组合蛋白质工程和代谢工程设计全细胞催化剂合成靛蓝和靛玉红

从嗜高温放线菌Thermobifida fusca中分离得到的苯基丙酮单加氧酶主要催化芳香族化合物的Baeyer-Villiger氧化反应。对该酶的结构和功能进行研究时,发现位于底物结合口袋的Met446位点突变可以赋予突变酶催化C-H键活化的新功能,氧化吲哚合成靛蓝和靛玉红,但产量仅为1.89 mg/L。为了获得合成靛蓝和靛玉红的全细胞催化剂,直接补加吲哚并不能提高细胞合成效率,补加吲哚的前体物质L-色氨酸可以使细胞合成靛蓝和靛玉红的能力提高4.5倍,达到8.43 mg/L。为了进一步提高细胞的生物合成效率,通过代谢工程改造大肠杆菌的糖代谢途径,阻断葡萄糖异构酶基因pgi,使磷酸戊糖途径代替糖酵解途径成为葡萄糖的主要代谢通路,从而为细胞提供更多氧化吲哚所需的辅因子NADPH,导致细胞合成靛蓝和靛玉红的效率进一步提高3倍,达到25 mg/L。通过组合蛋白质工程和代谢工程设计全细胞催化剂不仅可以高效地合成靛蓝和靛玉红,而且设计理念为相关全细胞催化剂的开发提供了一种新的策略。     

青黛的化学成分

从十字花科植物靛青制成的青黛中,除了已知的靛蓝及靛玉红外,分离到四种化学成分,其中一种为色素成分,通过光谱分析及化学裂解,证明此成分的化学结构为6-吲羟-吲哚并[2,1b]喹唑啉酮-12,即青黛酮,并以吲哚酚与色胺酮缩合合成了青黛酮。其余三种成分鉴定为正-廿九烷、吲哚醌及色胺酮。     

根部淹水对菘蓝活性成分的影响

对菘蓝幼苗根系进行不同深度的淹水处理,采用HPLC法测定不同处理下菘蓝叶中靛蓝、靛玉红的含量。结果表明,淹水处理初期样品与对照相比,靛蓝的含量呈上升趋势,淹水后期急剧下降;靛玉红含量在淹水第1d急剧上升,之后随淹水时间延长不断降低。淹水深度越深对靛蓝、靛玉红含量影响越大。适当的淹水处理能诱导菘蓝叶中次生代谢产物靛蓝、靛玉红的合成与积累。该结果可为栽培菘蓝的质量控制和有效利用提供理论依据。     

COI1参与茉莉酸调控拟南芥吲哚族芥子油苷生物合成过程

芥子油苷是一类具有防御作用的植物次生代谢产物,外源激素茉莉酸对吲哚族芥子油苷的合成具有强烈的诱导作用,但茉莉酸调控吲哚族芥子油苷生物合成的分子机制并不清楚。以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的野生型和coi1-22、coi1-23两种突变体为研究材料,通过茉莉酸甲酯(MeJA)处理,比较了拟南芥野生型和coi1突变体植株吲哚族芥子油苷含量、吲哚族芥子油苷合成前体色氨酸的生物合成基因(ASA1、TSA1和TSB1)、吲哚族芥子油苷生物合成基因(CYP79B2、CYP79B3和CYP83B1)及调控基因(MYB34和MYB51)的表达对MeJA的响应差异,由此确定茉莉酸信号通过COI1蛋白调控吲哚族芥子油苷生物合成,即茉莉酸信号通过信号开关COI1蛋白作用于转录因子MYB34和MYB51,进而调控吲哚族芥子油苷合成基因CYP79B2、CYP79B3、CYP83B1和前体色氨酸的合成基因ASA1、TSA1、TSB1。并且推断,COI1功能缺失后,茉莉酸信号可能通过其他未知调控因子或调控途径激活MYB34转录因子从而调控下游基因表达。     

解淀粉芽胞杆菌HZ-12中ysnE参与吲哚-3-乙酸合成的代谢途径研究

【目的】吲哚-3-乙酸是调控植物生长发育和生理活动的重要激素,吲哚-3-乙酸N-乙酰转移酶YsnE在吲哚-3-乙酸合成中发挥重要作用,本研究拟解析解淀粉芽胞杆菌中YsnE参与吲哚-3-乙酸合成的代谢途径。【方法】通过基因ysnE缺失和强化表达,分析ysnE对吲哚-3-乙酸合成影响,结合吲哚-3-乙酸合成中间物(吲哚丙酮酸、吲哚乙酰胺、色胺和吲哚乙腈)添加和体外酶转化实验,解析ysnE参与吲哚-3-乙酸合成的代谢途径。【结果】明确了YsnE在解淀粉芽胞杆菌HZ-12吲哚-3-乙酸合成中发挥重要作用。发现ysnE缺失菌株中的吲哚丙酮酸、吲哚乙酰胺和吲哚乙腈利用显著降低,揭示了YsnE主要发挥吲哚丙酮酸脱羧酶YclB和吲哚乙酰胺水解酶/腈水解酶/腈水合酶YhcX的功能,并通过参与吲哚丙酮酸、吲哚乙酰胺和吲哚乙腈途径来影响吲哚-3-乙酸合成。【结论】初步揭示了YsnE通过影响吲哚丙酮酸、吲哚乙酰胺和吲哚乙腈途径参与吲哚-3-乙酸合成的代谢机理,为吲哚-3-乙酸合成途径解析和代谢工程育种构建吲哚-3-乙酸高产菌株奠定了基础。     

冻伤蓝变对广义虾脊兰属植物中4种吲哚基衍生物含量的影响

以6种广义虾脊兰属植物和2种树兰亚科植物为材料,利用液相色谱 串联三重四极杆质谱仪(LCMS QQQ)测定了冻伤处理前后花和叶片中靛苷、靛红、靛蓝和靛玉红4种吲哚基衍生物的含量,分析广义虾脊兰属植物吲哚基衍生物的生成及种属间含量的差异。结果显示：(1)4种吲哚基衍生物在所测定的6种广义虾脊兰属植物中均被检出,但在2种树兰亚科植物五唇兰和足茎毛兰中均未被发现。(2)在所测定的6种广义虾脊兰属植物花和叶片中,冻伤处理后的靛蓝、靛玉红和靛红含量均显著上升,而靛苷含量显著下降,同时花中的吲哚基衍生物含量均高于叶片。(3)6种广义虾脊兰属植物花和叶中吲哚基衍生物总含量以黄兰花最高,三褶虾脊兰叶最低。研究表明,冻伤处理引起靛苷向靛蓝的大量转化是导致冻伤后广义虾脊兰属植物组织中呈现出蓝色的主要原因,推测吲哚基衍生物可能也是一类与植物防御相关的化合物,在植物抵御逆境中扮演着重要的角色。     

生长素合成途径的研究进展

生长素是一类含有一个不饱和芳香族环和一个乙酸侧链的内源激素, 参与植物生长发育的许多过程。植物和一些侵染植物的病原微生物都可以通过改变生长素的合成来调节植株的生长。吲哚-3-乙酸(IAA)是天然植物生长素的主要活性成分。近年来, 随着IAA生物合成过程中一些关键调控基因的克隆和功能分析, 人们对IAA的生物合成途径有了更加深入的认识。IAA的生物合成有依赖色氨酸和非依赖色氨酸两条途径。依据IAA合成的中间产物不同, 依赖色氨酸的生物合成过程通常又划分成4条支路: 吲哚乙醛肟途径、吲哚丙酮酸途径、色胺途径和吲哚乙酰胺途径。该文综述了近几年在IAA生物合成方面取得的新进展。     

夏播菘蓝不同居群干物质和活性成分积累特征

为研究夏播菘蓝不同栽培居群的最佳采收期,以来自于山西、安徽、甘肃、江苏和河南的5个栽培居群为材料,设置盆栽土培实验,于菘蓝生长第60天起,间隔10d采样,共采集6次样品,采用HPLC法测定其叶片、叶柄、根茎和根4个部位的靛蓝与靛玉红含量。结果表明:(1)不同栽培居群随着生长时间的延长,其叶片、叶柄、根茎及根的生物量持续增加,其中来自于山西居群的生长最佳,干物质积累量最大。(2)不同居群叶片及叶柄内靛蓝与靛玉红含量最大值出现在生长90~100d,即为叶内活性成分积累的高峰期。(3)综合分析其活性成分与干物质的积累量,各居群叶片靛蓝积累量最大值在生长90~100d,叶片、叶柄与根茎的靛玉红积累量也出现在90~100d。若以中国药典的靛玉红为质量控制指标,同时综合考察其生物量指标与活性成分积累量指标,夏季播种的来自于山西、安徽和河南的菘蓝居群最佳采收期为生长100d左右,而来自于甘肃与江苏居群的则以生长90d最佳。     

氮营养对苗期菘蓝生长及活性成分的影响

采用盆栽方法,设置5种氮素营养水平(N0、N1、N2、N3、N4,分别为0、2.5、5、10、15 mmol·L-1),以苗期菘蓝的生物量、光合参数、氮同化物含量、氮代谢酶活性、叶中靛蓝、靛玉红、总黄酮含量以及根中(R,S)-告依春含量等作为指标,研究氮营养对苗期菘蓝生长及活性成分的影响。结果表明:N0—N3处理组菘蓝的株高、主根直径及单株干重显著降低,根冠比增加。随着氮素水平降低,菘蓝叶片的叶绿素、类胡萝卜素含量以及净光合速率、蒸腾速率、气孔导度均呈逐渐降低趋势,胞间二氧化碳浓度呈升高趋势。低氮营养使菘蓝叶片中可溶性蛋白、硝态氮、游离氨基酸含量降低,抑制了硝酸还原酶活性、谷氨酰胺合成酶活性。N0—N2处理组菘蓝叶片中的靛玉红及总黄酮含量较高,靛蓝含量在氮素水平为0~10 mmol·L-1范围内随着氮水平的降低而减小,(R,S)-告依春含量在N0处理时显著低于其余处理。综合分析认为,较低的供氮水平显著影响苗期菘蓝的生长及部分生理指标,降低叶片中的靛蓝与根中的(R,S)-告依春含量,但促进叶中靛玉红及总黄酮的积累。综合考虑苗期菘蓝的生物量与活性成分含量,将氮素水平控制在10~15 mmol·L-1范围内,可以获得产量稳定、活性成分含量较高的药材。     

海洋链霉菌Streptomyces sp. B9173合成的2-吲哚酮生物碱

【背景】海洋来源的天然产物近年来已成为小分子药物的重要来源。对海洋链霉菌Streptomyces sp. B9173的基因组分析显示,该菌包含多种天然产物的生物合成基因簇,具有产生多种新化合物的潜力。【目的】挖掘B9173菌株中未知的次级代谢产物,以期发现结构新颖或生物活性独特的化合物。【方法】利用HPLC/LC-MS结合的方法,排除了该菌株产生的已知化合物,确定3个未知化合物作为挖掘对象,然后利用正、反相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱和高效液相色谱等技术对次级代谢产物进行分离纯化,最后得到化合物单体。利用质谱及核磁共振光谱技术对化合物结构进行解析和鉴定。【结果】确定3个化合物分别是色胺酮、甲基异靛蓝和N,N-二甲基异靛蓝,三者都属于2-吲哚酮生物碱。其中色胺酮具有非常广的生物活性,包括抗菌、抗肿瘤、抗炎症等,是药物开发的良好前体,这是首次在细菌中被分离得到。甲基异靛蓝是我国临床治疗慢性粒细胞白血病的药物,这是首次在微生物发酵液中被分离得到。目前这3个化合物均主要依赖化学合成。本研究结合B9173菌株的代谢背景,推测了3个化合物的生物合成途径。【结论】基于紫外吸收光谱和质谱特征,从B9173菌株的发酵液中分离鉴定了3个2-吲哚酮生物碱,丰富了微生物活性天然产物的种类,对3个化合物生物合成途径的推测也为进一步研究色胺酮和甲基异靛蓝的生物合成机制奠定基础,后续可利用合成生物学技术重构这类化合物的生物合成途径,提供更便捷、低成本的生物合成方法。     

5-氨基乙酰丙酸(ALA)对遮光环境下菘蓝的生长、叶片气孔气体参数和生物碱含量的影响

研究了不同浓度的5-氨基乙酰丙酸(ALA)处理遮光环境对菘蓝(Isatisindigotica)生长和靛蓝、靛玉红含量的影响。结果表明:遮光显著降低菘蓝幼苗叶片叶绿素含量、光合气体交换参数、根长、根径、生物量以及靛蓝、靛玉红含量,而外源ALA处理可以缓解遮光对菘蓝营养生长、光合作用以及生物碱积累的抑制效应;其中,13.3～25mg·L-1的ALA对营养生长以及光合作用的促进效应最明显,而100mg·L-1的ALA对生物碱积累的促进效应最明显。作者建议,在弱光条件下,用低浓度ALA处理可以提高菘蓝生物学产量,而在生物碱积累期,用较高浓度ALA处理可以提高菘蓝的药用成分含量。     

长春花萜类吲哚生物碱的生物合成途径

药用植物长春花含有130余种萜类吲哚生物碱,该文对近年来国内外有关长春花生物碱合成的上游和下游阶段及其相关研究进行详细的归纳总结。长春花上游合成途径中在相应的酶促作用下由吲哚途径产生的色胺和由类萜途径产生的裂环马钱子苷在异胡豆苷合成酶的催化作用下形成了所有长春花TIAs的共同前体物质3α-异胡豆苷,3α-异胡豆苷再由下游途径的各种酶促作用下生成种类各异的长春花TIAs。通过对长春花TIAs合成途径的阐述,为萜类吲哚生物碱合成及其代谢调控的相关研究提供参考。     

缺氮和复氮对菘蓝幼苗生长及氮代谢的影响

对基质育苗后水培的菘蓝进行缺氮与复氮处理,分析其生长情况及氮代谢产物含量的变化,探讨缺氮和复氮对菘蓝幼苗生长及氮代谢的影响,以提高菘蓝产量和品质以及栽培过程中的氮素利用效率。结果显示:(1)正常供氮条件下,菘蓝幼苗的叶绿素含量、谷氨酰胺合成酶(GS)活性、硝态氮含量、靛玉红含量为最高,而其株高、主根直径、根的鲜重与干重、叶的鲜重与干重、根系活力均最小。(2)缺氮处理增加了菘蓝幼苗的主根直径和根干重,提高其根系活力和硝酸还原酶(NR)活性,促进游离氨基酸在叶中的积累;但降低了GS的活性,也降低了叶中硝态氮、可溶性蛋白、靛玉红及根中游离氨基酸的含量;缺氮对叶中靛蓝的含量无明显影响。(3)复氮处理增加了菘蓝幼苗的株高、主根长、根鲜重、叶鲜重、叶干重,提高了其根系活力,降低了NR和GS的活性;与对照相比,复氮降低了叶中硝态氮含量,提高了叶中可溶性蛋白、靛蓝及根中游离氨基酸的含量,但对叶中游离氨基酸和靛玉红含量影响较小。研究表明,缺氮后再复氮有利于菘蓝幼苗叶的生长,同时有利于增加其叶内靛蓝含量,从而提高其产量和品质。     

利用大肠杆菌细胞工厂生产吲哚-3-乙酸的研究

目的:利用重组大肠杆菌全细胞转化色氨酸生产IAA.方法:在大肠杆菌胞内构建两条全新的IAA合成途径,即吲哚-3-乙酰胺(indole-3-acetamide,IAM)途径和色胺(tryptamine,TRP)途径.结果:IAM途径涉及两个酶,分别是色氨酸-2-单加氧酶(IAAM)和酰胺酶(AMI1),构建好的重组大肠杆...     

NaCl胁迫过程中喷施ALA对菘蓝幼苗生长及主要活性成分含量的影响

以来源于安徽亳州和山西运城的菘蓝（Isatis indigotica Fort.）幼苗为实验材料,对100 mmol·L-1NaCl胁迫条件下喷施50.0、25.0、16.7、12.5和0.0 mg·L-15-氨基乙酰丙酸（ALA）后幼苗部分生长指标、叶片中靛蓝和靛玉红含量以及根中表告依春含量的变化进行了研究。结果表明：在100 mmol·L-1NaCl单一胁迫条件下,来源于安徽亳州的幼苗单株叶鲜质量和叶片中靛蓝和靛玉红含量均低于对照,单株根鲜质量、根冠比以及根中表告依春含量均高于对照;来源于山西运城的幼苗单株叶和根鲜质量、叶片中靛玉红含量和根中表告依春含量均低于对照,根冠比和叶片中靛蓝含量均高于对照。在NaCl胁迫过程中喷施ALA对菘蓝幼苗生长和有效成分的积累均有不同效应。其中,喷施25.0 mg·L-1ALA后安徽亳州产幼苗单株叶和根鲜质量均最高且显著高于NaCl单一胁迫处理组;喷施16.7 mg·L-1ALA后山西运城产幼苗单株叶和根鲜质量均较高但与NaCl单一胁迫处理组无显著差异。喷施50.0 mg·L-1ALA后安徽亳州产幼苗叶片中靛蓝含量最高（0.376 mg·g-1）,喷施25.0 mg·L-1ALA后其叶片中靛玉红含量最高（9.977 mg·g-1）,喷施16.7 mg·L-1ALA后其根中表告依春含量最高（0.229 mg·g-1）,且均显著高于NaCl单一胁迫处理组;喷施16.7 mg·L-1ALA后山西运城产幼苗叶片中靛蓝含量最高（0.282 mg·g-1）,喷施12.5 mg·L-1ALA后其叶片中靛玉红含量和根中表告依春含量均最高（分别为4.526和0.301 mg·g-1）,且均显著高于NaCl单一胁迫处理组。研究结果表明：喷施适宜浓度ALA能够有效减轻NaCl胁迫对菘蓝幼苗生长的影响、提高其体内药用活性成分的含量;总体上看,产自安徽亳州的菘蓝幼苗的耐盐性较强,且不同种源适宜的ALA浓度也有一定差异。     

吲哚的微生物代谢及其作为新型信号分子的研究进展

吲哚,又称2,3-苯并吡咯,广泛应用于化工、医药、染料等行业,是工业上重要的前体物质,但其释放到环境中也是一种典型的氮杂环污染物。同时,作为一种常见的微生物代谢产物,自然界中无时无刻不发生着吲哚的合成—转化—降解过程。吲哚对微生物生物膜的形成、运动能力、毒性、质粒稳定性及抗生素抗性等多种生物功能有显著影响。因此,吲哚也被认为是新型且具有多功能的种间及跨界信号分子,在微生物生理学和动物行为学等领域发挥了重要作用。研究微生物介导的吲哚代谢机制,阐明其生物学功能的基础,是揭示吲哚在自然环境中的行为归趋和生态学意义的关键。本文系统地总结吲哚代谢的微生物资源及途径,介绍其作为信号分子的重要功能,并对有关吲哚-微生物相互作用的研究进行总结,以期为揭示复杂环境中吲哚生物代谢机制提供重要的理论参考。     

三类不同连接方式的双吲(口朶)化合物对核酸和蛋白质合成的影响

靛玉红是我国首先发现的治疗慢性粒细胞白血病的有效药物。它是两个吲哚环通过2位和3＇位碳原子之间的双键相连而成。中国医学科学院药物研究所合成室合成了三类不同连接方式的双吲哚化合物十个,其两个吲哚环分别以2,3＇,2,2＇或3,3＇相连(图1)。本文比较研究了这些化合物对癌细胞核酸和蛋白质合成的影响,对无细胞体系DNA合成的影响,以及与小牛胸腺DNA(CT-DNA)体外结合情况,井讨论了它们的作用与结构的关系。     

萘醌-氧吲哚生物碱coprisidins生物合成途径的研究（英文）

【目的】新颖结构的天然萘醌-氧吲哚类生物碱coprisidins(A和B)分离自昆虫肠道相关链霉菌,具有预防癌症的活性。作为首例具有萘醌-氧吲哚骨架的生物碱,对其独特生物合成机理的研究可为Ⅱ型聚酮类化合物生物合成途径提供新的认知。【方法】本研究对coprisidins的产生菌Streptomycessp.SNU607进行全基因组测序,并根据测序结果的生物信息学分析初步定位coprisidins的生物合成基因簇;通过基因敲除以及异源表达手段确定coprisidins的生物合成基因簇;基于体内遗传学实验与生物信息学分析初步推导coprisidins的生物合成途径。【结果】Streptomyces sp. SNU607中有23个基因簇可能参与次级代谢,其中4个基因簇与聚酮合酶(PKS)相关;通过基因敲除与异源表达实验,本研究证实1个Ⅱ型PKS负责coprisidins的生物合成;基于生物信息学分析,我们推测copH/I/M/O/N构成了1个基因盒,并负责起始单元丁酰CoA的合成;KSβ(Cop B)的序列比对表明coprisidins的Ⅱ型PKS系统更倾向于合成C20的初始聚酮链。【结论】Coprisidins的萘醌-吲哚结构是由Ⅱ型PKSs催化形成,我们推测丁酰Co A是coprisidins聚酮骨架的起始单元,在最小PKS、聚酮酶、环化酶的催化下先形成类似蒽环的四环系统,随后在后修饰酶与氧化重排的作用下生成萘醌-氧吲哚骨架。本研究为进一步探究萘醌-氧吲哚类生物碱的生物合成机制奠定了基础,同时增加了Ⅱ型PKSs合成产物的结构多样性。     

HPLC法对比不同产地南板蓝根药材靛蓝、靛玉红含量的研究

目的:以高效液相色谱法对广东不同产地(广东高要、广东罗定、广东罗浮、广东鼎湖)南板蓝根药材及常用伪品(爵床科植物广西马蓝)的主要成分靛蓝、靛玉红进行含量测定,对比不同产地南板蓝根药材靛蓝、靛玉红含量的差别.方法:采用HPLC法建立南板蓝根药材中靛蓝与靛玉红的含量测定方法.色谱条件:Kromasil C18(4.6mm×250mm,5μm);以甲醇-水(75:25)为流动相;检测波长:290nm;流速:1.0ml/min.柱温:40℃.结果:①靛玉红、靛蓝线性范围分别为1.652～33.04μg/ml、1.284～25.68μg/ml.回收率分别为98.92%,RSD=1.52%,N=5(靛玉红);102.61%,RSD=1.28%,N=5(靛蓝);②广西马蓝中未检测出靛玉红、靛蓝.结论:该方法操作简便、准确快速、重现性好,可完善现行的南板蓝根的药材质量标准,有效控制南板蓝根药材的质量.     

Burkholderia sp. IDO3中靛蓝合成基因的克隆表达及其合成特性

【目的】克隆和表达靛蓝合成基因,并将其用于靛蓝合成研究。【方法】对菌株Burkholderia sp.IDO3中靛蓝合成基因进行克隆和大肠杆菌异源表达,构建能合成蓝色色素的基因工程菌。利用液相色谱和质谱对产物进行分析,采用单因素法对培养温度、转速、培养基成分等进行优化,并考察优化条件下的靛蓝合成曲线。【结果】构建了一株重组大肠杆菌E.coli IND_AB,该菌株能够在LB培养基生长的过程中合成蓝色色素,产物分析表明该色素为靛蓝;菌株IND_AB在30°C和150 r/min条件下能在LB培养基中合成22.9 mg/L靛蓝,优化培养条件后产量达到25.4 mg/L;优化LB培养基各组分浓度后产量可提高到35.1 mg/L;外加50.0 mg/L吲哚或0.1 g/L色氨酸后靛蓝产量可分别提高到57.7 mg/L和64.4 mg/L,相比初始产量提高了152.0%和181.2%;靛蓝合成曲线表明在添加吲哚或色氨酸的培养基中,菌株IND_AB前6 h没有靛蓝生成,6-15 h为靛蓝合成加速期,18 h达到产量平衡。【结论】重组大肠杆菌IND_AB可用于生物合成高纯度靛蓝,为靛蓝的微生物合成提供了有效的基因资源。