中药贝母类的资源利用研究

贝母为传统中药,中国药典（1990）收载了川贝母（Fritillaria cirrhosa D.Don.)、暗紫贝母（F. unibracteata Hsiao et K.C.Hsia)、甘肃贝母（F.przeuxalskii Maxim ex Batak.）、梭砂贝母（F.delapayiFranch.）、浙贝母（F.thambergii Miq.）和平贝母（F.ussuriensis Maxim）.等8种。最近对四川、甘肃、新疆、湖北、浙江和江苏等省区的药源调查结果表明,各地药用的贝母有25个种和变种,其中最常用的有暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母、伊贝母、新疆贝母、托理贝母、平贝母和湖北贝母。20余种贝母所含生物碱的TLC和HPLC分析结果表明各种贝母所含生物碱有一定区别,并与产地有关,产于湖北、浙江和江苏省的种类都含有去氢贝母碱,大多含贝母碱和异贝母碱;产于四川、甘肃和新疆的种类都含有西贝素和去氢梭砂贝母碱,大多含茄次碱,产于四川的种类都含去氢川贝碱,产于新疆的种类都含梭砂贝母碱。本研究为建立贝母的品质评价方法和开发药用资源提供了科学依据。     

中国贝母属(Fritillaria)7种植物的核型研究（英文）

通过对7种国产贝母属(Fritillaria)植物的染色体核型进行观察和研究,报道了小白花贝母(F. albidoflora DuanZheng)、川贝母(F. cirrhosa Don)、伊贝母(F. pallidiflora Schrenk ex FischerMeyer)、华西贝母(F. sichuanica Chen)、托里贝母(F. tortifolia DuanZheng)、新疆贝母(F. walujewii Regel)、裕民贝母(F. yuminensis Duan)等7种植物的染色体数目及核型,其中3种为首次报道。结果显示,7种国产贝母属植物的核型均具有高度不对称性。此外,小白花贝母与已报道的黄花贝母(F. verticillata Willdenow)的核型存在明显差异,提示Flora of China将小白花贝母归并入黄花贝母的分类处理可能并不恰当,二者的关系需进一步研究。     

中国贝母属(Fritillaria)7种植物的核型研究

通过对7种国产贝母属（Fritillaria）植物的染色体核型进行观察和研究,报道了小白花贝母（F.albidoflora Duan&Zheng）、川贝母（F.cirrhosa Don）、伊贝母（F.pallidiflora Schrenk ex Fischer&Meyer）、华西贝母（F.sichuanica Chen）、托里贝母（F.tortifolia Duan&Zheng）、新疆贝母（F.walujewii Regel）、裕民贝母（F.yuminensis Duan）等7种植物的染色体数目及核型,其中3种为首次报道。结果显示,7种国产贝母属植物的核型均具有高度不对称性。此外,小白花贝母与已报道的黄花贝母（F.verticillata Willdenow）的核型存在明显差异,提示Flora of China将小白花贝母归并入黄花贝母的分类处理可能并不恰当,二者的关系需进一步研究。     

二代测序应用于检测GT1-7细胞中KISS1和GnRH启动子的DNA甲基化状态的研究

目的:利用二代测序技术检测GT1-7细胞中KISS1和GnRH基因启动子范围内的甲基化状态,并用金标准的亚硫酸氢盐修饰后的克隆测序作为对照,比较二代测序与金标准克隆测序在研究DNA甲基化检测中的差别。方法:提取GT1-7细胞基因组DNA并进行亚硫酸氢盐处理。进行巢式PCR,将PCR产物进行二代测序。同时采用金标准的亚硫酸氢盐修饰后克隆测序的方法作为对照,对相同批次的PCR产物进行克隆测序。结果:PCR产物二代测序结果表明KISS1和GnRH两个基因的27个CpG甲基化位点信息完整,结果准确。挑取10个克隆进行一代测序结果表明序列无丢失,KISS1和GnRH两个基因的27个CpG甲基化位点信息完整。结论:利用高通量的二代测序技术能够有效的对DNA甲基化的PCR产物进行检测,二代测序和克隆测序都是研究DNA甲基化的有效方法,但前者与克隆测序相比每一个读取序列(reads)都相当于一个单克隆,且二代测序每个区段得到成百上千个reads,因此二代测序结果更加精确。     

含有小檗碱的药用植物DNA条形码鉴定研究

[目的]评价ITS2与psbA-trnH条形码候选序列对含有小檗碱的药用植物的鉴定作用。[方法]对含有小檗碱与不含有小檗碱的药用植物的ITS2与psbA-trnH序列进行PCR扩增和测序,进行种内和种间变异分析,构建NJ进化树评价不同序列的鉴定能力。[结果]ITS2与psbA-trnH序列均能够成功地区分含有小檗碱与不含有小檗碱的药用植物。然而,ITS2在区分含有小檗碱的不同科药用植物的效率优于psbA-trnH序列。[结论]建立了以ITS2序列为主,psbA-trnH序列为辅的鉴定含有小檗碱的药用植物的方法,这为含有小檗碱的药用植物种质资源的整理与标准化,甚至育种都提供了有效的基础数据。     

基于DNA metabarcoding技术的如意金黄散处方成分鉴定研究

中药的有效性和安全性是国内外关注的热点,本研究以如意金黄散为例,基于DNA metabarcoding技术,尝试从投料药材真伪角度评价中药的有效性和安全性.首先,收集如意金黄散处方成分药材及其混伪品样品161份,从已发表文献中下载密切相关物种序列154条,构建"如意金黄散DNA条形码鉴定数据库",该数据库包含10属119个物种.收集不同批次的如意金黄散样品3份,以ITS2序列为条形码,使用Illumina HiSeq平台进行PE250深度测序,利用本研究构建的"如意金黄散DNA条形码鉴定数据库"进行投料药材基原物种识别,结果表明,基于DNA metabarcoding技术可检测到除厚朴外的全部处方成分,不同药材的测序量存在显著差异;检测到苍术药材的混伪品朝鲜苍术和天南星药材的混伪品虎掌南星,提示如意金黄散临床使用的有效性和安全性存在潜在风险;不同批次鉴定结果具有稳定性和可重复性.本研究表明,基于DNA metabarcoding技术的如意金黄散处方成分鉴定方法符合中药复杂体系特点,有望成为中成药鉴定的新方法,并为中成药的有效性和安全性评价提供参考.     

一种基于二代测序辨识短串联重复序列长度变异的新方法及其在人类遗传疾病研究中的应用（英文）

二代测序技术的涌现推动了基因组学研究,特别是在疾病相关的遗传变异研究中发挥了重要作用.虽然大多数遗传变异类型都可以借助于各种二代测序分析工具进行检测,但是仍然存在局限性,比如短串联重复序列的长度变异.许多遗传疾病是由短串联重复序列的长度扩张导致的,尤其是亨廷顿病等多种神经系统疾病.然而,现在几乎没有工具能够利用二代测序检测长度大于测序读长的短串联重复序列变异.为了突破这一限制,我们开发了一个全新的方法,该方法基于双末端二代测序辨识短串联重复序列长度变异,并可估计其扩张长度,将其应用于一项基于全外显子组测序的运动神经元疾病临床研究中,成功地鉴定出致病的短串联重复序列长度扩张.该方法首次原创性地利用测序读长覆盖深度特征来解决短串联重复序列变异检测问题,在人类遗传疾病研究中具有广泛的应用价值,并且对于其他二代测序分析方法的开发具有启发性意义.     

降香黄檀的DNA条形码鉴定研究

DNA条形码技术是利用基因组中一段短的标准序列进行物种的鉴定并探索其亲缘进化关系。本研究对采自海南不同地区降香黄檀五个居群24份样品的psbA-trnH,rbcL,核ITS及ITS2序列进行PCR扩增和测序,比较各序列扩增和测序效率。种间和种内变异,采用BLAST1和邻接 (NJ) 法构建系统聚类树方法评价不同序列的鉴定能力。结果表明ITS2在所研究的材料中具有最高的扩增和测序效率,而ITS扩增效率较低。ITS2完整序列在区分黄檀属不同种间差异具有较大优势。因此可利用ITS2从分子水平区分降香黄檀与其他混伪种。     

PCR产物直接测序还是克隆测序?——密叶杉属rDNA ITS序列的测定方法

通过PCR产物直接测序和克隆测序对三种密叶杉属 (Athrotaxis)植物rDNA内转录间隔区 (ITS)及5 .8SrDNA序列进行了测定与分析。实验表明A .selaginoidesrDNA重复序列间的纯合程度很高 ,对PCR产物直接测序就可以测定其ITS区序列。而A .laxifolia、A .cupressoides的ITS1重复序列间的纯合程度较低 ,各重复单位间序列存在插入 /缺失 ,只有对PCR产物进行克隆测序才能确定其序列。A .laxi folia、A .cupressoides的ITS2区尽管也存在多态性 ,但不同重复序列的浓度比较平均 ,对PCR产物直接测序就可确定重复序列间的变异情况。本实验表明尽管是同一属的三种植物 ,但其rDNA重复序列间的纯合程度不同 ,同一植物ITS的不同区域 ,其重复序列间的纯合程度也不同 ,针对不同的ITS片段可采用不同的方法以测定其序列。     

PCR产物直接测序还是克隆测序 密叶杉属rDNA ITS序列的测定方法

通过PCR产物直接测序和克隆测序对三种密叶杉属（Athrotaxis）植物rDNA内转录间隔区(ITS)及5.8 S rDNA序列进行了测定与分析。实验表明A. selaginoides rDNA重复序列间的纯合程度很高, 对PCR产物直接测序就可以测定其ITS区序列。而A. laxifolia、A. cupressoides的ITS1重复序列间的纯合程度较低,各重复单位间序列存在插入/缺失,只有对PCR产物进行克隆测序才能确定其序列。A. laxifolia、A. cupressoides的ITS2区尽管也存在 多态性,但不同重复序列的浓度比较平均,对PCR产物直接测序就可确定重复序列间的变异情况。本实验表明尽管是同一属的三种植物,但其rDNA重复序列间的纯合程度不同,同一植物ITS的不同区域,其重复序列间的纯合程度也不同,针对不同的ITS片段可采用不同的方法以测定其序列。     

金针菇rDNA序列结构特征分析

rDNA序列中的ITS作为DNA barcoding广泛应用于真菌的系统发育与物种辅助鉴定,IGS被认为可以用于种内水平不同菌株的鉴别。食用菌中还没有完整的rDNA序列的报道。本研究采用二代和三代测序技术分别对金针菇单核菌株“6-3”进行测序,用二代测序的数据对三代测序组装得到的基因组序列进行修正,得到一个在基因完整性、连续性和准确性均较好的基因组序列,对比Fibroporia vaillantii rDNA序列,获得金针菇完整的rDNA序列。金针菇rDNA序列结构分析表明,它有8个rDNA转录单元,长度均为5 903bp,有9个基因间隔区,其长度有较大差异,3 909-4 566bp。rDNA转录单元中,各元件的序列长度分别为：18S rDNA 1 796bp、ITS1 234bp、5.8S rDNA 173bp、ITS2 291bp、28S rDNA 3 410bp。基因间间隔区中,IGS1 1 351-1 399bp、5S rDNA 124bp、IGS2 2 435-3 092bp。金针菇的5S、5.8S、18S、28S rDNA序列准确性得到转录组数据的验证,也得到系统发育分析结果的支持。多序列比对发现,不同拷贝的基因间间隔区序列（IGS1和IGS2）存在丰富的多态性,多态性来源于SNP、InDel和TRS（串联重复序列）,而TRS来源于重复单元的类型和数量。9个基因间间隔区之间,IGS1只有少量的SNP和InDel,IGS2不仅有SNP和InDel,还有TRS。本研究结果提示,在应用IGS进行种内水平不同菌株之间的鉴别时,需要选取不同拷贝之间的保守IGS序列。     

山葡萄种质资源DNA条形码通用序列的筛选

对山葡萄(Vitis amurensis)种质资源样品的ITS、ITS2、psb A-trn H、rbc L和mat K序列进行PCR扩增及测序,优化PCR反应的退火温度,比较各序列的扩增效率、测序成功率、品种间和品种内的差异及barcoding gap图,使用BLAST和NJ树法比较不同序列的鉴定能力,最终从5条DNA片段中筛选出可用于山葡萄种质资源鉴定的DNA条形码通用序列。结果表明,在采集的11份33个山葡萄样品中,psb A-trn H和ITS2序列的扩增与测序成功率较高,其品种间、品种内差异及barcoding gap较ITS、rbc L和mat K序列具有明显的优势,且ITS2序列能够鉴别psb A-trn H序列无法鉴别的品种。实验证明,ITS2和psb A-trn H序列是较适合鉴别山葡萄资源的DNA条形码序列组合。DNA条形码弥补了形态学鉴定的不足,可为山葡萄种质资源的准确鉴定提供科学依据。     

天麻ITS序列分析及变异类型鉴定

目的:选取天麻3种变型有代表性的样品进行ITS序列(DNA基因的内转录间隔区宇列)测序分析,从分子水平对天麻不同变异类型亲缘关系作出鉴定.方法:采用改进CTAB法提取天麻DNA,利用合成的特异引物对其DNA中ITS区进行扩增、克隆,对目的片段测序分析.结果:黄天麻和绿天麻首先构成两个姊妹群,它们的遗传距离约为25,乌天麻与它们的遗传距离约为50,而且它们之间的遗传距离都达到了100%的置信度.其中ITS1的209个碱基中仅仅有15个位点的差异,相同碱基数目达到92.8%,这15个变异位点可作为天麻变型间的特异性鉴定.结论:表明ITS区序列分析可作为鉴定天麻不同变异类型的一种新方法.     

两种混合样品策略对揭示杜鹃花根部真菌多样性的影响

由于土壤微生物群落物种组成的高度空间异质性,混合样品(sample pooling)被广泛应用于微生物多样性与群落结构研究。在根部真菌的分子检测中,样品混合策略以及测序的克隆数或序列数均对揭示真菌群落结构的准确性有影响。【目的】为建立一套能快速准确地反映杜鹃花属植物根部真菌的物种组成与群落结构的分子检测技术平台,【方法】本研究采集锈红杜鹃和亮鳞杜鹃多份根系样品分别提取DNA,比较PCR扩增前和扩增后混合策略构建的克隆文库中真菌物种组成的差异。【结果】在2种宿主植物根系中,多份样品在PCR扩增后混合构建的克隆文库检测到的根部真菌物种丰富度、真菌群落的Shannon-Wiener多样性指数均高于扩增前混合的克隆文库。高频度的根部真菌在2种克隆文库中均检测到,但低频度的真菌物种组成在2种克隆文库中完全不同。更重要的是,当采用广泛应用的真菌通用引物ITS1f和ITS4扩增根部真菌ITS序列时,PCR扩增后混合的方法能有效地减轻杜鹃花属植物ITS序列被优先扩增的现象。真菌物种累积曲线显示,当测序的真菌ITS片段克隆数达到50个左右,即能较全面地反映2种杜鹃花根部真菌物种组成。【结论】独立扩增多份根系样品DNA,再将PCR产物混合构建克隆文库的方法能更全面地揭示杜鹃花属植物根部真菌物种丰富度与物种组成。     

基于形态特征和ITS序列对7个鹅膏菌属菌株的分类鉴定

以采自浙江省丽水地区的7个鹅膏菌属菌株作为研究材料,在基于形态特征进行初步鉴定的基础上,对7种鹅膏菌的rDNAITS区段进行克隆测序和序列特征比较分析。进一步对ITS序列进行核酸序列数据库GenBank同源性检索比对,将从GenBank检索获得的9个最相似物种的ITS序列连同7种鹅膏菌的ITS序列一起作系统发育分析。结果表明:基于ITS序列对f6、f9和f493个菌株的分子鉴定支持了基于形态特征的鉴定结果,对f5的分子鉴定不支持形态鉴定的结果,f8为鹅膏菌属内某种,f66为鹅膏菌属内某种,并与Amanitafulva,A.atrofusca,A.orientifulva3种鹅膏菌的亲缘关系较近,f7与另外6种鹅膏菌的亲缘关系相差甚远。研究结果提示基于分子水平上的ITS序列分析不能单方面作为大型真菌分类鉴定的可靠依据,可以作为基于传统形态学分类鉴定的辅助参考依据。     

苏铁珊瑚根共生念珠藻ITS序列多拷贝研究

目的:研究苏铁珊瑚根共生念珠藻16SrDNA-23SrDNA基因间隔序列(ITS)拷贝数。方法:提取苏铁珊瑚根共生念珠藻全DNA,PCR扩增其16SrDNA-23SrDNA基因间隔序列(ITS)克隆并测序;采用Cluster X 1.83对所得序列进行比对,用DNAman软件对比对结果进行人工校正;采用割胶回收电泳检测、菌液PCR及混合模板PCR扩增三种方法验证ITS-L2。结果:ITS-S(420 bp)不含任何氨基酸编码序列,ITS-L1(676 bp)包含一个异亮氨酸和一个丙氨酸编码序列;ITS-L1和ITS-L2在琼脂糖凝胶电泳检测时长度分别为676 bp和1000 bp,而谱带经克隆测序后结果表明ITS-L1和ITS-L2碱基序列和长度几乎相同,仅有两个碱基发生变异。结论:ITS-L2为假阳性,可能是由ITS-S和ITS-L1形成的异源双链;苏铁珊瑚根共生念珠藻含有两种类型的ITS拷贝,一种是含有tRNAIle和tRNAAla编码序列的ITS,另一种是不含tRNAIle和tRNAAla编码序列的ITS。     

锦葵科植物DNA条形码通用序列的筛选

对锦葵科植物样品的ITS、ITS2、rbcL、matK和psbA-trnH序列进行PCR扩增和测序, 比较各序列的扩增效率、测序成功率、种内和种间变异的差异以及barcoding gap图, 使用BLAST1和Nearest Distance方法评价不同序列的鉴定能力, 进而从这些候选序列中筛选出较适合锦葵科植物鉴别的DNA条形码序列。结果表明, ITS序列在采集的锦葵科植物11个种26个样品中的扩增成功率较高, 其种内、种间变异差异和barcoding gap较ITS2、psbA-trnH及rbcL序列具有更明显的优势, 且纳入60个属316个种共1 228个样品的网上数据后, 其鉴定成功率可达89.9%。psbA-trnH序列的扩增和测序成功率最高, 其鉴定成功率为63.2%, 并能鉴别一些ITS序列无法鉴别的种。实验结果表明, ITS和psbA-trnH是较适合鉴别锦葵科植物的DNA条形码序列组合。     

锦葵科植物DNA条形码通用序列的筛选

对锦葵科植物样品的ITS、ITS2、rbcL、matK和psbA-trnH序列进行PCR扩增和测序,比较各序列的扩增效率、测序成功率、种内和种间变异的差异以及barcoding gap图,使用BLAST1和Nearest Distance方法评价不同序列的鉴定能力,进而从这些候选序列中筛选出较适合锦葵科植物鉴别的DNA条形码序列。结果表明,ITS序列在采集的锦葵科植物11个种26个样品中的扩增成功率较高,其种内、种间变异差异和barcoding gap较ITS2、psbA-trnH及rbcL序列具有更明显的优势,且纳入60个属316个种共1228个样品的网上数据后,其鉴定成功率可达89.9%。psbA-trnH序列的扩增和测序成功率最高,其鉴定成功率为63.2%,并能鉴别一些ITS序列无法鉴别的种。实验结果表明,ITS和psbA-trnH是较适合鉴别锦葵科植物的DNA条形码序列组合。     

烟曲霉rRNA基因ITS区的克隆测序分析

对烟曲霉rRNA基因内转录间区(ITS区)进行了克隆测序,并将之与其他几种常见曲霉的相应序列进行了比较.发现3株烟曲霉的ITSⅠ区完全相同,而其中1株烟曲霉的ITSⅡ区与一条已知相应序列仅有2个碱基的变异.提示烟曲霉rRNA基因的两个ITS区序列均十分保守,而且与黄曲霉、黑曲霉、土曲霉及构巢曲霉的相应序列相比较,均有一定程度的变异.     

香蕉种质资源基于rDNA ITS序列的谱系分析

本研究以10份M.acuminata不同亚种材料,6份不同地理来源的M.balbisiana材料及20份不同基因型的香蕉栽培品种为试材,进行r DNA ITS(internal transcribed spacers)序列的测序分析。利用MEGA6.0软件计算不同序列间的碱基组成频率、简约信息位点数,以邻接法进行系统发育分析。结果表明,供试材料的ITS序列长度为583~594 bp,含有169个简约信息位点。基于ITS序列的聚类分析表明,M.acuminata和M.balbisiana的品种间能相互集中分布,形成明显的两支,且具有强的支持率。M.acuminata subsp.errans,M.acuminta var.chinensis和来自斯里兰卡的M.balbisiana具有明显的遗传差异,应加强对上述材料的收集、鉴定和保护,从而为加大香蕉栽培品种的遗传基础,提高香蕉栽培品种的抗逆性提供更多的可能性。