,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析鉴定。结果酶切、PCR证实重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32成功转入两歧双歧杆菌中,SDS-PAGE分析显示,诱导表达产物为相对分子质量(Mr)约73kDa的重组蛋白,与预期结果相符,表达的蛋白占菌体总蛋白的8.2%。Western blot显示日本血吸虫感染的兔血清可识别所表达的重组蛋白。结论成功构建日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj14-3-3-Sj32)疫苗,双歧杆菌可表达具有特异的抗原性的Sj14-3-3-Sj32重组蛋白。     

日本血吸虫三价DNA疫苗pVIVO2 SjFABP/Sj26.SjGAPDH的构建及其免疫保护作用评价

目的:构建含有日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白(SjFABP),3-磷酸甘油醛脱氢酶(SjGAPDH),26kDa谷胱甘肽S转移酶(Sj26)的三价DNA疫苗,并通过药理实验评价其抗血吸虫感染的免疫保护作用。 方法:  以血吸虫成虫RNA为模板制备cDNA第一链,RT-PCR扩增得到抗原基因片段,再通过重组PCR技术,将Sj26和SjGAPDH融合为Sj26.SjGAPDH基因。将SjFABP和Sj26.SjGAPDH分别克隆入pVIVO2的mcs1和mcs2,获得重组质粒pVIVO2-SjFABP/Sj26.SjGAPDH。瞬时转染MCF-7细胞,通过逆转录PCR（RT-PCR）检测抗原基因在mRNA水平的表达,通过间接荧光免疫（IIF）检测抗原基因在小鼠体内抗原水平表达,验证了DNA疫苗的有效性;并免疫小鼠后进行免疫保护性初步试验。结果:  经过酶切、测序及体内外表达验证,该三价DNA疫苗pVIVO2-SjFABP/Sj26.SjGAPDH构建成功;该三价DNA疫苗在小鼠抗血吸虫感染中诱发减虫率和减卵率达到58.6%和59.8%。结论:  该三价DNA疫苗组具有比单价和双价DNA疫苗组更加良好的免疫保护作用,为日本血吸虫DNA疫苗的研制奠定了基础。     

两种血吸虫病DNA疫苗的候选抗原基因研究

目的：以日本血吸虫基因SjFABP和SjGST原核表达产物检测二价DNA疫苗pVIVO2-SjFABP-SjGST在体内诱发的特异性抗体。方法：克隆日本血吸虫抗原基因SjFABP和sjGST,构建重组原核表达载体pET30a-SjFABP、pET30a-SjGST及真核表达载体pVIVO2-SjFABP-SjGST;将pET30a-SjFABP和pET30a-sjGST进行原核表达,并将表达产物用镍亲和柱分离纯化;采用Western印迹对日本血吸虫DNA疫苗pVIVO2-SjFABP-SjGST免疫4周后的BALB／c小鼠血清进行特异性抗体检测。结果：克隆了日本血吸虫抗原基因SjFABP（399bp）和町GST（657bp）,并构建了pET30a-SjFABP、pET30a-SjGST及pVIVO2-SjFABP-SjGST重组质粒;经Western印迹检测,pET30a-SjFABP及pET30a-SjGST原核表达的抗原蛋白均能够与经日本血吸虫二价DNA疫苗pVIVO2-SjFABP-SjGST免疫的小鼠的血清产生特异性免疫反应。结论：日本血吸虫町尉即和町GST基因的原核表达系统成功建立;原核表达的抗原蛋白具有免疫原性;以原核表达产物可检测日本血吸虫DNA疫苗pVIVO2-SiFABP-SiGST在体内诱发的特异性抗体。     

坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基基因的原核表达与鉴定

通过PCR的方法从重组质粒pMD-apcAB中扩增坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基基因(apcA),并将其克隆到高效表达外源基因的原核表达质粒pTO-T7。将构建好的质粒导入表达型大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行Western-blot和质谱鉴定。结果显示:apcA全长486bp,表达的α亚基(apcA)为带有原核表达载体T7g10的12个起始氨基酸的融合蛋白,其分子量约为19.7KD。0.5mmol/L的IPTG在37℃诱导6h时,apcA的表达量达到最大,达菌体总蛋白50%以上。Western-blot和质谱鉴定的结果表明获得的融合蛋白为重组坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基。       

藻红蓝蛋白α-亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素的重组

利用在大肠杆菌中表达的藻红蓝蛋白α－亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素PCB重组,吸收光谱、荧光光谱和高效可逆光化学性质分析表明,藻红蓝蛋白α－亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素直接重组,生成的胆素蛋白中辅基色素仍为藻蓝胆素;而藻红蓝蛋白α-亚基脱辅基蛋白与藻蓝胆素在藻红蓝蛋白α－亚基重组酶（pecE和pecF基因的表达产物）催化下重组,生成的胆素蛋白中辅基色素转变为藻紫胆素,并具有高效可逆光化学特性。     

重组人蛋白激酶CK 2α亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶 CK2 α亚基 c DNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,IPTG诱导后获特异高效表达 ,表达蛋白占菌体总蛋白的 30 % ,但大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物依次进行 DE- 5 2、P1 1磷酸纤维素和肝素 - Sepharose柱层析分离 ,最后从 30 9mg可溶性蛋白质中得到 6.1 mg纯化蛋白 . SDS- PAGE显示纯化的蛋白质为一分子量 4 2 k D的单一蛋白带 .Western- blot的结果证明 :纯化的表达产物与抗人 CK2α抗体可发生特异性免疫反应 . CK2α和β亚基等摩尔分子混合可组成有完全活性的全酶 .重组的 CK2全酶的性质和功能与该酶的已知特性一致 .这些结果证明重组蛋白是人蛋白激酶 CK2 α亚基